新生大鼠原代軟骨細胞分離和培養(yǎng)方法的改進

［摘 要］ 目的：探討新生大鼠原代軟骨細胞分離和培養(yǎng)的改進方法，以建立高效經(jīng)濟的體外軟骨細胞培養(yǎng)體系。方法：從新生大鼠關(guān)節(jié)中分離原代軟骨細胞，分為過夜消化 （OD） 組和快速消化（RD） 組進行分離， OD 組軟骨細胞采用Ⅱ 型膠原酶過夜消化， RD 組軟骨細胞采用預消化的物理化學消化相結(jié)合的手段分離細胞。采用含0% （空白組1）、1%、2%、4% 和10% 胎牛血清（FBS），0 （空白組2）、0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、1. 0、2 . 0 g·L-1 維生素C （VC） 和0 （空白組3）、0. 5、1. 0、2. 0、4. 0、8. 0、10. 0 μg·L-1 聚乳酸-羥基乙酸共聚體（PLGA） 納米粒子的改良培養(yǎng)液培養(yǎng)軟骨細胞。將杜氏改良Eagle 培養(yǎng)基F12 營養(yǎng)混合液（DMEM/F12） 與含不同濃度FBS、VC 和PLGA 的培養(yǎng)液分別混合，并按照各成分濃度進行相應(yīng)分組。采用細胞計數(shù)儀計數(shù)各組細胞并檢測各組細胞存活率和直徑，采用甲苯胺藍特異性染色法檢測各組細胞形態(tài)表現(xiàn)，采用CCK-8 法檢測各組細胞增殖活性，采用細胞黏附實驗檢測各組細胞黏附率，采用Hoechst/碘化丙碇（PI） 染色檢測各組細胞凋亡情況，采用MTT 法檢測改良培養(yǎng)液培養(yǎng)后各組細胞增殖活性， 將細胞分為DMEM/F12+10%FBS 組（對照組）、DMEM/F12+1%FBS 組、DMEM/F12+1%FBS+0. 4 g·L-1 VC+1 μg·L-1 PLGA 組，采用實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測改良培養(yǎng)液培養(yǎng)后各組細胞中性別決定區(qū)域Y 框轉(zhuǎn)錄因子9（SOX9）、Ⅱ 型膠原α1 鏈（Col2A1）、Ⅹ 型膠原α1 鏈（Col10A1） 和基質(zhì)金屬蛋白酶13 （MMP13）mRNA 表達水平，采用免疫熒光染色檢測改良培養(yǎng)液培養(yǎng)后各組細胞中Ⅱ型膠原（COLⅡ） 和SOX9表達情況。結(jié)果：OD 組原代軟骨細胞存活率小于RD 組，細胞平均直徑大于RD 組。OD 組原代軟骨細胞形態(tài)較大，呈梭形，大多數(shù)細胞出現(xiàn)偽足；RD 組原代軟骨細胞形態(tài)較小，大多數(shù)細胞呈菱形，僅部分細胞出現(xiàn)偽足。2 組原代軟骨細胞經(jīng)甲苯胺藍特異性染色均顯色明顯，但RD 組消化時間較短，軟骨細胞實際培養(yǎng)時間較OD 組縮短9～13 h，原代軟骨細胞形態(tài)更為幼稚。OD 組原代軟骨細胞在培養(yǎng)24 h 時增殖較為緩慢， 培養(yǎng)48 h 時增殖速度升高， 較培養(yǎng)12 h 時增殖活性明顯升高（Plt;0. 01）。RD 組原代軟骨細胞在培養(yǎng)24 h 時增殖稍緩，培養(yǎng)48 h 時增殖速度加快，較培養(yǎng)12 h 時增殖活性明顯升高（Plt;0. 01）；培養(yǎng)24 和48 h 時，與OD 組比較，RD 組原代細胞增殖速度升高（Plt;0. 05）。RD 組軟骨凋亡細胞數(shù)少于OD 組，2 組均無壞死軟骨細胞。大鼠軟骨細胞增殖活性隨著培養(yǎng)液中FBS 濃度升高而升高，與空白組1 比較，培養(yǎng)液中含1%、2%、4% 和10%FBS 時，軟骨大鼠細胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 05）。與空白組2比較，培養(yǎng)液中含0. 2～1. 0 g·L-1 VC 時大鼠軟骨細胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 05），其中含0. 4 g·L-1 VC 時大鼠軟骨細胞增殖活性最高（Plt;0. 01）。與空白組3 比較，培養(yǎng)液中含1～4 μg·L-1 PLGA 時，大鼠軟骨細胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 05），其中含1 μg·L-1 PLGA 時大鼠軟骨細胞增殖活性最高（Plt;0. 05）。與DMEM/F12+10%FBS 組比較， DMEM/F12+1%FBS 組大鼠軟骨細胞中SOX9 mRNA 和COL2A1 mRNA 表達水平均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。與DMEM/F12+10%FBS 組比較， DMEM/F12+1%FBS+0. 4 g·L-1 VC+1 μg·L-1 PLGA 組大鼠軟骨細胞中SOX9 mRNA 和COL2A1 mRNA 表達水平明顯升高（Plt;0. 01）。免疫熒光染色，熒光顯微鏡下DMEM/F12+10%FBS 組部分軟骨細胞中出現(xiàn)COLⅡ綠色熒光信號和SOX9 紅色熒光信號，熒光強度弱；DMEM/F12+1%FBS 組大多數(shù)軟骨細胞中出現(xiàn)COLⅡ綠色熒光信號和SOX9 紅色熒光信號，熒光強度明顯強于DMEM/F12+10%FBS 組；DMEM/F12+1%FBS+0. 4 g·L-1 VC+1 μg·L-1 PLGA組軟骨細胞中均出現(xiàn)COLⅡ綠色熒光信號和SOX9紅色熒光信號，熒光強度較DMEM/F12+10%FBS 組和DMEM/F12+1%FBS 組明顯升高。DMEM/F12+1%FBS 組軟骨細胞中COLⅡ和SOX9 蛋白表達量明顯高于DMEM/F12+10% FBS 組， DMEM/F12+1%FBS+0. 4 g·L-1 VC+1 μg·L-1 PLGA 組軟骨細胞中COLⅡ和SOX9 蛋白表達量明顯高于DMEM/F12+10%FBS組。結(jié)論：改良后的大鼠原代軟骨細胞分離和培養(yǎng)方法可以彌補傳統(tǒng)方法的缺陷，縮短原代軟骨細胞的分離時間，提高原代軟骨細胞的體外培養(yǎng)質(zhì)量。

