3D 打印PLA/PTMC-Ca?(PO?)?復(fù)合支架制備及其對兔骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響

［摘 要］ 目的：探討通過 3D 打印技術(shù)制備的聚乳酸 （PLA）/聚三亞甲基碳酸酯 （PTMC） 和PLA/PTMC-磷酸三鈣［Ca? （PO?） ?］ 復(fù)合多孔支架對兔骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs） 的影響，闡明其在骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用價值。方法：混合材料后使用桌面擠絲機制備 PLA/PTMC 和 PLA/PTMC-Ca（? PO?）? 線材，使用CATIA V5-6R2019建模軟件設(shè)計支架，并使用CreatBot F430 3D打印機進行支架制作。紅外光譜檢測PLA/PTMC-Ca?（PO?）? 支架化學(xué)結(jié)構(gòu)，體外降解實驗檢測2 種支架降解失重率和pH 值，角接觸測量儀檢測2 種支架親水性。取3 只出生2～5 d 的白色新西蘭乳兔，提取BMSCs，CCK-8 法檢測2 種支架共培養(yǎng)細胞增殖活性，茜素紅染色觀察2 種支架共培養(yǎng)細胞成骨分化情況。結(jié)果：紅外光譜檢測證實成功制備出含有PLA、PTMC和β-Ca（? PO?）? 3種物質(zhì)的復(fù)合支架。降解6～14 周，與PLA/PTMC 支架比較，PLA/PTMC-Ca?（PO?）? 支架在脂肪酶溶液和磷酸鹽緩沖液（PBS） 中的降解速率均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）；降解8～14 周，與PLA/PTMC 支架比較，PLA/PTMC-Ca（? PO?）? 支架在脂肪酶溶液中的pH值明顯升高（Plt;0. 01）。與PLA/PTMC支架比較，PLA/PTMC-Ca? （PO?）? 支架接觸角明顯減?。≒lt;0. 01）。細胞共培養(yǎng)第5 和7 天時，與PLA/PTMC支架比較，PLA/PTMC-Ca（? PO?）?支架共培養(yǎng)細胞增殖活性均明顯升高（Plt;0. 05或Plt;0. 01）。共培養(yǎng)21 d 后，2 種支架與BMSCs 重疊生長，局部均形成鈣化結(jié)節(jié)，茜素紅將其局部染成橘紅色；與PLA/PTMC 支架比較，PLA/PTMC-Ca?（PO?）? 支架共培養(yǎng)細胞礦化鈣結(jié)節(jié)數(shù)量增多，密度增大，顏色加深。結(jié)論：通過3D打印技術(shù)成功制備出含有PLA、PTMC和β-Ca（? PO?）? 的PLA/PTMC-Ca（? PO?）?復(fù)合多孔支架，其降解性能良好，在生物相容性、親水性和成骨誘導(dǎo)性等方面均表現(xiàn)出優(yōu)勢，是一種性能優(yōu)良的骨缺損修復(fù)材料。

