外周時鐘基因在非酒精性脂肪性肝炎發(fā)展與防治中的作用

摘要：非酒精性脂肪性肝炎（NASH）作為非酒精性脂肪性肝病的嚴(yán)重臨床表現(xiàn)形式，以肝脂質(zhì)沉積、炎癥損傷為特征。目前NASH的臨床治療藥物仍處于探索實驗階段，亟待取得進(jìn)展。有研究指出NASH的發(fā)病機(jī)制與肝臟晝夜節(jié)律紊亂有關(guān)，具體可表現(xiàn)為肝時鐘基因如BMAL1等表達(dá)失調(diào)，導(dǎo)致肝內(nèi)脂質(zhì)生成增多、脂肪酸氧化減少以及促炎癥因子激活。因此，改善肝臟晝夜節(jié)律，調(diào)節(jié)肝時鐘基因表達(dá)被視為防治NASH的可行策略。目前已有通過激活時鐘基因編碼蛋白治療NASH的藥物應(yīng)用于動物實驗，如REVERB全激動劑SR9009，其能抑制肝臟的炎癥發(fā)展，有效證實了靶向時鐘編碼蛋白在NASH治療中的可能性。本文總結(jié)了肝時鐘基因在調(diào)節(jié)肝脂質(zhì)代謝與炎癥發(fā)生發(fā)展中的作用，闡述了近年來以時鐘基因及其相關(guān)蛋白作為靶點的藥物研究進(jìn)展，以期為NASH治療提供新靶點。

關(guān)鍵詞：非酒精性脂肪性肝?。粫円构?jié)律；時鐘蛋白質(zhì)類

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）作為非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）的嚴(yán)重臨床表現(xiàn)形式，以肝脂質(zhì)沉積、炎癥損傷為特征。隨著生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，NASH的發(fā)病率逐年升高，預(yù)計其全球發(fā)病率將在未來10年增加56%，到2030年，將成為肝移植的主要原因[1-2]。NASH導(dǎo)致的肝硬化死亡占中國大陸肝硬化總死亡病例的32.6%[3]。

臨床上，NASH的治療包括飲食干預(yù)、運(yùn)動干預(yù)、藥物治療以及減肥手術(shù)。目前最為廣泛推薦的治療方法仍是干預(yù)患者的不良生活方式、控制體質(zhì)量和腰圍[4]，但此類治療方法需要較好的監(jiān)管，患者較難長期維持標(biāo)準(zhǔn)的飲食攝入，因此常無法達(dá)到理想的減重效果。除飲食干預(yù)之外，運(yùn)動也可以預(yù)防與肝臟相關(guān)的死亡，并降低肥胖帶來的風(fēng)險[5]。藥物治療方面，保肝藥物如雙環(huán)醇、多烯磷脂酰膽堿等效用有限，且其對NASH無研究證實的肯定療效。減肥手術(shù)雖然可以最大限度地幫助患者減輕體質(zhì)量，同時有效控制代謝紊亂，但適用人群十分有限，且對NASH的長期治療效果尚未得到證實。目前，尚無藥物被批準(zhǔn)用于NASH的治療[5]。因此，深入研究NASH的發(fā)病機(jī)制，找到相關(guān)的治療靶點，對NASH 的防治具有重要意義。

晝夜節(jié)律是由分子生物鐘產(chǎn)生的一系列內(nèi)源性自主振蕩器，其在24小時的周期中，協(xié)調(diào)內(nèi)部時間與外部環(huán)境相適應(yīng)[6]。事實上，多種重要的肝臟生理功能以及細(xì)胞過程均受到生物鐘的調(diào)節(jié)，肝時鐘維系的晝夜節(jié)律通過影響肝時鐘基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯，調(diào)節(jié)下游生理過程；其中部分時鐘基因被證實與肝脂質(zhì)代謝、炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?；诖?，部分學(xué)者提出，改善肝臟晝夜節(jié)律是預(yù)防和治療NASH的可行策略。

本文就外周時鐘基因在NASH發(fā)病中的作用機(jī)制和靶向時鐘基因及其相關(guān)蛋白的治療藥物進(jìn)行綜述，為NASH提供可能的治療靶點。

1"""" 晝夜節(jié)律

1.1" 簡介"""""" 地球自轉(zhuǎn)產(chǎn)生了以日為周期的環(huán)境變化，例如一天內(nèi)光照和溫度的變化。為了在生理、代謝和行為上適應(yīng)這種環(huán)境改變，生物體進(jìn)化出一種大約以24小時為周期的內(nèi)源性計時機(jī)制，該機(jī)制能夠根據(jù)時間調(diào)整生物行為模式并改變生物行為的代謝狀態(tài)，例如人類晝出夜伏的作息、飲食行為的時間等。負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)內(nèi)部時間與外界環(huán)境相適應(yīng)的機(jī)制被稱為生物鐘[6]。哺乳動物體內(nèi)的生物鐘根據(jù)其分布的解剖位置不同，分為核心時鐘與外周時鐘。核心時鐘與外周時鐘組成成分相同，均由轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成，參與調(diào)控下游時鐘基因的轉(zhuǎn)錄，此調(diào)節(jié)機(jī)制被稱為轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過作用于細(xì)胞的代謝感受器，形成具有細(xì)胞自主性的節(jié)律性時鐘振蕩器，即晝夜節(jié)律[7]。

