基于PCPA大鼠下丘腦蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析挖掘失眠發(fā)病的分子機(jī)制

摘要：目的 采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對PCPA失眠大鼠模型下丘腦蛋白質(zhì)表達(dá)差異進(jìn)行分析，探討失眠模型大鼠在失眠過程中下丘腦的差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。方法 將SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型A組、模型B組，除空白組外全都給予PCPA造模，模型A組造模成功后立即取下丘腦，空白組與模型B組飼養(yǎng)7 d，待PCPA藥效減退后取下丘腦。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測各組大鼠下丘腦蛋白差異，以差異表達(dá)量上調(diào)或下調(diào)超過1.5倍作為變化閾值，篩選差異蛋白并分析其互作用關(guān)系。結(jié)果 戊巴比妥鈉翻正反射試驗(yàn)顯示，模型A組、模型B組與空白組的大鼠睡眠潛伏期時(shí)間比較，潛睡眠時(shí)間均延長（P<0.01），睡眠持續(xù)時(shí)間均縮短（P<0.01）；自發(fā)活動(dòng)試驗(yàn)顯示造模后模型A組、模型B組與空白組比較，自發(fā)舉爪次數(shù)均增加（P<0.05）。根據(jù)蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析，模型A組與空白組之間蛋白網(wǎng)絡(luò)中有16個(gè)蛋白有較重要作用，其中Map1（T-kininogen 1）、Mfge8（Lactadherin）、P4hb（Protein disulfide-isomerase）與失眠關(guān)系較為密切。模型B組與模型A組之間蛋白網(wǎng)絡(luò)中有12個(gè)蛋白具有重要作用，其中Apoa1（Apolipoprotein A-I）、Mfge8（Lactadherin）、Sympk（Symplekin）、Plg（Plasminogen）與失眠關(guān)系密切。結(jié)論 通過PCPA大鼠下丘腦的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析挖掘，失眠的發(fā)生發(fā)展可能與HPA軸的應(yīng)激反應(yīng)下神經(jīng)變性保護(hù)、血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)平衡、學(xué)習(xí)記憶能力以及衰老具有相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：失眠；PCPA模型；下丘腦；蛋白質(zhì)組學(xué)；蛋白互作關(guān)系；差異蛋白

中圖分類號：R741 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1007-2349（2024）12-0082-06

Molecular Mechanisms of Insomnia Revealed by Hypothalamic ProteinInteraction Network Analysis in PCPA Rat Models

ZHANG Hong-shi1， QU Zi-han1， JIAO Jun-dong2， ZHANG Ye1

（1. Changchun University of Traditional Chinese Medicine， Changchun 130117， China; 2. The Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine， Changchun 130021， China）

【Abstract】Objective： To analyze the differential protein expression in the hypothalamus of PCPA-induced insomnia rat models using proteomics， and to explore the protein interaction networks involved in the pathogenesis of insomnia. Methods： SD rats were randomly divided into blank group， Model A group， and Model B group. Except for the blank group， all groups were modeled with PCPA. In the Model A group， the hypothalamus was harvested immediately after successful modeling， while in the blank and Model B groups， the hypothalamus was harvested after 7 days， allowing PCPA effects to subside. Proteomics technology was used to detect differential protein expression in the hypothalamus of each group. Proteins with differential expression levels greater than 1.5-fold（upregulated or downregulated） were identified and analyzed for interaction relationships. Results： Sodium pentobarbital righting reflex tests showed that sleep latency was significantly prolonged（P<0.01） and sleep duration significantly shortened（P<0.01） in both Model A and Model B groups compared to the blank group. Spontaneous activity tests revealed an increased number of paw lifts in the Model A and Model B groups compared to the blank group（P<0.05）. Protein interaction network analysis identified 16 key proteins in the network between the Model A and blank groups， among which Map1（T-kininogen 1）， Mfge8（Lactadherin）， and P4hb（Protein disulfide-isomerase） were closely related to insomnia. In the network between the Model B and Model A groups， 12 key proteins were identified， including Apoa1（Apolipoprotein A-I）， Mfge8（Lactadherin）， Sympk（Symplekin）， and Plg（Plasminogen）， which were strongly associated with insomnia. Conclusion： Protein interaction network analysis of the hypothalamus in PCPA-induced rat models suggests that the occurrence and progression of insomnia may be related to stress responses of the HPA axis， neurodegenerative protection， vascular endothelial cells， endocrine regulation， immune system balance， learning and memory abilities， and aging.

