雙酚A 對(duì)子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干/基質(zhì)細(xì)胞干性的影響及人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源性上清對(duì)細(xì)胞損傷的改善作用

［摘 要］ 目的：探討雙酚A（BPA）對(duì)子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干/基質(zhì)細(xì)胞（eMSCs）增殖活性和干性特征的影響，闡明人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源性上清（hUCMSC-Sup）對(duì)細(xì)胞損傷的改善作用。方法：體外培養(yǎng)eMSCs，以0、200、250、300、350、400 μmol·L－1 BPA 處理。將eMSCs 分為對(duì)照組（僅培養(yǎng)液培養(yǎng)）、BPA 組（含200 μmol·L－1 BPA 的等體積培養(yǎng)液培養(yǎng)）、BPA+hUCMSC-Sup 組（含200 μmol·L－1 BPA 及50% 體積比hUCMSC-Sup 的等體積培養(yǎng)液培養(yǎng)） 和BPA+CHIR-99021 組（含200 μmol·L－1 BPA 及10 μmol·L－1 CHIR-99021 的等體積培養(yǎng)液培養(yǎng)），使用干細(xì)胞成球培養(yǎng)液培養(yǎng)eMSCs 干細(xì)胞球，其余細(xì)胞均使用DMEM/F12 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。噻唑藍(lán)（MTT） 法檢測各組eMSCs 存活率，球體形成實(shí)驗(yàn)檢測各組eMSCs干細(xì)胞球數(shù)和直徑，CCK-8法檢測各組eMSCs干細(xì)胞球中細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組eMSCs中CD73+細(xì)胞百分率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測各組eMSCs中性別決定區(qū)Y框蛋白2（Sox2）、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4 （Oct4） 和Nanog mRNA 表達(dá)水平，Western blotting 法檢測各組eMSCs中β-連環(huán)蛋白（β-catenin）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：MTT法檢測，BPA作用24和48 h，與0 μmo·l L－1 BPA 組比較，200、250、300、350 和400 μmol·L－1 BPA 組eMSCs 存活率均明顯降低（Plt;0. 01）。藥物作用24 h時(shí)，與對(duì)照組比較，BPA組eMSCs存活率明顯降低（Plt;0. 01）；藥物作用48 h時(shí)，與對(duì)照組比較，BPA 組eMSCs 存活率明顯降低（Plt;0. 01）；與BPA 組比較，BPA+hUCMSC-Sup 組eMSCs 存活率明顯升高（Plt;0. 05）。球體形成實(shí)驗(yàn)檢測，與培養(yǎng)3 d 組比較，培養(yǎng)4 和5 d 組eMSCs 干細(xì)胞球數(shù)和直徑均明顯增加（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）；與對(duì)照組比較，培養(yǎng)48 h 時(shí)BPA 組eMSCs 干細(xì)胞球數(shù)和直徑均明顯減少（Plt;0. 05或Plt;0. 01）。CCK-8法檢測，處理24和48 h時(shí)，與對(duì)照組比較，BPA 組eMSCs 干細(xì)胞球中細(xì)胞增殖活性均明顯降低（Plt;0. 01）；與BPA組比較，BPA+hUCMSC-Sup組eMSCs干細(xì)胞球中細(xì)胞增殖活性均明顯升高（Plt;0. 01）。流式細(xì)胞術(shù)檢測，與對(duì)照組比較，BPA 組eMSCs中CD73+細(xì)胞百分率明顯降低（Plt;0. 01）；與BPA 組比較，BPA+hUCMSC-Sup組eMSCs中CD73+細(xì)胞百分率明顯升高（Plt;0. 01）。RT-qPCR法檢測，與對(duì)照組比較，BPA組eMSCs中Sox2、Oct4和Nanog mRNA表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 01）；與BPA 組比較，BPA+hUCMSC-Sup組和BPA+CHIR-99021組eMSCs中Sox2、Oct4及NanogmRNA 表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01）。Western blotting 法檢測，與對(duì)照組比較，BPA 組eMSCs 中β-catenin 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）；與BPA 組比較，BPA+hUCMSC-Sup 組和BPA+CHIR-99021 組 eMSCs 中 β -catenin蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01）。結(jié)論：BPA能夠抑制eMSCs的干性特征，損傷子宮內(nèi)膜的自我更新及修復(fù)作用，其機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞中Wnt/β-catenin 信號(hào)通路活性有關(guān)。hUCMSC-Sup 可以促進(jìn)受損eMSCs 的增殖，并對(duì)BPA 誘導(dǎo)的eMSCs 干性損傷起到改善作用。