［關(guān)鍵詞］ 軟骨細胞； 原代細胞培養(yǎng)； 體外技術(shù)； 條件培養(yǎng)基； 血清

［中圖分類號］ Q813. 1 ［文獻標志碼］ A

軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨組織中的重要組成細胞，其主要作用是維持軟骨組織內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定［1］。由于軟骨組織缺乏血管、神經(jīng)和淋巴管等結(jié)構(gòu)分布，一旦損傷很難自愈［2］。骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA） 是最常見的老年退行性疾病，由關(guān)節(jié)軟骨細胞損傷和軟骨細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM） 合成及分解紊亂引起， 以關(guān)節(jié)軟骨慢性進行性變性為特征［3］。原代軟骨細胞的分離和培養(yǎng)是研究OA 的重要途徑［4］。由于軟骨組織結(jié)構(gòu)致密，分離原代軟骨細胞有一定難度。目前研究［5-6］ 最常采用Ⅱ 型膠原酶進行過夜消化（overnightdigestion，OD），但消化耗時較長，因此可能影響原代軟骨細胞的形態(tài)和功能。有研究［7］ 采取順序酶消化的方法，但仍耗時較長。軟骨細胞的體外培養(yǎng)也存在難點。一方面，培養(yǎng)液的營養(yǎng)物質(zhì)需要保障軟骨ECM 的生理特性。軟骨細胞擴增通常在含10% 胎牛血清（fetal bovine serum， FBS） 的培養(yǎng)液中進行［8-10］，但該培養(yǎng)基不利于體外連續(xù)傳代細胞特性的維持。某些改良培養(yǎng)基［11-12］ 由于成分復雜且價格昂貴，難以普及。另一方面，軟骨細胞在體外有去分化趨勢，宜在三維（three-dimensional，3D） 環(huán)境中維持其分化表型［13］。一些專門的3D 培養(yǎng)物，如渦旋培養(yǎng)容器［ 14］ 和材料固相支架［15-16］等，可聚集細胞，但易因營養(yǎng)物質(zhì)受損導致細胞壞死［4］。聚乳酸- 羥基乙酸共聚物［poly （lactic-coglycolicacid）， PLGA］ 是目前應(yīng)用最廣泛的可降解生物材料，具有較好的生物相容性，其納米粒子作為藥物載體對OA 的治療潛力已被研究［17-18］ 證實。目前關(guān)于納米顆粒和培養(yǎng)基添加物對軟骨細胞體外培養(yǎng)的作用的相關(guān)研究較少。本研究對既往原代軟骨細胞的分離方法和培養(yǎng)方法進行改良，建立預消化及物理和化學消化相結(jié)合的方法來縮短分離時間， 并通過降低FBS 濃度和添加適宜濃度維生素C （vitamin C， VC） 和PLGA 納米顆粒共培養(yǎng)的方法來降低不利因素對軟骨細胞培養(yǎng)的影響，為體外軟骨細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的分離和培養(yǎng)提供新思路。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物、主要試劑和儀器 無特定病原體級1～2 日齡SD 大鼠10 只，雌雄不限，購自長春億斯實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物使用許可證號：SYXK （吉） 2023-0010。杜氏改良Eagle 培養(yǎng)基/F12 營養(yǎng)混合液（Dulbecco’s modified Eagle’smedium/nutrient mixture F-12， DMEM/F12） 和Ⅱ型膠原酶購自美國賽默飛世爾科技公司，青-鏈霉素混合液和胰酶購自美國Hyclone 公司，F(xiàn)BS 購自以色列Biological Industries 公司，細胞計數(shù)試劑盒8 （cell counting kit-8， CCK-8）、甲苯胺藍染色液和4'， 6-二脒基-2 苯基吲哚（4'， 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI） 染色液購自北京索萊寶科技有限公司，抗Ⅱ型膠原蛋白（anti-collagen typeⅡ，Anti-COL Ⅱ） 小鼠抗大鼠一抗購自美國NovusBiologicals 有限責任公司，抗性別決定區(qū)Y 