［關(guān)鍵詞］ 骨缺損； 骨再生； 3D 打??； 聚乳酸； 聚三亞甲基碳酸酯

［中圖分類號］ R331 ［文獻標志碼］ A

骨缺損多由高能量損傷，如車禍和高空墜落等引起，因治療周期長、療效欠佳且花費巨大，給患者造成巨大痛苦和經(jīng)濟壓力，也是臨床可能面對的難題。自體骨移植具有植骨區(qū)吸收且供區(qū)骨量不足的缺點，同時存在供區(qū)受創(chuàng)、疼痛、感染、感覺異常和神經(jīng)功能受損等弊端［1-3］。異體骨移植可提供的骨量較大， 但經(jīng)滅活后仍然存在免疫排斥的可能，目前應(yīng)用較多的磷酸鈣骨水泥雖具有良好的生物相容性且有利于促進成骨，但骨水泥內(nèi)部缺乏孔隙結(jié)構(gòu)，不利于骨組織長入。傳統(tǒng)制備骨缺損支架的方法存在氣泡大小與支架孔隙之間的連接難控制和材料力學(xué)性能差等缺點，而3D 打印技術(shù)在一定程度上克服了這一系列問題，使得精確調(diào)控骨缺損修復(fù)材料的孔隙成為可能［4-5］。聚乳酸（polylacticacid，PLA） 是以有機酸乳酸為原料聚合并通過酯鍵連接的新型聚酯材料，可以在自然環(huán)境中被完全分解為CO2和水，具有優(yōu)異的生物降解性能和良好的力學(xué)性能［6］。目前PLA 已經(jīng)成為生物醫(yī)藥制造領(lǐng)域中重要的高分子材料，可提高藥物效果，促進組織修復(fù)和輔助醫(yī)學(xué)縫合［7］。聚三亞甲基碳酸酯（poly trimethylene carbonate，PTMC） 是一種質(zhì)地柔韌且生物相容性良好的聚合物，可以在體內(nèi)通過表面侵蝕作用降解，而不會形成酸性化合物，因此可以避免因材料周圍pH 值過低導(dǎo)致的自動加速降解，并且可避免材料周圍產(chǎn)生無菌性炎癥，且具有良好的可塑性，已被應(yīng)用于外科手術(shù)和組織工程等醫(yī)療領(lǐng)域［8-9］。磷酸鈣是骨骼的重要組成元素，與機體具有良好的生物相容性， 被證實具有成骨誘導(dǎo)活性，可作為很好的人工骨支架材料［10-12］。研究［13-15］顯示： PLA-PTMC 聚合物具有良好的降解性能，使用負載神經(jīng)膠質(zhì)細胞生長因子PLA-PTMC 導(dǎo)管對大鼠脊髓損傷修復(fù)有良好的神經(jīng)再生效果。PLA-PTMC 共混膜可以防止術(shù)后粘連，PLA-PTMC 共混物除對止血具有積極作用和無致敏原性［16］， 還可以作為醫(yī)用膠粘劑有效預(yù)防感染［17］。目前研究［10-17］大多以PLA、 PTMC 和磷酸三鈣［Ca?（PO?）?］中的1 種或2 種作為研究對象，尚缺乏骨缺損修復(fù)應(yīng)用方面的研究。本研究以PLA 和PTMC 為基礎(chǔ)材料，采用3D 打印技術(shù)制備PLA/PTMC 和PLA/PTMCCa?（PO?）? 多孔隙支架，評價其降解性能、力學(xué)性能和力學(xué)強度等指標，并開展體外實驗檢測支架相關(guān)生物性能，為3D 打印PLA/PTMC-Ca?（PO?）? 復(fù)合多孔支架體內(nèi)研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物、主要試劑和儀器 新西蘭白色乳兔3 只，2～5 d 齡，雌雄不限，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK- （吉）2008-0005。PLA 和PTMC （山東濟南岱罡生物科技有限公司），β-Ca3 （PO?）? （昆山華僑科技新材料有限公司），1，4-二惡烷（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），CCK-8 試劑盒（BA00208，北京博奧森生物技術(shù)有限公司），成骨細胞礦化結(jié)節(jié)染色試劑盒茜素紅（C0148S， 上海碧云天生物技術(shù)有限公司），DMEM 低糖培養(yǎng)基（C11885500BT，美國賽默飛公司）。桌面擠絲機（型號：Wellzoom-E，深圳米斯達科技有限公司）， 3D 打印機（型號：CreatBot F430，河南速維電子科技有限公司），標準型角接觸測量儀（型號：SDC100，東莞鼎盛精密儀器有限公司），傅里葉變換紅外光譜儀（型號：Nicolet 6700，無錫哈斯德瑞科技有限公司）。