核心時鐘位于大腦的視交叉上核，對光敏感，與光照周期同步后負(fù)責(zé)驅(qū)動機(jī)體休息、活動，并調(diào)節(jié)禁食的周期。其可根據(jù)外周組織的自主神經(jīng)支配、內(nèi)分泌信號（糖皮質(zhì)激素和褪黑素）、體溫等相關(guān)信號，來調(diào)控外周振蕩器[8]。值得注意的是，核心時鐘基因的表達(dá)不會受飲食因素影響[9]。外周時鐘又稱非核心時鐘，位于機(jī)體的外周組織，主要受到溫度、光照等因素的影響，其中肝時鐘主要受食物攝入的影響[10]。

1.2" 晝夜節(jié)律的分子調(diào)控機(jī)制"" 在分子水平上，晝夜節(jié)律由轉(zhuǎn)錄因子組成的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋調(diào)節(jié)環(huán)路即分子鐘實現(xiàn)（圖1）。其中，時鐘相關(guān)蛋白是轉(zhuǎn)錄因子的重要組成部分，其可通過反饋調(diào)節(jié)環(huán)路實現(xiàn)對時鐘基因表達(dá)的調(diào)控。哺乳動物體內(nèi)存在多種時鐘基因，包括腦和肌肉組織芳香羥受體核轉(zhuǎn)運(yùn)類似蛋白1基因（brain and muscle ARNT-like protein-1，BMAL1）、時鐘基因（circadian locomotor output cycles kaput，CLOCK）、周期基因（period，PER）、隱花色素基因（cryptochrome，CRY）以及核受體家族1D組成員基因（nuclear receptor subfamily 1 group D member 1，NR1D1，即REVERB）等。

時鐘振蕩器通過兩個基本的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路發(fā)揮作用。核心環(huán)路中：一方面，異源二聚體（CLOCK-BMAL1）作為哺乳動物生物鐘的起搏器，通過與DNA的E-box結(jié)合位點（5'-CACGTG-3'）結(jié)合，調(diào)控時鐘基因PER1/2、CRY1/2、REVERB的轉(zhuǎn)錄[11]；另一方面，PER1/2、CRY1/2轉(zhuǎn)錄生成的PER1/2和CRY1/2可作為BMAL1-CLOCK的功能抑制因子，但當(dāng)其通過翻譯后修飾抑制活性后，便失去了對BMAL1-CLOCK的抑制，從而形成了一種自我調(diào)節(jié)循環(huán)機(jī)制[11]。第二個調(diào)節(jié)環(huán)路中，視黃酸相關(guān)孤兒受體α（retinoid-related orphan nuclear receptor，RORα）和REVERB通過與BMAL1/CLOCK上的RORE位點競爭性結(jié)合，調(diào)節(jié)BMAL1與CLOCK基因的表達(dá)；其中ROR作為轉(zhuǎn)錄促進(jìn)因子，REVERB作為轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮作用。

2"""" 外周時鐘基因參與NASH發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制

脂肪在肝臟的異位沉積、變性及肝臟炎癥的發(fā)生、發(fā)展，被視為NASH的重要病理機(jī)制。近年來隨著對晝夜節(jié)律的深入探索，研究者逐漸開始重視其在疾病發(fā)展中的作用。有學(xué)者[10]提出肝時鐘基因表達(dá)紊亂，可造成其下游調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝及促炎癥因子分泌的蛋白水平異常。如REVERB可以作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，間接調(diào)控肝脂質(zhì)的從頭合成；BMAL1可以通過調(diào)節(jié)肝臟核受體蛋白——過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARa）的mRNA甲基化水平，控制脂肪酸的氧化代謝。另一方面，RORα可以降低肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞內(nèi)過量活性氧（ROS）水平，參與應(yīng)對炎癥的發(fā)生。

2.1" 時鐘基因及其相關(guān)蛋白參與調(diào)節(jié)肝脂質(zhì)代謝（圖2）

2.1.1""""" BMAL1基因" BMAL1基因參與肝臟的脂質(zhì)代謝，其與極低密度脂蛋白（very-low-density lipoprotein，VLDL）的分泌密切相關(guān)；其中高水平VLDL易誘發(fā)高脂血癥，被視為NASH發(fā)展的因素之一。

lncRHL是一種在肝臟中高表達(dá)的長鏈非編碼RNA （lncRNA），其能夠直接與異質(zhì)核核糖核蛋白U（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U，hnRNPU）結(jié)合，增強(qiáng)自身穩(wěn)定性的同時，提高BMAL1的轉(zhuǎn)錄活性，從而減少肝細(xì)胞VLDL分泌[12]。lncRHL缺失會加速hnRNPU蛋白降解，抑制BMAL1轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)肝細(xì)胞VLDL分泌[12]；而BMAL1水平在脂肪肝小鼠模型中降低[13]。上述研究提示，BMAL1水平的減低可能在脂肪肝疾病中起到病因?qū)W的作用，但確切機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

目前IncRHL被作為hnRNPU調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于代謝性疾病如糖尿病的治療中，但其能否通過恢復(fù)肝臟晝夜節(jié)律作用于NASH尚不明確。因此，闡明BMAL1對晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)的潛在機(jī)制，探究其對于NASH的治療效果，可為改善晝夜節(jié)律治療NASH開辟新的前景。

2.1.2""""" CLOCK基因" 載脂蛋白（apolipoprotein，apo）B參與內(nèi)源性甘油三酯的運(yùn)輸[14]；微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白（microsomal triglyceride transporter，MTP）協(xié)助apoB通過細(xì)胞膜向肝外轉(zhuǎn)移甘油三酯，預(yù)防甘油三酯在肝臟的異位沉積。