框蛋白9 （anti-sex determining region Y box protein 9，Anti-SOX9） 兔抗大鼠一抗購自英國Abcam 公司，抗小鼠二抗和抗兔二抗購自上海愛必信生物科技有限公司， Hoechst 33342/ 碘化丙啶（propidiumiodide，PI） 雙染試劑盒購自北京蘭杰柯科技有限公司， VC 購自北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司，PLGA （LA/GA=50/50， 相對分子質(zhì)量100 000）購自上海源葉生物科技有限公司，RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海吐露港生物科技有限公司，大鼠β-肌動蛋白內(nèi)參引物購自生工生物工程（上海） 股份有限公司。CO2 恒溫培養(yǎng)箱和臺式高速冷凍型微量離心機購自賽默飛世爾科技公司，倒置生物顯微鏡和倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司， 瑞沃德C100 細胞計數(shù)儀購自深圳瑞沃德生命科技有限公司， MX3000P 實時熒光定量PCR （real-timefluorescence quantitative PCR， RT-qPCR） 儀購自美國安捷倫科技有限公司，酶標儀購自瑞士帝肯公司， 超聲波清洗機購自深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司，超凈臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1. 2 大鼠軟骨組織分離、分組和處理方式 采用CO2窒息法處死大鼠，75% 乙醇浸泡15 min 后轉(zhuǎn)移至超凈臺中。去除大鼠后肢膝關(guān)節(jié)皮膚和肌肉，暴露 關(guān) 節(jié) 軟 骨。分 離 關(guān) 節(jié) 軟 骨，磷 酸 鹽 緩 沖 液（phosphate buffered saline，PBS） 清洗2次，采用2只1 mL 注射器針頭機械破碎軟骨組織，其中一只針頭固定組織，另一只針頭斜面切割組織。將破碎后的軟骨組織轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)皿中，分為OD 組和快速消化（rapid digestion，RD） 組。OD 組軟骨組織中按照1∶1 的比例加入Ⅱ型膠原酶和含10% FBS 的DMEM/F12， 然后置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h。RD 組軟骨組織加入胰酶預消化15 min，吸棄胰酶，培養(yǎng)液清洗2 次后按照1∶1 的比例加入Ⅱ型膠原酶和含10%FBS 的DMEM/F12，置于離心管中每隔1 h 超聲15 s， 共消化3 h。2 組細胞隨后轉(zhuǎn)移至離心管中， 采用細胞過濾器（孔徑70 μm） 過濾軟骨組織， 1 000 r·min-1 離心5 min。加入培養(yǎng)液重懸細胞， 接種于培養(yǎng)瓶中， 置于37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1. 3 2組軟骨細胞的存活率和直徑檢測 取2組原代分離后的軟骨細胞，移液槍反復吹吸均勻后稀釋50 倍，與0. 4% 臺盼藍染色液等比例混合，制備成細胞懸液稀釋液。在細胞計數(shù)板中加入10 μL 細胞懸液稀釋液，采用細胞計數(shù)儀檢測2 組分離的原代軟骨細胞存活率和直徑。細胞存活率= 存活細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1. 4 甲苯胺藍染色觀察 2 組軟骨細胞形態(tài)表現(xiàn) 取原代分離的軟骨細胞，以1×105 mL-1 的密度接種于24 孔細胞培養(yǎng)板中， 每孔500 μL， 培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d 后。取出24 孔細胞培養(yǎng)板，吸干培養(yǎng)基，加入PBS，清洗2 次，每次1 min。再向24 孔細胞培養(yǎng)板加入甲苯胺藍染液預染10 min，每孔200 μL。預染后， 每孔滴加等量蒸餾水吹打混勻， 靜置30 min 復染。隨后每孔加入蒸餾水清洗2 次，每次30 s。最后加入適量蒸餾水完全浸沒軟骨細胞，在顯微鏡下觀察2 組軟骨細胞形態(tài)表現(xiàn)。