【Key words】Insomnia; PCPA Model; Hypothalamus; Proteomics; Protein Interaction Network; Differential Proteins

失眠是常見睡眠障礙之一，在世界主要國家失眠患者占總?cè)丝诘?%～10%，流行病學(xué)顯示失眠是增加糖尿病、冠心病、哮喘、肥胖癥、焦慮癥、抑郁癥等患病風(fēng)險(xiǎn)的主要因素，也常常導(dǎo)致認(rèn)知功能、記憶功能下降，給患者的生活和健康帶來嚴(yán)重影響，甚至導(dǎo)致自殺傾向^［1］。失眠是世界范圍內(nèi)的廣泛性疾病，對失眠的關(guān)注和治療每年需要投入大量資金，而目前對失眠的發(fā)病機(jī)制尚不明確。

目前對失眠發(fā)病的研究，主要從睡眠-覺醒周期出發(fā)，下丘腦是調(diào)節(jié)人體睡眠-覺醒的主要部位，下丘腦內(nèi)的諸多代謝通路都對睡眠產(chǎn)生影響^［2］，目前研究較多的物質(zhì)如促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）、5-羥色胺、γ-氨基丁酸（GABA）、神經(jīng)肽Y、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）^［3］。也有學(xué)者從免疫調(diào)節(jié)對于睡眠-覺醒機(jī)制影響角度出發(fā)進(jìn)行研究，如白介素-1α、TNF-β等^［4］。盡管已經(jīng)闡釋了部分失眠相關(guān)的分子機(jī)制，但是還有許多物質(zhì)沒有得到揭示，所以采用蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)方法，對各組大鼠的下丘腦進(jìn)行分析，找到差異蛋白，并根據(jù)互作網(wǎng)絡(luò)分析挖掘與失眠發(fā)病有關(guān)的重要物質(zhì)和通路。

1 材料與方法

1.1 材料 30只SPF級SD大鼠，體重（190±10）g，由長春億斯公司提供。購進(jìn)大鼠的合格證編號為SCXK（吉）-2018-0007，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，對大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組標(biāo)號，分為空白組、模型A組，模型B組，每組10只，動(dòng)物處于SPF級實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，保持恒溫、恒濕、自由飲水，12h光照模擬白天黑夜，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格符合動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物福利和倫理要求，并且經(jīng)過長春中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審批，批準(zhǔn)編號：2020346。

DL-4-Chlorophenylalanine 98%（C9H10CINO2 199.63，CAS：7424-00-2），蛋白酶抑制劑（Merck Millipore），trypsin（Promega），磷酸化酶抑制劑（Millipore），IAM（Sigma-Aldrich），甲酸（Fluka），尿素（Sigma-Aldrich），2-D Quant（GE Healthcare），二甲苯（Sangon Biotech），DNA提取酚試劑（Solarbio），BCA試劑（碧云天），PAGE銀染試劑盒（Solarbio），甲醇（ThermoFisher Scientific），甘油（Sangon Biotech），蛋白標(biāo)志物（Thermo scientific），奶粉（Amresco）。