CLOCK可以與小異二聚體伴侶（small heterodimer partner，SHP）的啟動子E-box序列結(jié)合，上調(diào)SHP表達(dá)，從而抑制MTP基因表達(dá)，降低apoB水平[15]。動物實驗[16-17]證實Clock基因突變的小鼠（Clockml/ml）隨著年齡的增長，會出現(xiàn)食欲亢進(jìn)、脂質(zhì)代謝失調(diào)、肝脂肪變性、高甘油三酯血癥等代謝異常表現(xiàn)，提示CLOCK基因節(jié)律性表達(dá)的破壞極有可能擾亂肝脂質(zhì)的代謝過程[17]。

2.1.3""""" NR1D1amp;NR1D2基因脂質(zhì)在肝臟的異位沉積被視為NASH早期發(fā)展的關(guān)鍵病理機(jī)制。REVERB蛋白作為細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的核受體超級家族成員，是參與生物鐘調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子。其可以通過抑制脂肪生成酶，例如固醇調(diào)節(jié)兀件結(jié)合蛋白1c（sterol regulatory element-binding protein 1，SREBP1c），減少肝脂質(zhì)沉積[18]。

REVERB分為兩種亞型：REVERBα和REVERBβ，分別由NR1D1、NR1D2基因編碼，其中REVERBβ的作用機(jī)制暫不明確。REVERBα作為轉(zhuǎn)錄抑制劑，可直接抑制胰島素誘導(dǎo)基因2（insulin induced gene 2，INSIG2）的轉(zhuǎn)錄，間接控制SREBP的表達(dá)。SREBP1c作為SREBP在肝臟的主要表達(dá)亞型，控制脂質(zhì)的從頭合成，其過表達(dá)被視為肝脂質(zhì)沉積的危險因素[10]。

有研究[18]表明，特異性敲除肝臟Reverb基因的小鼠表現(xiàn)出血漿游離脂肪酸水平升高，其比野生型小鼠更易發(fā)展為NAFLD。提示肝臟Reverb基因在NAFLD發(fā)展過程中極有可能起到保護(hù)作用。

2.1.4""""" RORA基因""" RORα參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)。具體表現(xiàn)為RORα可激活A(yù)MP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK），促進(jìn)脂肪酸β氧化，減少脂質(zhì)的沉積[19]。臨床研究[19]發(fā)現(xiàn)NASH患者肝臟中RORα水平較低，進(jìn)一步提示RORα表達(dá)水平降低與NASH發(fā)展密切相關(guān)。未來可深入探討RORα激動劑是否可有效降低肝臟的脂質(zhì)沉積水平。

2.2" 時鐘基因及其相關(guān)蛋白參與調(diào)節(jié)肝臟炎癥的發(fā)生、發(fā)展（圖3）

2.2.1""""" BMAL1基因" ROS是炎癥性疾病進(jìn)展中的關(guān)鍵信號分子。肝時鐘基因BMAL1主要通過抑制肝組織ROS積累，參與預(yù)防肝臟炎癥的發(fā)生。體內(nèi)實驗[20-21]發(fā)現(xiàn)，NAFLD小鼠肝內(nèi)Bmall表達(dá)水平降低，與ROS、H2O2水平呈負(fù)相關(guān)；同時，體外實驗[13]證實HepG2細(xì)胞內(nèi)BMAL1表達(dá)水平降低，將削弱藥物對ROS的抑制作用。以上實驗結(jié)果表明肝內(nèi)細(xì)胞ROS水平受到BMAL1的抑制，且藥物對ROS的抑制作用很可能通過激活BMAL1實現(xiàn)。

2.2.2""""" NR1D1amp;NR1D2基因炎癥小體NLRP3作為機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的組成成分，其激活促進(jìn)NASH的發(fā)展。REVERB具有抑制IL-1β、IL-6、TNF-α以及NLRP3等促炎癥因子的作用，可作為NLRP3的直接調(diào)節(jié)因子，抑制NLRP3的激活[22]。因此REVERB激動劑有望作為NLRP3介導(dǎo)疾?。ㄈ鏝ASH）的治療手段。

在NASH發(fā)生時，輔助性T淋巴細(xì)胞17（Th17）浸潤肝組織，產(chǎn)生大量的IL-17A，這與肝臟的炎癥和纖維化進(jìn)展有關(guān)。RORγt作為IL-17的主要轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控Th17細(xì)胞分化以及IL-17A的激活。有學(xué)者[18]提出，REVERB可以通過與RORγt競爭結(jié)合底物——RORE，從而抑制Th17細(xì)胞活化及其后續(xù)信號通路，進(jìn)而治療NASH。

2.2.3""""" RORA基因""" 體內(nèi)實驗[23]發(fā)現(xiàn)，髓系巨噬細(xì)胞Rora基因敲除的小鼠更易被高脂飲食誘導(dǎo)為NASH，提示RORA基因在NASH發(fā)展中可能起到保護(hù)作用；該研究也證實了RORA對炎癥的抑制作用。一方面，RORa可通過抑制巨噬細(xì)胞中TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生，有效預(yù)防肝臟炎癥發(fā)生、發(fā)展[23]；另一方面，RORα還可通過增強(qiáng)肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase 1，GPx1）等ROS清除酶mRNA的水平，減少肝內(nèi)細(xì)胞內(nèi)ROS，從而抑制脂質(zhì)過氧化[24]。