1. 5 CCK-8法檢測 2組軟骨細胞增殖活性 取原代分離后的軟骨細胞，以1×105 mL-1 的密度接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中， 每孔100 μL， 待軟骨細胞成功貼壁后， 培養(yǎng)12、24 和48 h 時， 每孔加入10 μL CCK-8 試劑， 混勻后放入培養(yǎng)箱孵育2 h。采用酶標儀檢測于450 nm 波長處檢測吸光度（A）值，并計算軟骨細胞增殖活性。細胞增殖活性=（實驗孔A 值- 空白孔A 值） / （對照孔A 值-空白孔A 值） ×100%。

1. 6 2組軟骨細胞黏附率檢測 取培養(yǎng)至第2天的原代細胞，在顯微鏡下觀察其密度達到80%～90%時，在貼壁的軟骨細胞中加入適量胰酶進行消化，待軟骨細胞呈現(xiàn)懸浮狀態(tài)時加入培養(yǎng)液終止消化，取軟骨細胞懸液計數(shù)。再在24 孔細胞培養(yǎng)板中接種軟骨細胞，密度為1×105 mL-1，每孔1 mL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)1. 5 h。吸干孔板中的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)至15 mL 離心管中，采用1 mL 培養(yǎng)液洗滌孔板1 次，與上述培養(yǎng)液混合， 1 000 r·min-1 離心5 min， 吸棄上清，加入1 mL 培養(yǎng)液重懸離心管底部的細胞沉淀， 吹打均勻后與細胞計數(shù)液以1∶ 100 比例混合，制成細胞懸液稀釋液， 采用細胞計數(shù)板進行計數(shù)。重復操作3 次， 計算軟骨細胞黏附率［19］。軟骨細胞黏附率= （細胞總數(shù)- 脫落細胞數(shù)） /細胞總數(shù)×100%。