1.2 方法

1.2.1 分組和造模 將30只SD大鼠分為正常組、模型A組、模型B組，每組10只，模型A組和模型B組采取腹腔注射對氯苯丙氨酸法（4-chloro-DL-phenylalanine，PCPA）建立模型^［5］，將PCPA粉末研磨后，按400 mg/kg配制，并給予大鼠腹腔注射，連續(xù)注射2 d，空白組注射等量生理鹽水。模型A組成模后不飼養(yǎng)直接取材，用以對照模型B組觀察造模成功后飼養(yǎng)對失眠大鼠的影響。模型B組和空白組飼養(yǎng)7 d后取材。

1.2.2 模型驗(yàn)證 戊巴比妥鈉翻正反射試驗(yàn)：按照經(jīng)驗(yàn)，大鼠在注射36 h后晝夜節(jié)律紊亂，晝夜皆活動(dòng)不斷。并在末次注射后24 h進(jìn)行大鼠戊巴比妥鈉翻正反射試驗(yàn)，以35 g/kg劑量的戊巴比妥鈉注射于大鼠腹腔，提起鼠尾以大鼠不能翻身回正為標(biāo)準(zhǔn)，記錄睡眠潛伏時(shí)間和睡眠持續(xù)時(shí)間^［6］。

自發(fā)舉爪活動(dòng)試驗(yàn)：主要是根據(jù)行為活動(dòng)程度測試大鼠神經(jīng)興奮程度，在試驗(yàn)前將大鼠分別置于干凈的鼠籠中適應(yīng)3min，然后開始記錄大鼠在2min之內(nèi)的前肢舉爪離地次數(shù)作為活動(dòng)指標(biāo)。在造模后1h分別對各組測量^［7］。

1.2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)檢測 大鼠以異氟烷氣體麻醉，確保大鼠處于無痛苦狀態(tài)，以鑷子尖端夾大鼠四肢無收縮反應(yīng)為麻醉成功，腹腔取血離心保存，然后斷頭并迅速在冰上剝離下丘腦，將下丘腦組織以生理鹽水沖洗干凈后置于凍存管中投入液氮中速凍，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱內(nèi)保存。檢測前稱取適量組織樣品至液氮預(yù)冷的研缽研磨，分別加入裂解緩沖液裂解后，離心10min，以BCA試劑盒對樣品進(jìn)行蛋白濃度測定。各樣品蛋白取等量進(jìn)行酶解，加入TCA后沉淀2h，離心后移除上清液，以丙酮洗滌沉淀。加入TEAB、胰蛋白酶過夜。加入二硫蘇糖醇、碘乙酰胺，室溫避光孵育15min。肽段經(jīng)超高效液相系統(tǒng)分離后電離，用Orbitrap Exploris^TM 480質(zhì)譜進(jìn)行分析。

1.2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 將篩選出來的差異表達(dá)蛋白數(shù)據(jù)編號或蛋白序列號比對STRING（v.11.0）蛋白網(wǎng)絡(luò)互作數(shù)據(jù)庫，按照confidence score＞0.7（high confidence）提取得到差異蛋白互作關(guān)系。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS23.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，計(jì)量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，多重比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 失眠大鼠模型行為學(xué)測試結(jié)果 分別采用大鼠戊巴比妥鈉翻正反射試驗(yàn)、自發(fā)活動(dòng)試驗(yàn)對大鼠空白組、模型A組、模型B組測試。結(jié)果顯示，戊巴比妥鈉翻正反射試驗(yàn)顯示注射后，模型A組、模型B組與空白組的大鼠睡眠潛伏期時(shí)間比較，潛睡眠時(shí)間均延長，均具有顯著性差異（P<0.01）。模型A組、模型B組與空白組的大鼠睡眠持續(xù)時(shí)間比較，睡眠持續(xù)時(shí)間均縮短，皆具有顯著性差異（P<0.01）。自發(fā)活動(dòng)試驗(yàn)顯示造模后模型A組、模型B組與空白組比較，自發(fā)舉爪次數(shù)均增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示模型建立成功，見表1、圖1。