除此之外，線粒體功能障礙與肝細(xì)胞死亡、肝脂肪變性也密切相關(guān)。RORα可以通過BCL2/腺病毒E1B 19 kD相互作用蛋白3和PPARγ共激活因子1a（PPAR- γcoactivator 1 alpha，PGC-1α）共同維持肝細(xì)胞線粒體的正常結(jié)構(gòu)、功能和數(shù)量，保護(hù)線粒體呼吸復(fù)合物的完整性和活性，減少裂變，促進(jìn)其再生，從而減輕線粒體自噬和氧化應(yīng)激[7]，預(yù)防肝脂肪變性發(fā)生。

近年來越來越多的研究者開始重視時鐘基因在NASH中的致病或防御作用，如RORα不僅可以通過促進(jìn)脂肪酸氧化減緩肝內(nèi)脂質(zhì)的堆積，還可以通過抑制ROS水平實現(xiàn)對肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。且臨床數(shù)據(jù)[23]顯示，NASH患者中RORα水平降低，這一數(shù)據(jù)不僅支持前期體內(nèi)外實驗提出的RORα在NASH發(fā)病過程中的保護(hù)機(jī)制，同時也提示RORα可以作為診斷和監(jiān)測NASH發(fā)展的生物標(biāo)志物。此外，RORα參與NASH發(fā)病過程中的時鐘蛋白還有望成為靶向治療NASH的藥物靶點。

然而，目前大多數(shù)的研究都關(guān)注于時鐘基因作為上游調(diào)節(jié)因子參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)沉積、炎癥發(fā)展，如REVERBA可以通過INSIG2間接調(diào)節(jié)SREBP1c的表達(dá)水平，控制脂質(zhì)在肝臟的沉積情況。但下游因子對上游時鐘基因也存在反向的調(diào)節(jié)作用，如AMPK可以通過磷酸化作用抑制CRY1、PER的轉(zhuǎn)錄，這一反向調(diào)節(jié)可能會進(jìn)一步加重NASH的發(fā)展。目前針對反向調(diào)節(jié)作用的研究仍處于起步階段，相信隨著對下游因子反向調(diào)節(jié)作用的深入研究，未來可為NASH的靶向藥物研究提供新的方向。

3"""" 時鐘基因相關(guān)的NASH治療藥物

3.1" 時鐘基因激動劑

3.1.1""""" SR9009（REVERB全激動劑）""" REVERB核受體幾乎在所有細(xì)胞中表達(dá)，其中以肝、骨骼肌以及脂肪組織表達(dá)水平為最高。其在調(diào)節(jié)肝臟代謝相關(guān)基因的晝夜節(jié)律性表達(dá)方面起到了重要的作用[25]。REVERB作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，調(diào)控機(jī)體內(nèi)多種生理過程，其可以間接控制肝細(xì)胞內(nèi)核SREBP1c的水平，從而調(diào)控肝臟的脂質(zhì)代謝；也可以抑制促炎癥因子、炎癥小體的激活，阻止肝臟炎癥的發(fā)展。因此靶向激活REVERB治療NASH具有極大的可行性。

動物實驗[26]顯示，在高膽固醇、高脂肪飲食構(gòu)建的NASH小鼠模型中，空腸、回腸及結(jié)腸的REVERB表達(dá)降低，腸道通透性也伴隨減小。在接受REVERB全激動劑SR9009治療后，小鼠腸道內(nèi)REVERB節(jié)律有所恢復(fù)，肝內(nèi)脂質(zhì)積累、胰島素抵抗、炎癥及纖維化均有不同程度的減輕。但該實驗并非聚焦于肝時鐘基因的改善，而是腸道晝夜節(jié)律的恢復(fù)，體現(xiàn)了不同器官之間的外周時鐘存在著交互作用；這種肝、腸時鐘的“相互溝通”可能進(jìn)一步促進(jìn)了NASH病理表現(xiàn)的減輕。時鐘基因靶向激動劑的作用范圍不僅局限于病變發(fā)生的肝臟，還能作用于紊亂的腸道晝夜節(jié)律[26]，考慮到肝臟與膽囊、胰島的密切關(guān)系，未來可深入研究這些器官在接受激動劑治療后的晝夜節(jié)律變化以及該變化與NASH緩解之間的聯(lián)系。

3.1.2""""" 川陳皮素（ROR激動劑）" RORα可以通過激活A(yù)MPK，促進(jìn)脂肪酸氧化，同時還可以降低肝臟ROS水平以及抑制Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生IL，進(jìn)而起到對NASH的防治作用。

川陳皮素是一種天然存在的多甲氧基黃酮，可從柑橘皮分離獲得。其與ROR的配體結(jié)合域結(jié)合，激活ROR。動物實驗[27]證實，在飲食誘導(dǎo)肥胖的小鼠中，川陳皮素治療不僅顯著抑制了小鼠體質(zhì)量的增加，還顯著提高了小鼠氧耗，降低了血糖水平。

3.1.3""""" 黃連素（CLOCK、BMAL1激動劑）" 黃連素作為一種傳統(tǒng)中藥，具有抗氧化、抗炎及抗胰島素抵抗作用。體內(nèi)外實驗均證實黃連素可以通過增強(qiáng)CLOCK、BMAL1的表達(dá)水平，恢復(fù)氧化還原反應(yīng)穩(wěn)態(tài)，緩解代謝性疾病[13]。

部分傳統(tǒng)中藥在代謝性疾病中具有明顯的臨床緩解療效，但因其作用機(jī)制不明確，較少被推薦用于常規(guī)治療。Ye等[13]的研究發(fā)現(xiàn)為中藥作用機(jī)制的探索提供了新思路，亦使如黃連素類的傳統(tǒng)中藥有望被推薦用于NASH的臨床防治工作中。