［關(guān)鍵詞］ 雙酚A； 子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干/基質(zhì)細(xì)胞； 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞； 干細(xì)胞球

［中圖分類號(hào)］ Q254 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干/基質(zhì)細(xì)胞（endometrialmesenchymal stem/stromal cells， eMSCs） 具有多向分化和高增殖的潛能，受激素嚴(yán)格調(diào)控，在子宮內(nèi)膜周期性再生中發(fā)揮重要作用［1］。eMSCs 受損后會(huì)發(fā)生子宮內(nèi)膜功能障礙，最終導(dǎo)致胚胎著床失敗和早期流產(chǎn)，是女性不孕的主要原因之一［2］。當(dāng)eMSCs 聚集成三維球狀體時(shí)， 其整體功能增強(qiáng)，如參與組織再生的關(guān)鍵因子血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 和前列腺素E2 （prostaglandin E2，PGE2） 分泌增加，多能基因Nanog 和性別決定區(qū)Y 框蛋白2 （sex determiningregion Y-box 2，Sox2） mRNA 表達(dá)上調(diào)［3］。

雙酚A （bisphenol A，BPA） 的結(jié)構(gòu)與雌激素類似，可與雌激素受體或其他激素受體結(jié)合干擾細(xì)胞的正常生理進(jìn)程， 是最常見的內(nèi)分泌干擾物（endocrine disrupting chemicals，EDCs）［4］。研究［5］顯示： BPA 暴露與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)， 包括生育能力受損、乳腺癌、糖尿病、肥胖、認(rèn)知障礙和心血管疾病。HARNETT 等［6］ 發(fā)現(xiàn)：BPA 及其類似物對(duì)大鼠和人類干細(xì)胞有細(xì)胞毒性并能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前， BPA 對(duì)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的影響尚未完全闡明。WANG 等［7］ 研究表明：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymalstem cells，hUCMSCs） 與受損的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞（human endometrial stromal cells，hEndoSCs）在體外共培養(yǎng)后，受損的hEndoSCs 增殖率明顯升高。本研究以BPA 作用eMSCs， 探討B(tài)PA 對(duì)eMSCs 干性的影響， 闡明hUCMSCs 源性上清（hUCMSC-derived supernatunt， hUCMSC-Sup）對(duì)細(xì)胞損傷的改善作用。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 eMSCs和hUCMSCs為吉林省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室傳代保存。BPA （貨號(hào)：#K2116009） 購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CCK-8 試劑盒（貨號(hào)：C0039） 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（貨號(hào)：SH30023. 01） 購自美國HyClone 公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） （貨號(hào)： FB15015）購自美國Clark 生物公司，磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffer saline，PBS）（ 貨號(hào)：FG701-01）、1% 青-鏈霉素（ 貨號(hào)：FG101）、含EDTA的胰蛋白酶（貨號(hào)：#FG301-01）、RNA 提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，選擇性糖原合酶激酶3 （glucogen synthase kinase-3， GSK-3）抑制劑CHIR-99021 購自美國MCE 公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 反應(yīng)體系SYBR Green 試劑盒購自美國Bio-Rad 公司，RT-qPCR 引物序列由蘇州金唯智生物科技公司合成， β 連環(huán)蛋白（β -catenin） 抗體（貨號(hào)：#8480S） 購自美國Cell Signaling Technology公司，CD73 抗體（貨號(hào)：#560847） 購自美國BD公司。電泳儀購自美國Wealtec 公司，酶標(biāo)儀購自美國Thermo 公司，流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司，CO2 恒溫培養(yǎng)箱購自美國賽默飛世爾科技公司，倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司， RT-qPCR儀購自美國Applied Biosystems 公司。