1. 7 Hoechst/PI 染色法檢測 2 組軟骨細胞凋亡情況 取原代分離的軟骨細胞，接種于含不同成分培養(yǎng)液的24 孔細胞培養(yǎng)板， 密度為1×105 mL-1，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d。吸干培養(yǎng)基，PBS 緩沖液洗滌2次。在含1 mL PBS 緩沖液的離心管中加入5 μLHoechst 染色液和5 μL PI 染色液，采用移液槍反復吹打混勻后加入24 孔細胞培養(yǎng)板中，4 ℃避光孵育15 min，PBS 緩沖液洗滌1 次。在熒光顯微鏡下檢測紅色熒光和藍色熒光觀察并采集圖像。正常細胞表現(xiàn)為低藍色/低紅色（Hoechst+/PI+），凋亡細胞表現(xiàn)為高藍色/低紅色（Hoechst++/PI+）， 壞死細胞表現(xiàn)為低藍色/高紅色（Hoechst+/PI++）。

1. 8 MTT 法檢測含不同成分培養(yǎng)液中軟骨細胞的增殖活性 取原代分離的細胞，以 1×105 mL-1的密度接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL細胞懸液和含0% （空白組1）、0. 5%、1. 0%、2. 0%、4. 0% 和10. 0% 的FBS， 0 （空白組2）、0. 1 、0. 2 、0. 4 、0. 8 、1. 0 、2. 0 g·L-1 VC 及0 （ 空白組3）、0. 5 、1. 0 、2. 0 、4. 0 、8. 0 、10. 0 μg·L-1 PLGA 納米粒子的培養(yǎng)液， 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。每孔加入10 μL MTT （5 g·L-1），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h 后徹底吸干上清， 每孔的甲臜顆粒采用100 μL 二甲基亞砜溶解， 采用酶標儀檢測570 nm 處A 值，并依據(jù)“1. 5”中計算公式計算各組軟骨細胞增殖活性。

1. 9 RT-qPCR 法檢測軟骨細胞中目的基因表達水平 將 細 胞 分 為 DMEM/F12+10%FBS 組、DMEM/F12+1%FBS 組、DMEM/F12+1%FBS+0. 4 g·L-1 VC+1 μg·L-1 PLGA 組。取各組培養(yǎng)48 h 后的細胞， 分別加入1 mL TRIzol RNA 提取液，充分裂解，每管加入200 μL 氯仿試劑，4 ℃下、13 000 r·min-1 離心15 min。在新的離心管中加入200 μ L 上層水相， 加入等量預冷異丙醇，混勻，置于冰上5 min， 4 ℃ 、13 000 r·min-1 離心5 min。棄上清，向沉淀中加入500 μL 75% 乙醇（由RNasefree ddH2O 與無水乙醇配制）， 混勻， 洗滌沉淀，4 ℃、13 000 r·min-1 離心5 min。棄上清， 盡量吸干乙醇，晾干沉淀，根據(jù)離心管底部RNA 沉淀的量加入20～100 μL RNase free ddH2O 溶解沉淀。測量提取總RNA 濃度， 按照RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照FastStartUniversal SYBR Green Master （Rox） 試劑盒說明書進行RT-qPCR 檢測， 反應(yīng)條件為95 ℃ 、15 s，60 ℃、60 s，共40 個循環(huán)，以大鼠β-肌動蛋白為內(nèi)參重復3 次，采用2-ΔΔCT 法計算2 組軟骨細胞中性別決定區(qū)域Y 框轉(zhuǎn)錄因子9 （sex-determining regionY-box 9， SOX9）、Ⅱ 型膠原α1 鏈（collagen typeⅡ alpha 1 chain， COL2A1）、Ⅹ 型 膠 原 α1 鏈（collagen type Ⅹ alpha 1 chain，COL10A1） 和基質(zhì)金屬蛋白酶13 （matrix metallopeptidase 13，MMP13） mRNA 表達水平。引物序列見表1。