3.2" 時鐘基因下游調(diào)節(jié)蛋白激動劑及抑制劑

3.2.1""""" A-769662和水楊酸鹽（AMPK激動劑）自噬是肝臟重要的代謝途徑，自噬失衡與脂質(zhì)異位沉積和線粒體損傷密切相關(guān)[28]，在NASH中起病因?qū)W作用。AMPK作為肝臟富含的代謝調(diào)節(jié)分子[29]，參與自噬通路調(diào)節(jié)，在饑餓狀態(tài)下被激活，增強(qiáng)自噬起始激酶——Unc-51樣自噬激活激酶1的活性。

由于AMPK活性被發(fā)現(xiàn)在NAFLD、NASH患者中降低，激活A(yù)MPK治療NAFLD、NASH成為了臨床藥物研究的新方向。隨著研究進(jìn)展，現(xiàn)已明確AMPK可通過AMPK- SREBP1c-lipin-1軸等機(jī)制發(fā)揮對NASH的治療作用[30]，但目前未有文獻(xiàn)提及AMPK療效與晝夜節(jié)律的關(guān)聯(lián)。

AMPK可以通過磷酸化修飾作用使得時鐘基因蛋白CRY1和PER結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定湛至失活[30-31]。其中PER2可以通過直接抑制肝組織中PPARα、PPARγ以及REVERBA的轉(zhuǎn)錄水平[31]，促進(jìn)脂質(zhì)在肝臟的異位沉積。AMPK對PER水平的這種負(fù)性調(diào)節(jié)作用，可能在正常生理狀態(tài)下發(fā)揮保護(hù)作用。

AMPK激動劑可能通過抑制上游時鐘基因蛋白PER2的轉(zhuǎn)錄實現(xiàn)對NASH的緩解。后續(xù)可以開展體內(nèi)外實驗，觀察敲除肝時鐘基因PER是否會降低AMPK激動劑的治療效果。

3.2.2""""" SRT2183[沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（silent information regulator factor 2-related enzyme 1，SIRT1）激動劑]"" Toll樣受體（TLR）識別病原體相關(guān)分子模式以及核因子-κB（NF-κB）激活是炎癥發(fā)展中的重要通路[32]。TLR分布于肥大細(xì)胞上，識別脂多糖等，進(jìn)一步激活NF-κB通路，誘發(fā)炎癥發(fā)展。SIRT1是重要的代謝傳感器和控制器，其可以通過干擾NF-κB信號通路、脫乙酰化SREBP1c及核因子類胡蘿卜素2相關(guān)因子2等轉(zhuǎn)錄因子，改善氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[33-34]。研究[33]表明，小鼠肝臟內(nèi)SIRT1的表達(dá)缺失加速肝臟炎癥發(fā)展，而過表達(dá)則對于肝臟產(chǎn)生保護(hù)作用。

已證實SIRT1激動劑可能通過AMPK/SIRT1/SREBP1c/PPARγ通路[35]或SIRT1/PI3K/AKT/mTOR[36]通路發(fā)揮作用。但目前尚未有研究提出SIRT1是否可以通過調(diào)節(jié)時鐘基因表達(dá)實現(xiàn)對NASH的治療作用。

SIRT1可與CLOCK/BMAL1二聚體結(jié)合，調(diào)節(jié)下游時鐘基因如PER的表達(dá)，同時其還能夠通過脫乙?；饔谜{(diào)節(jié)BMAL1的表達(dá)水平[37]。結(jié)合時鐘基因BMAL1、PER2在NAFLD發(fā)展過程中的保護(hù)、致病作用，SIRT1激動劑是否能通過恢復(fù)BMAL1、PER的正常表達(dá)水平發(fā)揮療效，有待進(jìn)一步探究。

3.2.3""""" SZ0232——微粒體前列腺素E合成酶2（microsomal prostaglandin E synthase-2，mPGES-2）抑制劑 mPGES-2是一種雙功能酶，與谷胱甘肽和血紅素共同形成復(fù)合物。最新研究[38]發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞特異性mPGES-2缺陷對小鼠肝脂肪變性、炎癥和纖維化具有很強(qiáng)的保護(hù)作用。

接受mPGES-2抑制劑SZ0232治療的高脂喂養(yǎng)小鼠、db/db小鼠和蛋氨酸膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)小鼠的肝脂質(zhì)積累、肝臟炎癥和肝纖維化均得到不同程度緩解，同時肝內(nèi)與脂質(zhì)吸收、生成以及纖維化發(fā)展相關(guān)的基因表達(dá)水平亦下降[38]。

有研究者[39]提出，mPGES-2復(fù)合物內(nèi)血紅素可增加REVERBA介導(dǎo)的特定靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制。但mPGES-2抑制劑與REVERBA聯(lián)合治療機(jī)制在NASH緩解中發(fā)揮的作用仍需進(jìn)一步的動物實驗、臨床試驗探索。

