硫化氫介導(dǎo)的S-巰基化修飾及其化學(xué)檢測(cè)技術(shù)

摘要：自硫化氫作為氣體信號(hào)分子被發(fā)現(xiàn)以來，其在生物體內(nèi)作用機(jī)制的研究取得快速進(jìn)展，并已被證實(shí)可通過介導(dǎo)S-巰基化修飾從而調(diào)控蛋白質(zhì)功能與活性。但因S-巰基化修飾具有高度動(dòng)態(tài)性及復(fù)雜性，如何高效、準(zhǔn)確地檢測(cè)并量化這一修飾過程，已成為影響該領(lǐng)域進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵?；诖?，通過對(duì)現(xiàn)有化學(xué)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行綜述，分析馬來酰亞胺法、改良生物素轉(zhuǎn)換法以及標(biāo)記轉(zhuǎn)換法等技術(shù)，旨在為硫化氫介導(dǎo)的S-巰基化修飾的深入研究提供技術(shù)支持，以推動(dòng)該領(lǐng)域發(fā)展。

關(guān)鍵詞：硫化氫；S-巰基化修飾；化學(xué)檢測(cè)

硫化氫作為氣體信號(hào)分子，近年來在生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，參與調(diào)節(jié)多種生理及病理過程，通過介導(dǎo)S-巰基化修飾來影響蛋白質(zhì)功能及活性。S-巰基化修飾可對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性產(chǎn)生一定影響，并在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、氧化還原調(diào)控等方面充分發(fā)揮作用。隨著研究的深入，硫化氫介導(dǎo)的S-巰基化修飾已成為生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題，為此，需深入探討其化學(xué)檢測(cè)技術(shù)，以期為研究提供支撐［1］。

1S-巰基化修飾

1.1S-巰基化修飾研究現(xiàn)狀

在人類蛋白質(zhì)組中，已有數(shù)百種蛋白質(zhì)被鑒定出具有S-巰基化修飾位點(diǎn)，蛋白質(zhì)涉及多種生物過程，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝調(diào)控、氧化還原反應(yīng)等。且針對(duì)S-巰基化修飾的化學(xué)檢測(cè)技術(shù)也得到快速發(fā)展。例如，基于質(zhì)譜技術(shù)的S-巰基化修飾檢測(cè)方法已取得明顯成就，并廣泛應(yīng)用于各種生物樣本中S-巰基化修飾位點(diǎn)鑒定。新型熒光探針及生物素標(biāo)記技術(shù)也被開發(fā)出來，用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及定量分析S-巰基化修飾水平。此外，研究人員通過質(zhì)譜技術(shù)對(duì)S-巰基化修飾位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，并測(cè)定位點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)修飾水平［2］。

1.2S-巰基化修飾與S-亞硝基化修飾之間的關(guān)系

在蛋白質(zhì)修飾領(lǐng)域，S-巰基化修飾與S-亞硝基化修飾均顯示出對(duì)蛋白質(zhì)功能的重要影響，且此兩種修飾在某些蛋白質(zhì)上共存，可相互調(diào)節(jié)。例如，在一種關(guān)鍵代謝酶中，當(dāng)S-巰基化修飾與S-亞硝基化修飾同時(shí)發(fā)生時(shí)，酶的活性會(huì)受到一定影響。在某種程度上，當(dāng)S-巰基化修飾水平升高時(shí)，S-亞硝基化修飾水平會(huì)相應(yīng)降低，反之亦然。這種相互調(diào)節(jié)的機(jī)制與兩種修飾在生物體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)。當(dāng)心肌細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時(shí)，S-巰基化修飾水平呈上升趨勢(shì)，而S-亞硝基化修飾水平呈下降趨勢(shì)。這表明在細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下，S-巰基化修飾可起到保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷作用，而S-亞硝基化修飾會(huì)受到抑制［3］。

2S-巰基化修飾的化學(xué)檢測(cè)技術(shù)

2.1馬來酰亞胺法

馬來酰亞胺法由約翰霍普金斯大學(xué)的Snyder教授及其團(tuán)隊(duì)于2012年提出，是一種高度靈敏技術(shù)，專門用于檢測(cè)蛋白質(zhì)中的S-巰基化修飾。這種方法基于特定的化學(xué)原理來標(biāo)記和檢測(cè)靶蛋白中半胱氨酸（Cys）上的S-巰基（—SH），觀察其在硫化氫（H2S）作用下形成S-巰基化產(chǎn)物（—SSH）的過程。在實(shí)驗(yàn)中，使用Alexa Fluor 680標(biāo)記的C2N-乙酰馬來酰亞胺熒光探針來特異性地標(biāo)記靶蛋白中經(jīng)過H2S修飾的Cys上的—SH基團(tuán)。這種熒光探針可與—SH形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，從而允許通過熒光信號(hào)來追蹤被修飾蛋白質(zhì)。通過添加二硫蘇糖醇（DTT）這一還原劑，可破壞由H2S形成的二硫鍵（—SSH），導(dǎo)致原本與熒光探針結(jié)合的—SH基團(tuán)從蛋白質(zhì)上脫落。