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 通過上述差異蛋白分析，當(dāng)P≤0.05時(shí)，以差異表達(dá)量倍數(shù)變化超過1.5作為上調(diào)或者下調(diào)的變化閾值，比較分析顯示模型B組與空白組比較360個(gè)蛋白上調(diào)，124個(gè)蛋白下降，模型B組與模型A組比較，358個(gè)蛋白上調(diào)，101個(gè)蛋白下降。對大鼠造模前后、造模后飼養(yǎng)前后各組下丘腦差異蛋白表達(dá)互作網(wǎng)絡(luò)分析。

將不同比較組中根據(jù)差異倍數(shù)1.5篩選得到的差異蛋白數(shù)據(jù)庫編號或蛋白序列，通過與STRING（v.11.0）蛋白網(wǎng)絡(luò)互作數(shù)據(jù)庫比對分析，其中表達(dá)差異較大且符合睡眠相關(guān)的代表性蛋白質(zhì)，模型B組與空白組比較有16個(gè)蛋白差異明顯。見表2。模型B組與模型A組比較有12個(gè)蛋白差異明顯。見表3。在這些蛋白中Map1（T-kininogen 1）、Mfge8（Lactadherin）、P4hb（Protein disulfide-isomerase）、Apoa1（Apolipoprotein A-I）、Sympk（Symplekin ）、Plg（Plasminogen ）與失眠關(guān)系較為密切且變化顯著，根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果測定，對其蛋白表達(dá)數(shù)取平均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行比較。

3 討論

失眠表現(xiàn)為正常條件下難以入睡或睡眠質(zhì)量差，臨床研究表明失眠可能是增加心血管疾病、肥胖、氧化應(yīng)激以及代謝綜合征風(fēng)險(xiǎn)的重要因素^［8］。本研究采用腹腔注射對氯苯丙氨酸法建立失眠模型，并利用定量蛋白組學(xué)技術(shù)，檢測了PCPA失眠模型大鼠與正常大鼠下丘腦的差異蛋白質(zhì)的變化，對差異蛋白進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，從而對失眠發(fā)病的分子機(jī)制進(jìn)一步闡述失眠的發(fā)病機(jī)制。

研究結(jié)果顯示，模型B組與空白組比較360個(gè)蛋白上調(diào)，124個(gè)蛋白下降，模型B組與模型A組比較，358個(gè)蛋白上調(diào)，101個(gè)蛋白下降。模型A組與空白組之間蛋白網(wǎng)絡(luò)中有16個(gè)蛋白有較重要作用，其中Map1（T-kininogen 1）、P4hb（Protein disulfide-isomerase）、Mfge8（Lactadherin）與失眠關(guān)系較為密切。模型B組與模型A組之間蛋白網(wǎng)絡(luò)中有12個(gè)蛋白具有重要作用，其中Apoa1（Apolipoprotein A-I）、Sympk（Symplekin）、Mfge8（Lactadherin）、Plg（Plasminogen）與失眠關(guān)系較為密切。

Map1（T-kininogen 1）是一種與衰老相關(guān)的基因，同時(shí)也與炎癥反應(yīng)有關(guān)^［9］。一般動(dòng)物死亡前，不論年齡大小，血清中T-kininogen 1皆有所增加，在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠血清中T-kininogen 1的增加呈指數(shù)曲線，而在雌性中增加曲線呈線性擬合，并且無論性別如何，飲食的限制都會(huì)延緩T-kininogen 1的增加，所以進(jìn)一步分析T-kininogen 1可能與脾細(xì)胞在糖脂作用下的增值呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，從而得出血清中T-kininogen 1增加是衰老的一個(gè)有效標(biāo)志物，并且可能隨著年齡的增長，與淋巴細(xì)胞增殖減緩有關(guān)^［10］。近年來有相關(guān)研究對睡眠剝奪大鼠的血清做蛋白組學(xué)分析，T-kininogen 1有較高表達(dá)，而對照組則沒有免疫識(shí)別，認(rèn)為T-kininogen 1是睡眠剝奪潛在的血清標(biāo)志物之一。