1. 2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和處理 采用含 10% FBS和1% 青-鏈霉素的DME/F12 完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)eMSCs，采用含EDTA 的胰蛋白酶消化傳代。培養(yǎng)P3～P5 代hUCMSCs， 收集細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期培養(yǎng)液，3 000 g 離心15 min，清除細(xì)胞和細(xì)胞碎片， 制備為hUCMSC-Sup， 分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆谩２缓宓腄MEM/F12 培養(yǎng)基中添加10 μg·L-1 EGF、10 μg·L-1 bFGF 和2% B27 （50×），配制干細(xì)胞成球培養(yǎng)液。將eMSCs分為對(duì)照組（僅培養(yǎng)液培養(yǎng)）、BPA 組（含200 μmol·L－1 BPA 的等體積培養(yǎng)液培養(yǎng)）、BPA+hUCMSC-Sup 組（含200 μmol·L-1 BPA 及50% 體積比hUCMSC-Sup 的等體積培養(yǎng)液培養(yǎng)）和BPA+CHIR-99021 組（含200 μmol·L-1 BPA 及10 μmol·L-1 CHIR-99021 的等體積培養(yǎng)液培養(yǎng)），使用干細(xì)胞成球培養(yǎng)液培養(yǎng)eMSCs 干細(xì)胞球， 其余細(xì)胞均使用DMEM/F12 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1. 3 噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測不同濃度BPA組eMSCs存活率 取對(duì)數(shù)生長期的eMSCs， 以每孔1×104 個(gè)細(xì)胞的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至約70% 后，分別加入0、 200、 250、 300、 350 和400 μmol·L－1 BPA。并于加藥處理后的24 和48 h， 每孔加入10 μLMTT 試劑， 4 h 后采用酶標(biāo)儀檢測波長492 nm 處吸光度（A） 值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)孔A 值－空白孔A 值） / （對(duì)照孔A 值－空白孔A 值） ×100%。單層培養(yǎng)細(xì)胞存活率檢測：球體形成實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)1 周后收集細(xì)胞球，吹打分散為單細(xì)胞懸浮液后再次接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至約70%后，分別加入培養(yǎng)液（對(duì)照組）、含BPA 的培養(yǎng)液（BPA 組） 和含BPA 及hUCMSC-Sup 的培養(yǎng)液（BPA+hUCMSC-Sup 組）， 于加藥處理后24 和48 h 每孔加入10 μL MTT 試劑，4 h 后采用酶標(biāo)儀檢測波長492 nm 處A 值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率= （實(shí)驗(yàn)孔A 值－ 空白孔A 值） / （對(duì)照孔A 值－空白孔A 值） ×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4 次。

1. 4 球體形成實(shí)驗(yàn)檢測各組eMSCs干細(xì)胞球體形態(tài)表現(xiàn) eMSCs經(jīng)胰酶消化后懸浮于干細(xì)胞成球培養(yǎng)液中，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于低黏附6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)5 d，于培養(yǎng)第3、4 和5 天拍照并記錄eMSCs 干細(xì)胞球數(shù)和直徑變化。干細(xì)胞球培養(yǎng)至3 d 時(shí)按上述eMSCs 干細(xì)胞球體分組處理，于加藥24 和48 h 后拍照并計(jì)數(shù)eMSCs 干細(xì)胞球數(shù)和直徑。采用Image J 軟件測量eMSCs 干細(xì)胞球直徑，球體直徑≥50 μm 則為1 個(gè)球體。

1. 5 CCK-8法檢測各組eMSCs干細(xì)胞球中細(xì)胞增殖活性 將 eMSCs以每孔 5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于低黏附24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 干細(xì)胞成球培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，按上述干細(xì)胞球體分組，于加藥處理后0、24 和48 h， 每孔加入100 μL CCK-8 試劑， 4 h后采用酶標(biāo)儀檢測波長450 nm 處A 值，以僅加入培養(yǎng)液的空白孔為對(duì)照孔調(diào)零。以A 值代表各組eMSCs 干細(xì)胞球中細(xì)胞增殖活性。

1. 6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組eMSCs中CD73+細(xì)胞百分率 將eMSCs接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，按照上述eMSCs 分組處理24 h 后， 加入APC-A 標(biāo)記的CD73 抗體，避光冰上孵育30 min 后PBS 緩沖液洗滌3 次。采用流式細(xì)胞儀和FlowJo 軟件檢測各組eMSCs 中CD73+細(xì)胞百分率。