1. 10 免疫熒光法觀察軟骨細胞中COLⅡ和SOX9表 達 情 況 取 原 代 分 離 的 軟 骨 細 胞 ， 接 種 于10%FBS、1%FBS、1%FBS+0. 4 g·L-1 VC+1 μg·L-1 PLGA 3 種不同成分培養(yǎng)液的24 孔細胞培養(yǎng)板， 加入 DMEM/F12， 分為DMEM/F12+10%FBS 組、DMEM/F12+1%FBS 組和DMEM/F12+1%FBS+0. 4 g·L-1 VC+1 μg·L-1 PLGA 組，密度為1×105 mL-1，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d。吸棄一 半 培 養(yǎng) 液， 加 入 200 μ L 4% 多 聚 甲 醛（paraformaldehyde， PFA） 預固定5 min。吸棄液體， 加入300 μL 4% PFA 固定30 min。吸棄固定液后，每孔加入1 mL PBS 緩沖液洗滌3 次，每次3 min。每孔加入500 μL 封閉通透液（5% 牛血清白蛋白與0. 3% Triton 1∶ 1 混合） 室溫避光封閉40 min。PBS 緩沖液洗滌3 次，每次3 min。加入稀釋后的SOX-9 （1∶ 250） 和Ⅱ 型膠原（type Ⅱcollagen， COLⅡ）（1∶ 500） 一抗， 將24 孔細胞培養(yǎng)板置于濕盒中，置于4℃冰箱孵育過夜。PBS緩沖液洗滌3 次， 每次3 min。加入稀釋后的抗兔（1∶500） 和抗小鼠（1∶500） 標記二抗避光孵育1 h。PBS 緩沖液洗滌3 次，每次3 min。每孔加入200 μL DAPI 染液避光染色8 min。PBS 緩沖液洗滌3 次，每次3 min，于倒置熒光顯微鏡下觀察各組軟骨細胞中COLⅡ和SOX9 表達情況，以熒光強度代表細胞中COLⅡ和SOX9 表達量。

1. 11 統(tǒng)計學分析 采用 GraphPad Prism 8統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。2 組軟骨細胞增殖活性、黏附率和各組細胞中SOX9、COL2A1、COL10A1 和MMP13 mRNA 表達水平均符合正態(tài)分布，以x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用Tukey 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2. 1 2組軟骨細胞存活率和直徑 OD組原代軟骨細胞存活率為80%， 細胞平均直徑為10. 50 μm；RD 組原代軟骨細胞存活率為96%，細胞平均直徑為9. 68 μm，提示RD 組分離的原代軟骨細胞存活率更高，且大小更為幼稚。見圖1。

2. 2 2組軟骨細胞形態(tài)表現(xiàn) OD組原代軟骨細胞形態(tài)較大，呈梭形，大多數(shù)細胞出現(xiàn)偽足；RD 組原代軟骨細胞形態(tài)較小，大多數(shù)細胞呈菱形，僅部分細胞出現(xiàn)偽足。2 組原代軟骨細胞經(jīng)甲苯胺藍特異性染色均顯色明顯，但RD 組消化時間較短，軟骨細胞實際培養(yǎng)時間較OD 組縮短9～13 h，原代軟骨細胞形態(tài)更為幼稚。見圖2。

2. 3 2組軟骨細胞增殖活性 OD組原代軟骨細胞在培養(yǎng)24 h 時增殖較為緩慢，培養(yǎng)48 h 時增殖速度升高， 較培養(yǎng)12 h 時增殖活性明顯升高（Plt;0. 01）。RD 組原代軟骨細胞在培養(yǎng)24 h 時增殖速度稍緩，培養(yǎng)48 h 時增殖速度升高，較培養(yǎng)12 h 時增殖活性明顯升高（Plt;0. 01）。在培養(yǎng)24 和48 h 時，與OD 組比較，RD 組原代細胞增殖速度升高（Plt;0. 05）。RD 組原代軟骨細胞黏附率（89. 17%±8. 04%） 比OD 組（88. 33%±2. 89%） 略有降低，組間比較差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）。見圖3。