P4hb（Protein disulfide-isomerase）是二硫鍵異構(gòu)酶，又簡稱PDI，主要功能是充當(dāng)巰基-二硫鍵交換反應(yīng)的催化劑，能夠進(jìn)蛋白二硫鍵的生成，具有分子伴侶活性，能抑制錯(cuò)誤的折疊蛋白聚集，在神經(jīng)變性疾病中能夠起到保護(hù)神經(jīng)的作用，如帕金森癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、阿爾茲海默癥、多聚谷氨酰胺疾病等，能夠在不同程度上抑制錯(cuò)誤折疊蛋白的聚集，但是PDI能被過量的一氧化氮亞硝基化，造成其蛋白質(zhì)構(gòu)象改變和功能障礙，從而影響神經(jīng)元的連通性和可塑性，觸發(fā)神經(jīng)元的凋亡通路^［11］。

Mfge8（Lactadherin）是一種乳酸粘附蛋白，也稱乳脂肪球表皮生長因子，是一種具有多種免疫功能的糖蛋白，研究表明Lactadherin缺乏的小鼠會(huì)有免疫疾病癥狀，如脾增大、血清內(nèi)抗DNA及抗核蛋白抗體顯著增多，所以Lactadherin對于機(jī)體維持免疫系統(tǒng)平衡具有重要意義。它在血管及其周圍表達(dá)，并在成年小鼠血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）依賴的新生血管中發(fā)揮關(guān)鍵作用^［12］。也有研究發(fā)現(xiàn)乳糖粘附蛋白能夠改變新生血管的VEGF依賴的Akt磷酸化。在缺乏VEGF的情況下，乳酸粘附素可誘導(dǎo)體外內(nèi)皮細(xì)胞中Akt磷酸化，并顯著改善體內(nèi)缺血后血管新生，乳酸粘附蛋白在VEGF依賴的新生血管中起著至關(guān)重要的作用^［13］。

Apoa1（Apolipoprotein A-I）是載脂蛋白，是高密度脂蛋白的主要功能蛋白，其含量多少與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，Apolipoprotein A-I缺乏是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化加重的原因之一^［14］。

Sympk（Symplekin），Simplekin是雙駐留蛋白，這些蛋白可能發(fā)生在細(xì)胞核和斑塊中，能在緊密連接、粘附連接或橋粒中發(fā)揮作用，這種蛋白存在于核漿中，在那些形成緊密連接的細(xì)胞中，部分會(huì)有選擇性地被納入到閉塞帶的斑塊結(jié)構(gòu)中^［15］。

Plg（Plasminogen）是纖溶酶原，在腦組織和脊髓內(nèi)以及大多數(shù)器官中都有表達(dá)，其活性形式與炎癥相關(guān)的疾病具有廣泛聯(lián)系，能夠去除血管內(nèi)纖維蛋白沉積，目前對其溶栓作用進(jìn)行研究較多，也有研究表明組織型纖溶酶原調(diào)控了神經(jīng)元的存活、突觸的可塑性以及學(xué)習(xí)記憶等過程^［16］。該研究基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析失眠與健康大鼠下丘腦之間的差異蛋白質(zhì)，通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析挖掘探究失眠發(fā)病的相關(guān)分子機(jī)制，一定程度上能夠彌補(bǔ)人體實(shí)驗(yàn)無法對下丘腦蛋白分析的現(xiàn)實(shí)，填補(bǔ)失眠發(fā)病后下丘腦蛋白質(zhì)組學(xué)變化的空白，對失眠的研究具有重要意義，但是盡管諸多物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)與失眠發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)，但仍需大量的科研實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，通過PCPA大鼠下丘腦的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析挖掘，失眠的發(fā)生發(fā)展可能與HPA軸的應(yīng)激反應(yīng)下神經(jīng)變性保護(hù)、血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)平衡、學(xué)習(xí)記憶能力以及衰老具有相關(guān)性。

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（收稿日期：2024-07-24）