1. 7 RT-qPCR 法檢測各組 eMSCs 中 Sox2、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子 4（octamer-binding transcriptionfactor 4，Oct4）和 Nanog mRNA 表 達(dá) 水 平 將eMSCs 鋪于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并按照上述細(xì)胞分組處理24 h 后，采用TRIzol 試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA， 以cDNA 作為模板， 使用SYBR Green qPCR Master Mix 進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增， 檢測各組細(xì)胞中Sox2、Oct4 和Nanog mRNA表達(dá)水平。引物序列： GAPDH F 5'-TCAGGCGTCTGTAGAGGCTT-3'， R 5'-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG-3'； Sox2 F 5'-GCCGAGTGGAAACTTTTGTCG-3'， R 5'-GCAGCGTGTACTTATCCTTCTT-3'； Oct4 F 5'-AAGCGATCAAGCAGCGACTA-3'， R 5'-CAGAGTGGTGACGGAGACAG-3'； Nanog F 5'-CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA-3'， R 5'-CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC-3'。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，循環(huán)40 次； 72 ℃ 終延10 min， 4 ℃ 保存。使用GAPDH 進(jìn)行歸一化處理， 采用2?ΔΔCt 法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。

1. 8 Western blotting 法 檢 測 各 組 eMSCs 中β-catenin 蛋白表達(dá)水平 將 eMSCs接種于 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 按照上述細(xì)胞分組處理24 h 后， 收集eMSCs 進(jìn)行裂解獲取蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5% 脫脂奶粉TBST 溶液室溫封閉1 h， 分別加入抗體β-catenin（1∶1 000） 和GAPDH （1∶1 000） 4 ℃孵育過夜。洗膜3 次， 加入HRP 標(biāo)記的抗小鼠或抗兔二抗（1∶2 000） 室溫孵育2 h，再次洗膜后加入ECL 發(fā)光檢測試劑使條帶顯像。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。目的蛋白表達(dá)水平= 目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 蛋白條帶灰度值。

1. 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 25. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組eMSCs 干細(xì)胞球數(shù)和直徑及細(xì)胞增殖活性，各組eMSCs 存活率和CD73+細(xì)胞百分率，各組eMSCs 中Sox2、Oct4 和Nanog mRNA表達(dá)水平及β-catenin 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以-x±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析， 組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 各組 eMSCs 存活率 BPA 作用 24 和 48 h，與0 μ mol·L －1 BPA 組比較， 200 、250 、350 和400 μmol·L－1 BPA 組eMSCs 存活率均明顯降低（Plt;0. 01）。見表1。藥物作用24 h 時(shí)， 與對(duì)照組比較， BPA 組eMSCs 存活率明顯降低（Plt;0. 01）； 與BPA 組比較， BPA+hUCMSC-Sup 組eMSCs 存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。藥物作用48 h 時(shí)，與對(duì)照組比較，BPA 組eMSCs 存活率明顯降低（Plt;0. 01）； 與BPA 組比較，BPA+hUCMSC-Sup 組eMSCs 存活率明顯升高（Plt;0. 05）。見表2。

2. 2 各組 eMSCs 干細(xì)胞球體形態(tài)表現(xiàn) 與培養(yǎng)3 d 組比較，培養(yǎng)4 和5 d 組eMSCs 干細(xì)胞球數(shù)和直徑均明顯增加（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見圖1 和表3。與對(duì)照組比較，培養(yǎng)24 h時(shí)BPA組eMSCs干細(xì)胞球數(shù)和直徑差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）， 培養(yǎng)48 h 時(shí)BPA 組eMSCs 干細(xì)胞球數(shù)和直徑均明顯減少（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見表4。

2. 3 各組 eMSCs 干細(xì)胞球中細(xì)胞增殖活性 處理0 h 時(shí)，各組eMSCs 干細(xì)胞球中細(xì)胞增殖活性比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。處理24 和48 h時(shí)，與對(duì)照組比較， BPA 組eMSCs 干細(xì)胞球中細(xì)胞增殖活性均明顯降低（Plt;0. 01）； 與BPA 組比較，BPA+hUCMSC-Sup 組eMSCs 干細(xì)胞球中細(xì)胞增殖活性均明顯升高（Plt;0. 01）。見表5。2. 4 各組 eMSCs中 CD73+細(xì)胞百分率 與對(duì)照組（98. 20%±0. 98%） 比較，BPA 組eMSCs 中CD73+細(xì)胞百分率（44. 63%±18. 66%） 明顯降低（Plt;0. 01）；與BPA組比較，BPA+hUCMSC-Sup組eMSCs 中CD73+細(xì)胞百分率（91. 53%±7. 38%）明顯升高（Plt;0. 01）。見圖2。