2. 4 2組軟骨細胞凋亡情況 2組軟骨細胞多為正常細胞（Hoechst+/PI+）。RD 組軟骨凋亡細胞（Hoechst++/PI+） 數(shù)少于OD 組， 2 組均無壞死軟骨細胞（Hoechst+/PI++）。見圖4。

2. 5 含不同濃度 FBS、VC 和 PLGA 的培養(yǎng)液培養(yǎng)后大鼠軟骨細胞增殖活性 大鼠軟骨細胞增殖活性隨著培養(yǎng)液中FBS 濃度升高而升高， 與空白組1 比較，培養(yǎng)液中含 1. 0%、2. 0%、4. 0% 和10. 0%FBS 組軟骨大鼠細胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 05）， 見圖5A。與空白組2 比較， 培養(yǎng)液中含0. 2～1. 0 g·L-1 VC 組大鼠軟骨細胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 05）， 其中含0. 4 g·L-1 VC 時大鼠軟骨細胞增殖活性最高（Plt;0. 01）， 見圖5B。與空白組3 比較， 含1. 0～4. 0 μg·L-1 PLGA 培養(yǎng)液組大鼠軟骨細胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 05）， 其中含1. 0 μg·L-1 PLGA 培養(yǎng)液時大鼠軟骨細胞增殖活性最高（Plt;0. 05），見圖5C。

2. 6 含不同濃度FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)后大鼠軟骨細胞中SOX9、COL2A1、COL10A1和 MMP13 mRNA表 達 水 平 與 DMEM/F12+10%FBS 組 比 較，DMEM/F12+1%FBS 組大鼠軟骨細胞中SOX9mRNA 和COL2A1 mRNA 表達水平均明顯升高（Plt;0. 05 或 Plt;0. 01）， COL10A1 和 MMP13mRNA 表達水平略有升高， 但差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）。見圖6。因此在含有1%FBS 的培養(yǎng)中添加0. 4 g·L-1 VC 和1. 0 μg·L-1 PLGA 對現(xiàn)有的培養(yǎng)液進行進一步改進。

2. 7 改良培養(yǎng)液培養(yǎng)后大鼠軟骨細胞中 SOX9、COL2A1、COL10A1 和 MMP13 mRNA 表達水平 與DMEM/F12+10%FBS 組比較， DMEM/F12+1%FBS+0. 4 g·L-1 VC+1. 0 μg·L-1 PLGA 組大鼠軟骨細胞中SOX9 mRNA 和COL2A1 mRNA表 達 水 平 明 顯 升 高（Plt;0. 01）， COL10A1 和MMP13 mRNA 表達水平略有降低，但差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）。見圖7。

2. 8 改良培養(yǎng)液培養(yǎng)后軟骨細胞中 COLⅡ和SOX9表達 經(jīng)COLⅡ免疫熒光染色，軟骨細胞的細胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光， 經(jīng)SOX9 免疫熒光染色細胞核呈現(xiàn)紅色熒光； 經(jīng)DAPI 染色細胞核呈現(xiàn)藍色熒光， 可定位軟骨細胞核。熒光顯微鏡下可見DMEM/F12+10%FBS 組部分軟骨細胞中出現(xiàn)COLⅡ綠色熒光信號和SOX9 紅色熒光信號，熒光強度弱。DMEM/F12+1%FBS 組大多數(shù)軟骨細胞中出現(xiàn)COLⅡ綠色熒光信號和SOX9 紅色熒光信號，熒光強度明顯強于DMEM/12+10%FBS 組。DMEM/F12+1%FBS+0. 4 g·L-1 VC+1 μg·L-1PLGA 組軟骨細胞中均出現(xiàn)COLⅡ綠色熒光信號和SOX9 紅色熒光信號， 可見熒光強度較DMEM/F12+10%FBS 組和DMEM/F12+1%FBS 組明顯升高。熒光圖像分析結(jié)果顯示：DMEM/F12+1%FBS 組軟骨細胞中COLⅡ和SOX9 蛋白表達量明顯高于DMEM/F12+10%FBS組，DMEM/F12+1%FBS+0. 4 g·L-1 VC+1 μg·L-1 PLGA 組軟骨細胞中COLⅡ和SOX9 蛋白表達量明顯高于DMEM/F12+10%FBS 組。見圖8。