1. 2 PLA/PTMC-Ca（? PO?）?復(fù)合多孔支架的制備 將PTMC 剪成碎片，與PLA 顆粒按照質(zhì)量比1∶1混合后，將混合顆粒溶解于1，4-二惡烷（W/V=1 g·10 mL－1） 中，用40 ℃恒溫磁性攪拌器磁攪拌2 h，分成2 份備用。取50%PLA 質(zhì)量的β-Ca3 （PO?）?粉末，加入1 份PLA-PTMC/1，4-二惡烷溶液中，攪拌至完全混合。采用40 ℃超聲波清洗機超聲分散溶液30 min，將PLA/PTMC-Ca3 （PO?）?/1，4-二惡烷溶液磁力攪拌15 min，倒入不銹鋼托盤，并置于通風(fēng)柜中蒸發(fā)溶劑。干燥后的薄膜被切成約3 mm×3 mm 的碎塊，置于電熱恒溫干燥箱中干燥24 h。將脫水的碎塊送入桌面擠絲機料斗中分別生產(chǎn)PLA/PTMC 和PLA/PTMC-Ca3（PO ?）? 絲線。設(shè)置預(yù)熱段溫度保持于180 ℃，擠壓段溫度設(shè)置為175 ℃。棄去頭部渾濁的線材，經(jīng)過水冷設(shè)備冷卻得到透明的PLA/PTMC 混合材料，最終制作出適合FDM 打印機的直徑為（1. 75±0. 10） mm 的線材。使用CATIA V5-6R2019 軟件建模，數(shù)據(jù)模型保存為STL文件。將STL文件導(dǎo)入CreatWare V7. 0. 2切片軟件，設(shè)計合適的打印路徑，對設(shè)計的支架模型進行分層切片，并導(dǎo)出Gcode 文件，將Gcode 導(dǎo)入CreatBot F430 3D 打印機進行支架制作。主要打印參數(shù)為：層高0. 20 mm，打印速度20 mm·s－1，噴頭溫度210 ℃，熱床溫度55 ℃，填充密度20%。打印支架分別標記PLA/PTMC 和PLA/PTMC-Ca3 （PO?）?，各制備100 個支架留存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 紅外光譜檢測 PLA/PTMC-Ca（? PO?）? 支架化學(xué)結(jié)構(gòu) 將 PLA/PTMC-Ca3 （PO?）? 支架加入溴化鉀研磨， 混合均勻后壓片， 在4 cm－1 的分辨率下，于4 000 cm－1～400 cm－1的范圍進行32 次掃描，以獲取PLA/PTMC-Ca3 （PO?）? 支架的傅里葉紅外光譜圖，進一步分析其內(nèi)部化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1. 4 體外降解實驗檢測 2 種支架降解失重率和pH值 另取PLA/PTMC和PLA/PTMC-Ca（? PO?）?支架各18 個，平均分成6 組，每組3 個，分別測量每組PLA/PTMC 和PLA/PTMC-Ca3 （PO ?）? 支架的初始質(zhì)量，取平均值（m0）。將PLA/PTMC 和PLA/PTMC-Ca3 （PO?）? 支架各取3 組浸于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS） 中， 另各取3 組浸于脂肪酶溶液中，密封后置于37. 5 ℃的空氣振動浴中， 每天震動8 h， 于第2、4、6、8、10、12 和14 周取出支架，測量脂肪酶溶液的pH 值并更換相同容量的PBS 緩沖液， 用蒸餾水充分沖洗支架， 濾紙吸干表面水分， 放入37 ℃干燥箱中干燥至質(zhì)量恒定，分別測量每組質(zhì)量，計算平均值（mr） 和降解樣品的降解失重率， 降解液的pH 值取每種材料的3 組溶液平均值。降解失重率=（m0-mr） /m0×100%。

1. 5 角接觸測量儀檢測 2種支架親水性 親水性是評估骨缺損修復(fù)材料的重要部分。將待測的PLA/PTMC 和PLA/PTMC-Ca3 （PO?）? 支架各3 個分別放置于角接觸測量儀升降臺上，調(diào)整針管液體量和升降臺高度，控制微量注射器分別將蒸餾水滴于PLA/PTMC 和PLA/PTMC-Ca3 （PO ?）? 支架表面，調(diào)整樣品與液體接觸的位置使其與測量基線重合，拍照獲得靜態(tài)照片，采用θ/2 法計算各組支架的接觸角，以接觸角代表支架的親水性。