3.3" 潛在的藥物治療靶點——CREBH 游離脂肪酸水平是誘發(fā)NAFLD疾病進(jìn)展的危險因素，過量的脂肪酸加強(qiáng)肝臟脂肪酸的氧化，促進(jìn)超氧化物的生成，進(jìn)一步加重線粒體的工作負(fù)擔(dān)[40]，其中，線粒體功能紊亂被視為高脂飲食導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷的主要機(jī)制。線粒體通過招募溶酶體吞噬移除已損害的線粒體片段，防止線粒體凋亡發(fā)生，此過程被稱為線粒體自噬，是延緩NAFLD進(jìn)展的重要機(jī)制[40]。研究[41]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）-環(huán)AMP響應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cyclic AMP responsive element binding protein，CREB）信號通路作為上游信號分子，調(diào)節(jié)線粒體自噬的激活，其也被證實在高脂狀態(tài)下參與保護(hù)肝細(xì)胞及線粒體穩(wěn)態(tài)。

CREB作為肝臟富含的轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)肝糖異生[42]，除此之外，其也是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成的重要調(diào)節(jié)因子。CREBH作為肝臟特異性的CREB，通過激活負(fù)責(zé)脂質(zhì)氧化、分解的基因，維持脂質(zhì)代謝平衡[43]。一方面，CREBH受到時鐘基因BMAL1的調(diào)節(jié)，具體表現(xiàn)為BMAL1通過AKT/GSK-3B信號通路調(diào)節(jié)CREBH的蛋白水解程度[38]；另一方面，CREB還能上調(diào)上游時鐘基因PER1轉(zhuǎn)錄水平[44]。

既往已有實驗[40]表明分子SIRT3能夠通過ERK- CREB通路促進(jìn)線粒體自噬，證實了激活ERK-CREB緩解NAFLD的可行性?？紤]到CREBH在細(xì)胞代謝和時鐘基因中的雙向調(diào)節(jié)功能，未來研究可探究靶向激活CREBH治療NASH的可行性。

針對時鐘基因下游調(diào)節(jié)蛋白如AMPK、SIRT1以及mPGES-2的激動劑或抑制劑對NASH的療效已被大量研究所證實，但其作用機(jī)制尚在探索過程中。近來有部分研究證實調(diào)控脂質(zhì)代謝和炎癥發(fā)展的因子既受到肝時鐘基因的調(diào)節(jié)，又可通過磷酸化等作用調(diào)控肝時鐘基因的蛋白水平。提示針對此類有反向調(diào)節(jié)作用蛋白的激動劑或抑制劑，其藥物機(jī)制可能與時鐘基因相關(guān)。后續(xù)研究可以開展基因敲除實驗，觀察敲除上游時鐘基因后，下游因子靶向藥物的療效是否減弱或消失，從而進(jìn)一步明確時鐘基因在NASH防治中的作用。

同時，基于時鐘基因可以直接或間接調(diào)控下游控制脂質(zhì)從頭合成、脂肪酸氧化蛋白的表達(dá)水平，未來可開展藥物聯(lián)合使用研究，如探究聯(lián)合使用上游時鐘蛋白激動劑（REVERBA激動劑）和下游蛋白激動劑（AMPK的激動劑）能否增加對NASH的治療作用。

4"""" 小結(jié)

綜上所述，肝臟晝夜節(jié)律紊亂影響著大部分與肝內(nèi)脂質(zhì)代謝、肝臟炎癥相關(guān)的基因表達(dá)，在NASH中發(fā)揮病因?qū)W作用。脂質(zhì)代謝方面，可表現(xiàn)為NASH患者中BMAL1 水平降低，抑制了內(nèi)源性甘油三酯的轉(zhuǎn)運(yùn)，使得脂質(zhì)在肝臟異位沉積；炎癥激活方面，轉(zhuǎn)錄負(fù)性調(diào)節(jié)劑REVERB水平失調(diào)，激活炎癥小體NLRP3，誘導(dǎo)NASH發(fā)展；肝內(nèi)RORα水平降低，促使ROS清除酶活力減低，導(dǎo)致ROS 積聚于肝內(nèi)細(xì)胞等。

隨著研究進(jìn)展，晝夜節(jié)律在代謝性疾病中的新致病機(jī)制日新月異，但僅有少量直接激活或抑制時鐘基因的藥物被提出，且目前暫無研究探索靶向時鐘基因下游蛋白藥物的治療機(jī)制是否與其反向調(diào)節(jié)時鐘基因的表達(dá)有關(guān)。

深入探究時鐘基因在NASH中的防治機(jī)制，及下游蛋白對時鐘基因的反向調(diào)節(jié)作用，對尋找NASH的有效治療靶點具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] HUANG DQ，EL-SERAG HB，LOOMBA R. Global epidemiology of NAFLD-related HCC：Trends，predictions，risk factors and prevention [J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2021，18（4）：223-238. DOI：10. 1038/s41575-020-00381-6.

[2] GRANDER C，GRABHERR F，TILG H. Non-alcoholic fatty liver dis-ease：Pathophysiological concepts and treatment options[J]. Car- diovasc Res，2023，119（9）：1787-1798. DOI： 10.1093/cvr/cvad095.

[3] ZOU HM，GE Y，LEI Q，et al. Epidemiology and disease burden of non-alcoholic steatohepatitis in greater China：A systematic review[J]. Hepatol Int，2022，16（1）：27-37. DOI： 10.1007/s12072-021-10286-4.

[4] National Workshop on Fatty Liver and Alcoholic Liver Disease，Chi-nese Society of Hepatology，Chinese Medical Association；Fatty Liver Expert Committee，Chinese Medical Doctor Association. Guide-lines of prevention and treatment for nonalcoholic fatty liver disease：a 2018 update[J]. J Clin Hepatol，2018，34（5）：947-957. DOI： 10. 3969/j.issn.1001-5256.2018.05.007.