2. 5 各組 eMSCs 中 Sox2、Oct4 和 Nanog mRNA表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，BPA組eMSCs中Sox2、Oct4、Nanog mRNA 表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 01）； 與BPA 組比較， BPA+hUCMSC-Sup 組和BPA+CHIR-99021 組eMSCs 中Sox2、Oct4 及Nanog mRNA 表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01）。見表6。

2. 6 各組 eMSCs 中 β-catenin 蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組比較， BPA 組eMSCs 中β-catenin 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）；與BPA 組比較，BPA+hUCMSC-Sup 組和BPA+CHIR-99021 組eMSCs 中β-catenin 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01）。見圖3。

3 討 論

BPA 能夠提高塑料和合成產(chǎn)品的耐用性和柔韌性，被廣泛用于塑料食品、液體容器、金屬罐內(nèi)襯、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品包裝、運(yùn)動(dòng)器材及醫(yī)療和牙科設(shè)備中［8］。因此，人類日常接觸BPA 是不可避免的。研究［9-10］ 顯示： BPA 暴露增強(qiáng)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞侵襲能力，并通過WD 重復(fù)域蛋白5/甲基胞嘧啶雙加氧酶2 （WD repeat-containing protein 5/tet methylcytosine dioxygenase 2， WDR5/TET2）介導(dǎo)的表觀遺傳途徑上調(diào)子宮內(nèi)膜中雌激素受體β（estrogen receptor beta，Erβ） 表達(dá)，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展。CASERTA 等［11］ 發(fā)現(xiàn)：BPA 促進(jìn)核雌激素相關(guān)受體γ 易位，通過表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF） 依賴性和非EGF 依賴性途徑促進(jìn)Ⅰ 級(jí)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖。此外，長期接觸BPA 嚴(yán)重?fù)p害子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞向蛻膜細(xì)胞的分化，并會(huì)損害孕酮受體及其下游靶基因通路， 對(duì)胚胎著床和妊娠產(chǎn)生不利影響［12］。本研究結(jié)果顯示： BPA 對(duì)eMSCs 存活率有抑制作用。

子宮內(nèi)膜的再生能力與子宮內(nèi)膜干細(xì)胞存在密切關(guān)聯(lián)。研究［13-14］ 證實(shí)： 人類和部分動(dòng)物子宮內(nèi)膜中存在基質(zhì)干細(xì)胞。干細(xì)胞的“干性”包括自我更新能力和多向分化能力即多能性［15］。干細(xì)胞的特征是能夠在懸浮培養(yǎng)下形成球體，球體形成實(shí)驗(yàn)可檢測干細(xì)胞自我更新能力。WANG 等［16］ 證實(shí)：與體外單層髓核細(xì)胞比較，髓核細(xì)胞球體表現(xiàn)出優(yōu)秀的自我更新和細(xì)胞外基質(zhì)合成能力。本研究結(jié)果顯示：BPA 干預(yù)后eMSCs 干細(xì)胞球數(shù)和直徑明顯減少，細(xì)胞增殖活性明顯降低，提示BPA 能夠抑制eMSCs 干細(xì)胞活性。

Oct4、Sox2 和Nanog 等干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在維持胚胎干細(xì)胞的多能性和自我更新能力方面也發(fā)揮著重要作用［17］。KESHAVARZ 等［18］ 研究表明：敲低長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA） ES1 會(huì)下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中Oct4 和Sox2 的表達(dá)， 抑制ES1 可能會(huì)限制癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，BPA 組 eMSCs 中 Sox2、Oct4 和Nanog mRNA 表達(dá)水平明顯降低， eMSCs中CD73+細(xì)胞百分率明顯降低，提示BPA 可抑制eMSCs 的干性。