1. 6 實驗動物處理和細胞培養(yǎng) 將3只出生2～5 d的白色新西蘭乳兔麻醉處死后消毒，于無菌操作臺上使用消毒的手術(shù)工具取乳兔四肢長管狀骨，用針管沿長軸穿刺后，應(yīng)用加入抗生素的生理鹽水吹打出骨髓液，梯度離心法處理后加入少許紅細胞裂解液，獲得包含造血干細胞和間充質(zhì)干細胞等在內(nèi)的骨髓單個核細胞（bone marrow mononuclear cells，BM-MNCs） 的細胞群。將細胞群轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入5 mL DMEM 完全低糖培養(yǎng)基的T25 培養(yǎng)瓶中，移入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在進行傳代擴增時，棄去原培養(yǎng)基，并加入1 mL 胰蛋白酶消化液，將培養(yǎng)箱置于培養(yǎng)室中消化1 min。顯微鏡下觀察，貼壁細胞呈現(xiàn)回縮、變圓和脫落的特征。加入5 mL 培養(yǎng)基以終止消化，經(jīng)過離心和去除上清液后，將細胞重新懸浮，并轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中。每3 d 更換完全低糖培養(yǎng)基，經(jīng)過4 次傳代后獲得較為純凈的骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs），以供后續(xù)實驗使用。

1. 7 細胞接種 將打印好的支架采用環(huán)氧乙烷滅菌法處理，放置于無菌操作臺上，紫外線輻照滅菌30 min， 用無菌鑷放入48 孔細胞培養(yǎng)板中，加入0. 2 mL 培養(yǎng)基孵育10 min， 將第4 代BMSCs 以每孔3×104個細胞的密度接種于細胞培養(yǎng)孔板上，每孔完全培養(yǎng)基補至0. 4 mL。

1. 8 CCK-8法檢測 2種支架共培養(yǎng)細胞增殖活性 在細胞支架復(fù)合體中，分別于細胞培養(yǎng)第1、3、5 和7 天采用CCK-8 試劑盒檢測2 種支架中細胞增殖活性。將BMSCs培養(yǎng)基與CCK-8試劑按照9∶1 的體積比混合。洗凈48 孔細胞培養(yǎng)板中原細胞培養(yǎng)基， 每孔加入400 μL 混合液。置于細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h 后，每孔中吸取100 μL 混合液加入96 孔細胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，于波長450 nm 處測定吸光度（A） 值，以A 值代表細胞增殖活性。

1. 9 茜素紅染色觀察2種支架共培養(yǎng)細胞成骨分化情況 將PLA/PTMC支架和PLA/PTMC-Ca3 （PO?）?支架分別與BMSCs 共培養(yǎng)21 d 后， 吸凈培養(yǎng)基，PBS 緩沖液沖洗后，95% 乙醇溶液固定15 min，再用PBS 緩沖液洗滌3 次， 加入適量的茜素紅染色液， 覆蓋支架后室溫染色30 min， 蒸餾水充分洗滌，用鑷子輕輕取出支架，正置體視顯微鏡下觀察細胞或骨分化情況并拍照。

1. 10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 26. 0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，GraphPad Prism 10 軟件繪制圖像。2 種支架降解失重率、pH 值、接觸角度數(shù)和細胞增殖活性均符合正態(tài)分布，以x±s 表示，2 組支架降解失重率、接觸角度數(shù)和細胞增殖活性比較采用兩獨立樣本t 檢驗，pH 值比較采用雙因素方差分析。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 PLA/PTMC-Ca ?（PO ?）? 支 架 化 學(xué) 結(jié) 構(gòu) PLA/PTMC-Ca3 （PO?）? 支架的紅外光譜圖顯示：遠紅外處出現(xiàn)的振動峰主要歸屬于樣品中的有機物，其中在2 923 cm-1、2 851 cm-1、1 391 cm-1 和1 353 cm-1的峰主要歸屬于PTMC 和PLA 中CH2反對稱伸縮振動和對稱伸縮振動及C-H 彎曲振動/羧酸根COO- 對稱伸縮振動， 而在2 383 cm-1 和1 592 cm-1位置處出現(xiàn)的信號歸屬于PTMC 中CO2反對稱伸縮振動和C-O 鍵的振動。同時，在506 cm-1出現(xiàn)的峰歸屬于PLA 中羧酸根（COO-）面外搖擺振動。此外， 在近紅外出現(xiàn)的其他峰主要歸屬于無機物Ca3 （PO?）? 中PO43- 的振動，峰主要出現(xiàn)在1 121 cm-1、1 062 cm-1、910 cm-1、565 cm-1 和471 cm-1歸屬于PO43-的P=O 伸縮振動、PO43-的PO4 反對稱伸縮振動、PO43-中P-（OH）3的對稱振動、PO43-的PO4不對稱變角振動和PO43-的PO4 對稱變角振動。紅外光譜檢測證實成功制備出含有PLA 、PTMC 和β-Ca3 （PO4）2 3 種物質(zhì)的復(fù)合支架。見圖1。