由于—SH的脫落，熒光探針與蛋白質(zhì)的結(jié)合減弱，導(dǎo)致熒光信號(hào)減弱。通過凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，并使用轉(zhuǎn)印或點(diǎn)印跡法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用凝膠成像儀檢測(cè)PVDF膜上的紅色熒光條帶，觀察熒光信號(hào)的強(qiáng)度變化。如果熒光信號(hào)減弱，可判斷H2S對(duì)靶蛋白進(jìn)行S-巰基化修飾。這種方法的靈敏性及特異性使其成為研究蛋白質(zhì)S-巰基化修飾的主要工具，為深入了解H2S在生物體中的生理功能及作用機(jī)制提供有效支撐。在針對(duì)S-巰基化修飾研究中，研究人員采用馬來酰亞胺法對(duì)蛋白質(zhì)中S-巰基化水平進(jìn)行檢測(cè)，使用含有馬來酰亞胺基團(tuán)的熒光探針與細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)［4］。

2.2改良生物素轉(zhuǎn)換法

利用烷化劑S-甲基甲硫代磺酸鹽（MMTS）來封閉蛋白質(zhì)中未被S-巰基化修飾的半胱氨酸（Cys）上的巰基（—SH）。MMTS通過與相關(guān)未修飾巰基發(fā)生反應(yīng)，以便保證其不會(huì)被標(biāo)記步驟所干擾，利用丙酮去除多余的MMTS，使用生物素HPDP來特異性地標(biāo)記經(jīng)過S-巰基化修飾的Cys殘基上的—SSH基團(tuán)。生物素HPDP可選擇性地與—SSH結(jié)合，為識(shí)別檢測(cè)提供基礎(chǔ)。通過利用生物素與鏈霉親和素之間的高親和力，將生物素標(biāo)記S-巰基化蛋白質(zhì)從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中富集出來，對(duì)檢測(cè)靈敏度及特異性產(chǎn)生影響。

MMTS被發(fā)現(xiàn)可與未修飾的—SH反應(yīng)，也可與—SSH發(fā)生反應(yīng)，在一定程度上將會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。有研究表明，MMTS與—SSH的反應(yīng)速度較快，將MMTS與生成產(chǎn)物的游離—SH反應(yīng)，從而間接地封閉未修飾巰基，而S-巰基化修飾蛋白質(zhì)可通過生物素HPDP進(jìn)行標(biāo)記。因蛋白質(zhì)中S-巰基化水平較高，將引發(fā)較高假陽性率。因此，在使用該方法時(shí)，可結(jié)合質(zhì)譜法，以提高分析的可靠性及準(zhǔn)確性，此外，通過利用基因敲除或抑制特定酶，可對(duì)S-巰基化水平產(chǎn)生影響，從而進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的可靠性驗(yàn)證。

2.3標(biāo)記轉(zhuǎn)換法

由于S-巰基化形成二硫鍵（—SSH）相較于蛋白質(zhì)中其他二硫鍵具有更強(qiáng)親核性，使用巰基封閉劑——甲基磺酰基苯并噻唑（MSBT）或其水溶性類似物MSBT-A來封閉蛋白質(zhì)中未修飾的巰基（—SH）以及部分S-巰基化修飾的巰基（—SSH）。利用MSBT或MSBT-A封閉所有自由巰基（—SH和—SSH），確保其不再參加其他化學(xué)反應(yīng)。隨即引入一個(gè)特殊設(shè)計(jì)標(biāo)記轉(zhuǎn)換試劑——生物素化氰基乙酸甲酯衍生物。這個(gè)試劑兼具親核性和生物素報(bào)告分子，可選擇性地與封閉劑S-巰基化修飾二硫鍵（—SSH）發(fā)生反應(yīng)，與未修飾巰基（—SH）結(jié)合。經(jīng)過標(biāo)記蛋白質(zhì)通過鏈霉親及素磁珠與生物素發(fā)生特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)S-巰基化修飾蛋白質(zhì)富集。利用Western印跡技術(shù)對(duì)富集蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，對(duì)S-巰基化水平進(jìn)行定量評(píng)估。