中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組，中國醫(yī)師協(xié)會脂肪性肝病專家委員會.非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018年更新版）[J]. 臨床肝膽病雜志，2018，34（5）：947-957. DOI： 10.3969/j. issn.1001- 5256.2018.05.007.

[5] DUFOUR JF，ANSTEE QM，BUGIANESI E，et al. Current therapies and new developments in NASH[J]. Gut，2022，71（10）：2123-2134. DOI： 10.1136/gutjnl-2021-326874.

[6] GREENWELL BJ，TROTT AJ，BEYTEBIERE JR，et al. Rhythmic food intake drives rhythmic gene expression more potently than the he-patic circadian clock in mice[J]. Cell Rep，2019，27（3）：649-657. DOI： 10.1016/j.celrep.2019.03.064.

[7] KIM HJ，HAN YH，NA H，et al. Liver-specific deletion of RORa aggra-vates diet-induced nonalcoholic steatohepatitis by inducing mito-chondrial dysfunction[J]. Sci Rep，2017，7（1）：16041. DOI： 10.1038/ s41598-017-16077-y.

[8] FAGIANI F，MARINO DD，ROMAGNOLI A，et al. Molecular regula-tions of circadian rhythm and implications for physiology and dis- eases[J]. Signal Transduct Target Ther，2022，7（1）：41. DOI： 10.1038/ s41392-022-00899-y.

[9] VANDENBERGHE A，LEFRANC M，F(xiàn)URLAN A. An overview of the circadian clock in the frame of chronotherapy：From bench to bed- side[J]. Pharmaceutics，2022，14（7）：1424. DOI： 10.3390/pharma- ceutics14071424.

[10] MUKHERJI A，BAILEY SM，STAELS B，et al. The circadian clock and liver function in health and disease[J]. J Hepatol，2019，71（1）：200-211. DOI： 10.1016/j.jhep.2019.03.020.

[11] ABE YO，YOSHITANE H，KIM DW，et al. Rhythmic transcription of Bmal1 stabilizes the circadian timekeeping system in mammals[J]. Nat Commun，2022，13（1）：4652. DOI： 10.1038/s41467-022-32326-9.

[12] SHEN X，ZHANG Y，JI X，et al. Long noncoding RNA lncRHL regu-lates hepatic VLDL secretion by modulating hnRNPU/BMAL1/MTTP axis[J]. Diabetes，2022，71（9）：1915-1928. DOI： 10.2337/db21-1145.

[13] YE CS，ZHANG YJ，LIN SM，et al. Berberine ameliorates metabolic- associated fatty liver disease mediated metabolism disorder and redox homeostasis by upregulating clock genes：Clock and Bmal1 expressions[J]. Molecules，2023，28（4）：1874. DOI： 10.3390/mol- ecules28041874.

[14] LIN HG，WANG L，LIU ZH，et al. Hepatic MDM2 causes metabolic associated fatty liver disease by blocking triglyceride-VLDL se-cretion via ApoB degradation[J]. Adv Sci （Weinh），2022，9（20）：e2200742. DOI： 10.1002/advs.202200742.

[15] PAN XY，ZHANG YX，WANG L，et al. Diurnal regulation of MTP and plasma triglyceride by CLOCK is mediated by SHP [J]. Cell Metab，2010，12（2）：174-186. DOI： 10.1016/j.cmet.2010.05.014.

[16] BOLSHETTE N，IBRAHIM H，REINKE H，et al. Circadian regulation of liver function：From molecular mechanisms to disease pathophysi- ology[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2023，20（11）：695-707. DOI： 10.1038/s41575-023-00792-1.

[17] REINKE H，ASHER G. Crosstalk between metabolism and circadian clocks[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2019，20（4）：227-241. DOI： 10.1038/ s41580-018-0096-9.

[18] GRIFFETT K，HAYES ME，BOECKMAN MP，et al. The role of REV-ERB in NASH[J]. Acta Pharmacol Sin，2022，43（5）：1133-1140. DOI：10.1038/s41401-022-00883-w.

[19] LEE KC，WU PS，LIN HC. Pathogenesis and treatment of non-alco-holic steatohepatitis and its fibrosis[J]. Clin Mol Hepatol，2023，29 （1）：77-98. DOI： 10.3350/cmh.2022.0237.

[20] CHHUNCHHA B，KUBO ER，SINGH DP. Clock protein Bmal1 and Nrf2 cooperatively control aging or oxidative response and redox homeostasis by regulating rhythmic expression of Prdx6[J]. Cells，2020，9（8）：1861. DOI： 10.3390/cells9081861.

[21] LENNICKE C，COCHEME HM. Redox regulation of the insulin signal-ling pathway[J]. Redox Biol，2021，42：101964. DOI：10.1016/j.redox. 2021.101964.

[22] WANG S，LIN YK，YUAN X，et al. REV-ERBa integrates colon clock with experimental colitis through regulation of NF-κB/NLRP3 axis [J]. Nat Commun，2018，9（1）：4246. DOI： 10.1038/s41467-018- 06568-5.

[23] HAN YH，KIM HJ，NA H，et al. RORa induces KLF4-mediated M2 po-larization in the liver macrophages that protect against nonalcoholic steatohepatitis[J]. Cell Rep，2017，20（1）：124-135. DOI： 10.1016/j. celrep.2017.06.017.

[24] KIM HJ，HAN YH，KIM JY，et al. RORa enhances lysosomal acidifi-cation and autophagic flux in the hepatocytes[J]. Hepatol Commun，2021，5（12）：2121-2138. DOI： 10.1002/hep4.1785.