2. 2 2種支架降解情況 降解實驗持續(xù)14周，2種支架在PBS 和脂肪酶中的降解失重率均較為平穩(wěn)，且在PBS 緩沖液中的降解失重率較脂肪酶溶液中更低。降解6～14 周， 與PLA/PTMC 支架比較，PLA/PTMC-Ca3（PO?）? 支架在脂肪酶溶液和PBS緩沖液中的降解失重率均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。降解8～14 周， 與PLA/PTMC 支架比較， PLA/PTMC-Ca3（PO?）? 支架在脂肪酶溶液中的pH 值明顯升高（Plt;0. 01）。見圖2 和3。

2. 3 2 種 支 架 親 水 性 與 PLA/PTMC 支 架（91. 6°±0. 2°） 比較，PLA/PTMC-Ca3 （PO?）? 支架接觸角（63. 5°±0. 3°） 明顯減小（Plt;0. 01），提示與PLA/PTMC 支架比較，PLA/PTMC-Ca3 （PO?）?支架表現(xiàn)出明顯的親水性。見圖4。

2. 4 2種支架共培養(yǎng)細胞的增殖活性 隨著共培養(yǎng)時間的延長，2 種支架共培養(yǎng)細胞均有不同程度的增殖，細胞共培養(yǎng)3 d 后細胞增殖較明顯。細胞共培養(yǎng)第1 和3 天時， 2 種支架共培養(yǎng)細胞增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ Pgt;0. 05）；細胞共培養(yǎng)第5和7 天時，與PLA/PTMC 支架比較，PLA/PTMCCa3（PO ?）? 支架共培養(yǎng)細胞增殖活性均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見圖5。

2. 5 2種支架共培養(yǎng)細胞成骨分化情況 共培養(yǎng)21 d 后，2 種支架與BMSCs 重疊生長，局部均形成鈣化結(jié)節(jié)， 茜素紅將其局部染成橘紅色， 提示與2 種支架共培養(yǎng)的細胞均向骨細胞分化。與PLA/PTMC 支架比較，PLA/PTMC-Ca3 （PO?）? 支架共培養(yǎng)細胞礦化鈣結(jié)節(jié)數(shù)量增多，密度增大，顏色加深。見圖6。

3 討 論

近年來3D 打印技術(shù)在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域蓬勃發(fā)展，具有可個性化定制和能實現(xiàn)多種材料混合等特點，已經(jīng)應(yīng)用于顱骨修復(fù)、人工關(guān)節(jié)假體定制及醫(yī)學(xué)模型制作等領(lǐng)域［18］。利用3D 打印技術(shù)，臨床醫(yī)生基于影像數(shù)據(jù)精確打印出個性化的骨骼結(jié)構(gòu)，為手術(shù)提供精準的三維規(guī)劃。3D 打印技術(shù)制造的個性化骨科植入物具備高度精準性，有效提升了手術(shù)的成功率并縮短了患者康復(fù)期。在骨缺損的治療方面，由于其具有可精確調(diào)節(jié)孔隙率、孔隙模式和孔隙大小，且制作流程固定及可重復(fù)性的優(yōu)點，相較于傳統(tǒng)骨缺損治療方法也展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢［19-22］。