3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與操作注意事項(xiàng)

3.1細(xì)胞和組織樣品的制備

實(shí)驗(yàn)采用HeLa細(xì)胞系，細(xì)胞在含有胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，繼續(xù)進(jìn)行操作。使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞沉淀，重復(fù)洗滌細(xì)胞3次，以去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)和胰蛋白酶殘留。還應(yīng)使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)收集細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，使每次實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)量保持一致。在本次實(shí)驗(yàn)中，共收集到約1×106個(gè)細(xì)胞。選取小鼠肝臟組織作為實(shí)驗(yàn)材料。在無菌條件下迅速剝離肝臟，并放入預(yù)冷的PBS中清洗。在此基礎(chǔ)上，使用無菌剪刀將肝臟組織剪成約1 mm3的小塊，以便于處理與消化。將剪碎組織放入含有蛋白酶K的消化液中，在37 ℃水浴中消化2 h。消化過程中，每30 min振蕩一次，以確保組織充分消化，還應(yīng)使用70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾消化后的組織懸液，去除未消化的組織碎片。

3.2檢測(cè)過程中的質(zhì)量控制

在進(jìn)行蛋白質(zhì)S-巰基化修飾的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，采取嚴(yán)格質(zhì)量控制措施，選擇經(jīng)過驗(yàn)證、具有高靈敏度和特異性的檢測(cè)方法，以便對(duì)蛋白質(zhì)中S-巰基化修飾水平進(jìn)行識(shí)別。在樣品制備階段，對(duì)每一步操作進(jìn)行精確控制，保證樣品的完整性及代表性。例如在細(xì)胞樣品制備中，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致，細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行收集，收集到的細(xì)胞數(shù)量精確至1×106個(gè)。對(duì)于組織樣品，選取同一部位、大小相近的組織塊進(jìn)行消化處理，最終收集到細(xì)胞數(shù)量約為5×105個(gè)。在檢測(cè)過程中，采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)監(jiān)控的方法，定期使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為監(jiān)控樣品，與待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。

3.3數(shù)據(jù)解讀與分析

硫化氫介導(dǎo)的S-巰基化修飾通過改變蛋白質(zhì)的局部構(gòu)象和活性，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的多種生物學(xué)功能。S-巰基化修飾水平可通過檢測(cè)蛋白質(zhì)中特定半胱氨酸殘基的硫巰基化修飾程度來評(píng)估。S-巰基化修飾對(duì)蛋白質(zhì)活性的影響，可通過比較修飾前后蛋白質(zhì)的生化活性來判斷。還需要關(guān)注S-巰基化修飾與其他蛋白質(zhì)翻譯后修飾相互作用，以及硫化氫水平對(duì)S-巰基化修飾的影響。在化學(xué)檢測(cè)技術(shù)方面，馬來酰亞胺法原理是利用馬來酰亞胺與硫巰基之間的特異性反應(yīng)來檢測(cè)S-巰基化修飾。

改良生物素轉(zhuǎn)換法通過引入生物素標(biāo)記來提高檢測(cè)的特異性和靈敏度。標(biāo)記轉(zhuǎn)換法是一種新興檢測(cè)方法，通過引入標(biāo)記分子來追蹤硫巰基化修飾的過程，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行清洗整理，去除異常值及重復(fù)值。運(yùn)用描述性統(tǒng)計(jì)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析，了解數(shù)據(jù)分布及特征，比較不同組別之間的差異、分析硫化氫水平對(duì)S-巰基化修飾的影響等，使用可視化工具將數(shù)據(jù)以圖表或圖形的形式展示出來，便于直觀理解數(shù)據(jù)之間的關(guān)系及變化趨勢(shì)。

4結(jié)論

硫化氫介導(dǎo)的S-巰基化修飾在生物學(xué)領(lǐng)域中，通過精細(xì)調(diào)控蛋白質(zhì)功能與活性，對(duì)眾多生命過程產(chǎn)生影響。化學(xué)檢測(cè)技術(shù)作為研究S-巰基化修飾主要方法，如馬來酰亞胺法、改良生物素轉(zhuǎn)換法以及標(biāo)記轉(zhuǎn)換法等，為研究提供修飾機(jī)制窗口。隨著技術(shù)不斷進(jìn)步，未來會(huì)有更多高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法投入應(yīng)用，以推動(dòng)S-巰基化修飾的深入研究。

參考文獻(xiàn)：

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