多種信號(hào)通路參與損傷后組織再生和發(fā)育，其中Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在維持各種干細(xì)胞類型的自我更新和分化調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。研究［19］顯示： Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在子宮內(nèi)膜干細(xì)胞群的調(diào)節(jié)中具有重要作用。DAVIDSON 等［20］ 證實(shí)： Wnt/β-catenin 信號(hào)的激活會(huì)促進(jìn)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)。LI 等［21］ 發(fā)現(xiàn)： 谷氨酰胺酶1（glutaminase 1，GLS1） 通過Wnt/β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞干性，敲除GLS1 可減少干性相關(guān)基因的表達(dá)并抑制體內(nèi)肝癌干細(xì)胞致瘤性。本研究結(jié)果顯示： BPA 可明顯降低eMSCs 中β-catenin 蛋白表達(dá)水平。提示BPA 可能是通過抑制Wnt/β-catenin通路激活， 降低eMSCs 的干性， 損傷子宮內(nèi)膜的周期性再生能力。

hUCMSCs 具有自我更新和多向分化的特性，可以修復(fù)受損組織， 被用于治療多種疾?。?2］。CHIR-99021 作為GSK-3 抑制劑，可以使GSK-3α/β失 活， 從 而 激 活 Wnt/β -catenin 通 路。GOVARTHANAN 等［23］ 發(fā)現(xiàn)： CHIR-99021 處理后， 間充質(zhì)干細(xì)胞（ mesenchymal stem cells， MSCs）中β-catenin 的核定位增加且MSCs 的分化潛力提高。本研究結(jié)果顯示： hUCMSC-Sup 可顯著增強(qiáng)被BPA 抑制的eMSCs 干細(xì)胞球中細(xì)胞增殖活性，上調(diào)CD73+ 細(xì)胞百分率。eMSCs 中干性相關(guān)因子Sox2、Oct4 和Nanog mRNA 表達(dá)水平及β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯升高， 與CHIR-99021 處理結(jié)果相似。提示hUCMSC-Sup 具有改善eMSCs 干性的能力，可能與Wnt/β-catenin 通路激活有關(guān)。

綜上所述，BPA 能夠抑制eMSCs 的干性特征，損傷子宮內(nèi)膜的自我更新及修復(fù)作用，其機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞中Wnt/β -catenin 信號(hào)通路活性有關(guān)。hUCMSC-Sup 可以促進(jìn)受損eMSCs 的增殖，并對(duì)BPA 誘導(dǎo)的eMSCs 干性損傷起到改善作用。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王愛喬參與研究設(shè)計(jì)和論文撰寫，王琳、張文琦和鄧玲參與研究數(shù)據(jù)獲取及分析，劉磊、林秀英和付建華參與論文修改及審校，米旭光和方艷秋參與研究設(shè)計(jì)。

[參考文獻(xiàn)]

［1］ BOZORGMEHR M， GURUNG S， DARZI S， et al.

Endometrial and menstrual blood mesenchymal stem/

stromal cells： biological properties and clinical

application［J］. Front Cell Dev Biol， 2020， 8： 497.

［2］ SKLIUT? G， BAU?YT? R， BORUTINSKAIT? V，

et al. Menstrual blood-derived endometrial stem cells’

impact for the treatment perspective of female

infertility［J］. Int J Mol Sci， 2021， 22（13）： 6774.

［3］ DOMNINA A， NOVIKOVA P， OBIDINA J， et al.

Human mesenchymal stem cells in spheroids improve

fertility in model animals with damaged endometrium［J］.

Stem Cell Res Ther， 2018， 9（1）： 50.

［4］ STREET M E， ANGELINI S， BERNASCONI S，

et al. Current knowledge on endocrine disrupting

chemicals （EDCs） from animal biology to humans， from

pregnancy to adulthood： highlights from a national

Italian meeting［J］. Int J Mol Sci， 2018， 19（6）： 1647.

［5］ KODILA A， FRANKO N， SOLLNER DOLENC M.

A review on immunomodulatory effects of BPA

analogues［J］. Arch Toxicol， 2023， 97（7）： 1831-1846.

［6］ HARNETT K G， CHIN A， SCHUH S M. BPA and

BPA alternatives BPS， BPAF， and TMBPF， induce

cytotoxicity and apoptosis in rat and human stem

cells［J］. Ecotoxicol Environ Saf， 2021， 216： 112210.

［7］ WANG J Y， HU R M， XING Q， et al. Exosomes

derived from umbilical cord mesenchymal stem cells

alleviate mifepristone-induced human endometrial

stromal cell injury［J］. Stem Cells Int， 2020， 2020：

6091269.