[25] GUAN DY，BAE H，ZHOU DS，et al. Hepatocyte SREBP signaling mediates clock communication within the liver[J]. J Clin Invest，2023，133（8）：e163018. DOI： 10.1172/JCI163018.

[26] NI YH，ZHAO YF，MA LY，et al. Pharmacological activation of REV- ERBa improves nonalcoholic steatohepatitis by regulating intestinal permeability[J]. Metabolism，2021，114：154409. DOI： 10.1016/j. me- tabol.2020.154409.

[27] LEE YS，CHA BY，SAITO K，et al. Nobiletin improves hyperglycemia and insulin resistance in obese diabetic ob/ob mice[J]. Biochem Pharmacol，2010，79（11）：1674-1683. DOI： 10.1016/j.bcp.2010.01.034.

[28] KHAMBU B，YAN SM，HUDA N，et al. Autophagy in non-alcoholic fatty liver disease and alcoholic liver disease[J]. Liver Res，2018，2 （3）：112-119. DOI： 10.1016/j.livres.2018.09.004.

[29] SARAN AR，DAVE S，ZARRINPAR A. Circadian rhythms in the patho-genesis and treatment of fatty liver disease[J]. Gastroenterology，2020，158（7）：1948-1966. DOI： 10.1053/j.gastro.2020.01.050.

[30] FANG CQ，PAN JH，QU N，et al. The AMPK pathway in fatty liver dis- ease[J]. Front Physiol，2022，13：970292. DOI：10.3389/fphys.2022. 970292.

[31] SHI DM，CHEN J，WANG JF，et al. Circadian clock genes in the me-tabolism of non-alcoholic fatty liver disease[J]. Front Physiol，2019，10：423. DOI： 10.3389/fphys.2019.00423.

[32] ZHAO HK，WU L，YAN GF，et al. Inflammation and tumor progres-sion：Signaling pathways and targeted intervention [J]. Signal Transduct Target Ther，2021，6（1）：263. DOI： 10.1038/s41392-021- 00658-5.

[33] SINGH V，UBAID S. Role of silent information regulator 1 （SIRT1）in regulating oxidative stress and inflammation[J]. Inflammation，2020，43（5）：1589-1598. DOI： 10.1007/s10753-020-01242-9.

[34] HAN SC，LI ZZ，HAN F，et al. ROR alpha protects against LPS-in- duced inflammation by down-regulating SIRT1/NF-kappa B pathway [J]. Arch Biochem Biophys，2019，668：1-8. DOI：10.1016/j.abb. 2019.05.003.

[35] CHYAU CC，WANG HF，ZHANG WJ，et al. Antrodan alleviates high- fat and high-fructose diet-induced fatty liver disease in C57BL/6 mice model via AMPK/Sirtl/SREBP-lc/PPARγpathway [J]. Int J Mol Sci，2020，21（1）：360. DOI： 10.3390/ijms21010360.

[36] ZHANG CY，TAN XH，YANG HH，et al. COX-2/sEH dual inhibitor alle-viates hepatocyte senescence in NAFLD mice by restoring au-tophagy through Sirt1/PI3K/AKT/mTOR[J]. Int J Mol Sci，2022，23 （15）：8267. DOI： 10.3390/ijms23158267.

[37] ZHOU B，ZHANG Y，ZHANG F，et al. CLOCK/BMAL1 regulates cir-cadian change of mouse hepatic insulin sensitivity by SIRT1[J]. Hepatology，2014，59（6）：2196-2206. DOI： 10.1002/hep.26992.

[38] ZHONG DD，CAI J，HU C，et al. Inhibition of mPGES-2 ameliorates NASH by activating NR1D1 via heme[J]. Hepatology，2023，78（2）：547-561. DOI： 10.1002/hep.32671.

[39] SUN Y，JIA ZJ，YANG GR，et al. mPGES-2 deletion remarkably en-hances liver injury in streptozotocin-treated mice via induction of GLUT2[J]. J Hepatol，2014，61（6）：1328-1336. DOI：10.1016/j.jhep. 2014.07.018.

[40] LI RB，XIN T，LI DD，et al. Therapeutic effect of Sirtuin 3 on amelio-rating nonalcoholic fatty liver disease：The role of the ERK-CREB pathway and Bnip3-mediated mitophagy[J]. Redox Biol，2018，18：229-243. DOI： 10.1016/j.redox.2018.07.011.

[41] WU SN，LU QL，WANG QL，et al. Binding of FUN14 domain contain-ing 1 with inositol 1，4，5-trisphosphate receptor in mitochondria-as- sociated endoplasmic reticulum membranes maintains mitochon-drial dynamics and function in hearts in vivo[J]. Circulation，2017，136（23）：2248-2266. DOI： 10.1161/CIRCULATIONAHA.117.030235.

[42] CUI AY，DING D，LI Y. Regulation of hepatic metabolism and cell growth by the ATF/CREB family of transcription factors[J]. Diabe-tes，2021，70（3）：653-664. DOI： 10.2337/dbi20-0006.

[43] SHIMIZU-ALBERGINE M，BASU D，KANTER JE，et al. CREBH nor-malizes dyslipidemia and halts atherosclerosis in diabetes by decreasing circulating remnant lipoproteins[J]. J Clin Invest，2021，131（22）：e153285. DOI： 10.1172/JCI153285.

[44] YANG Z，KIM H，ALI A，et al. Interaction between stress responses and circadian metabolism in metabolic disease[J]. Liver Res，2017，1（3）：156-162. DOI： 10.1016/j.livres.2017.11.002.