本研究結(jié)果顯示：PLA、PTMC 和β-Ca3 （PO?）?被成功負載， PLA/PTMC 支架和PLA/PTMCCa3（PO?）? 支架在PBS 緩沖液中總體呈現(xiàn)惰性，質(zhì)量變化較小，但二者在脂肪酶溶液中明顯失重，提示脂肪酶參與了2 種支架的降解反應(yīng)。脂肪酶可以作用于酯鍵，加速共聚物分子鏈的斷裂，導(dǎo)致共聚物的分子量降低。同時， 脂肪酶具有表面活性作用， 能夠與降解產(chǎn)物充分接觸并將其分散于液體中，促進PTMC 的表面侵蝕作用［23-24］。β-Ca3 （PO?）?材料與人體骨骼的成分較為相似，在降解過程中可以釋放成骨所必需的鈣離子和磷酸根離子，具有良好的促成骨特性，同時由于其良好的生物相容性和安全性、易于滅菌及保質(zhì)期較長的特性，β-Ca3 （PO?）?材料可以作為較好的骨缺損修復(fù)材料［25］。本研究結(jié)果顯示：與PLA/PTMC 支架比較，PLA/PTMCCa3（PO ?）? 支架在脂肪酶溶液中pH 值明顯升高。PLA 在中性溶液中降解緩慢，PTMC 在降解過程中不會釋放對溶液pH 值有顯著影響的酸性物質(zhì)，可能是由于PLA/PTMC-Ca3 （PO?）? 微粒在弱酸性溶液中與氫離子發(fā)生反應(yīng)， 導(dǎo)致溶液pH 值升高。2 種支架在降解過程中釋放的物質(zhì)對溶液pH 值的影響有限，理論上可以避免材料附近因pH 值降低所致的無菌性炎癥發(fā)生。未來可以通過增加PTMC 單體的密度和各部分比例進一步調(diào)控降解速率，使其更符合臨床需要［7］。

成骨細胞對接觸角變化敏感，其在水接觸角為64°的中等親水性表面黏附效果更好［26］。PLA/PTMC 支架接觸角為91. 6°±0. 2°，而PLA/PTMC-Ca3 （PO?）?支架的接觸角為63. 5°±0. 3°，更接近于64°。與PLA/PTMC 支架比較，β-Ca3 （PO?）? 增加了材料的親水性，使支架更有利于成骨細胞黏附和骨組織長入。

本研究結(jié)果顯示： 細胞共培養(yǎng)第5 和7 天時，與PLA/PTMC 支架比較，PLA/PTMC-Ca3 （PO?）?支架細胞增殖活性均明顯升高， 可能是由于負載β-Ca3 （PO?）? 顆粒的支架表面較為粗糙。與表面光滑和結(jié)構(gòu)致密的支架比較，具有適當潤濕性和多孔表面結(jié)構(gòu)的支架有利于細胞附著和細胞浸潤［27］。成骨分化實驗結(jié)果顯示： 與PLA/PTMC 支架比較， PLA/PTMC-Ca3 （PO?）? 支架礦化鈣結(jié)節(jié)數(shù)量更多，密度更大，顏色加深，提示PLA/PTMCCa3（PO?）? 支架在促進BMSCs 向骨細胞分化方面具有更好的效果，較PLA/PTMC 支架的促成骨能力明顯增加。提示PLA/PTMC-Ca3 （PO?）? 支架釋放的鈣離子可能有助于骨組織的形成，提高了支架的成骨誘導(dǎo)活性［10-11］。

本研究通過3D 打印技術(shù)成功制備了PLA/PTMC-Ca3 （PO?）? 復(fù)合多孔支架，充分發(fā)揮了各材料的優(yōu)勢，展現(xiàn)了良好的生物相容性、細胞黏附性和促成骨性能，證實該支架具有潛在的應(yīng)用前景，是一種性能優(yōu)良的骨缺損修復(fù)材料。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：劉鑫鋼參與文獻檢索、實驗設(shè)計和操作及論文撰寫，陳旭、劉亞東和苗錦虎參與數(shù)據(jù)收集及分析討論，邵國喜參與論文寫作指導(dǎo)和審校。

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