［8］ RUSSO G， BARBATO F， MITA D G， et al.

Occurrence of bisphenol A and its analogues in some

foodstuff marketed in Europe［J］. Food Chem Toxicol，

2019， 131： 110575.

［9］ WEN X， XIONG Y， JIN L， et al. Bisphenol A

exposure enhances endometrial stromal cell invasion and

has a positive association with peritoneal

endometriosis［J］. Reprod Sci， 2020， 27（2）： 704-712.

［10］WEN X， XIONG Y， GENG T， et al. BPA modulates

the WDR5/TET2 complex to regulate ERβ expression

in eutopic endometrium and drives the development of

endometriosis［J］. Environ Pollut， 2021， 268（Pt B）：

115748.

［11］CASERTA D， DE MARCO M P， BESHARAT A R，

et al. Endocrine disruptors and endometrial cancer：

molecular mechanisms of action and clinical

implications， a systematic review［J］. Int J Mol Sci，

2022， 23（6）： 2956.

［12］CASERTA D， COSTANZI F， DE MARCO M P，

et al. Effects of endocrine-disrupting chemicals on

endometrial receptivity and embryo implantation： a

systematic review of 34 mouse model studies［J］. Int J

Environ Res Public Health， 2021， 18（13）： 6840.

［13］BUKOWSKA J， ZIECIK A J， LAGUNA J， et al. The

importance of the canonical Wnt signaling pathway in the

porcine endometrial stromal stem/progenitor cells：

implications for regeneration［J］. Stem Cells Dev， 2015，

24（24）： 2873-2885.

［14］BAUSYTE R， VAIGAUSKAITE-MAZEIKIENE B，

BORUTINSKAITE V， et al. Human endometriumderived

mesenchymal stem/stromal cells application in

endometrial-factor induced infertility［J］. Front Cell Dev

Biol， 2023， 11： 1227487.

［15］PHAN T N， FAN C H， YEH C K. Application of

ultrasound to enhancing stem cells associated

therapies［J］. Stem Cell Rev Rep， 2023， 19（6）：

1709-1725.

［16］WANG Y Y， WANG H M， ZHUO Y Y， et al.

Spheroid formation enhances the regenerative capacity of

nucleus pulposus cells via regulating N-CDH and ITGβ1

interaction［J］. Int J Biol Sci， 2022， 18（9）： 3676-3696.

［17］SOHN E J， MOON H J， LIM J K， et al. Regulation of

the protein stability and transcriptional activity of OCT4

in stem cells［J］. Adv Biol Regul， 2021， 79： 100777.

［18］KESHAVARZ M， ASADI M H. Long non-coding

RNA ES1 controls the proliferation of breast cancer cells

by regulating the Oct4/Sox2/miR-302 axis［J］. FEBS J，

2019， 286（13）： 2611-2623.

［19］NGUYEN H P T， SPRUNG C N， GARGETT C E.

Differential expression of Wnt signaling molecules

between pre- and postmenopausal endometrial epithelial

cells suggests a population of putative epithelial stem/

progenitor cells reside in the basalis layer ［J］.

Endocrinology， 2012， 153（6）： 2870-2883.

［20］DAVIDSON K C， ADAMS A M， GOODSON J M，

et al. Wnt/β -catenin signaling promotes differentiation，

not self-renewal， of human embryonic stem cells and is

repressed by Oct4［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2012，

109（12）： 4485-4490.

［21］LI B H， CAO Y J， MENG G， et al. Targeting

glutaminase 1 attenuates stemness properties in

hepatocellular carcinoma by increasing reactive oxygen

species and suppressing Wnt/beta-catenin pathway［J］.

EBioMedicine， 2019， 39： 239-254.

［22］XIE Q X， LIU R， JIANG J， et al. What is the impact of

human umbilical cord mesenchymal stem cell

transplantation on clinical treatment？［J］. Stem Cell Res

Ther， 2020， 11（1）： 519.

［23］GOVARTHANAN K， VIDYASEKAR P， GUPTA P K，

et al. Glycogen synthase kinase 3β inhibitor- CHIR

99021 augments the differentiation potential of

mesenchymal stem cells［J］. Cytotherapy， 2020， 22（2）：

91-105.