3 討 論

軟骨細胞具有維持ECM 合成代謝和分解代謝動態(tài)平衡的作用。ECM 的主要成分是膠原蛋白和蛋白聚糖。透明軟骨的特征是存在聚集蛋白聚糖（aggrecan， ACAN） 和COLⅡ ， ACAN 單個分子上存在陰離子電荷，確保聚集體的產(chǎn)生。甲苯胺藍染料中的陽離子與其結(jié)合， 使軟骨細胞特異性染色。SOX9 是調(diào)控軟骨分化和軟骨細胞特異性基質(zhì)基因表達的一種關(guān)鍵因子，可以直接調(diào)控COL2A1的表達［20-21］。COL2A1 是一種軟骨細胞特異性基質(zhì)基因，可以編碼COL2A1［21-22］。在OA 中，軟骨細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉蚀筌浌羌毎屠w維軟骨細胞。肥大軟骨細胞的主要特征是表達Ⅹ 型膠原蛋白（collagentype Ⅹ，COLⅩ） 和MMP13 等相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子［23］。COL10A1 是軟骨細胞肥大和骨化的特征性基因，編碼COLⅩ，促進軟骨細胞分化成熟［24］。MMP13通 過 降 解 COLⅡ ， 破 壞 軟 骨 細 胞 基 質(zhì)［24-25］。COL10A1 和MMP13 廣泛用作軟骨細胞炎癥標志基因［26］。本研究結(jié)果顯示：通過RD 分離后得到的軟骨細胞具有甲苯胺藍特異性染色，而改良培養(yǎng)液培養(yǎng)后，軟骨細胞中特異性基因SOX9 和COL2A1mRNA 呈 高 表 達， 炎 癥 相 關(guān) 基 因 COL Ⅹ 和MMP13 mRNA 呈低表達，SOX9 和COLⅡ蛋白高表達，表明改良分離和培養(yǎng)方法后得到的細胞為軟骨細胞，且尚未發(fā)生炎癥變化。

原代軟骨細胞分離方法的主要缺陷在于消化時間過長。本研究采用RD 法將消化時間從原來的12～16 h 縮短至3 h， 有效分離了原代軟骨細胞，明顯提高了原代軟骨細胞的存活率和增殖活性，降減少了細胞凋亡。RD 法分離出的軟骨細胞形態(tài)更為幼稚，大部分細胞仍保持菱形。雖然RD 法使得原代軟骨細胞的黏附率稍有下降，但是差異無統(tǒng)計學意義。本研究采用RD 法可以有效改善分離細胞時間長的缺陷，明顯提高原代軟骨細胞的質(zhì)量。

原代軟骨細胞培養(yǎng)方法的主要缺陷在于培養(yǎng)液所含有的FBS 可能對軟骨細胞具有不良影響， 包括成分定義不清楚、不同批次之間存在差異和潛在傳播動物病原體等，可能加速軟骨細胞去分化，對軟骨細胞的形態(tài)和功能產(chǎn)生影響，使軟骨細胞的特異性產(chǎn)物表達水平下降［10］。本研究通過降低培養(yǎng)液FBS 濃度，從而對現(xiàn)有培養(yǎng)方法進行初步改良，結(jié) 果 顯 示：與 含 10%FBS 的 培 養(yǎng) 液 比 較， 含1%FBS 的培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)含量降低，軟骨細胞增殖活性稍有降低，但不明顯。軟骨細胞中特異性產(chǎn)物SOX9 和COL2A1 mRNA 及蛋白表達水平明顯提高。FBS 濃度降低后， 細胞中COL10A1 和MMP13 表達水平略微升高。為了降低FBS 濃度降低導致的營養(yǎng)不足和炎癥風險，在含1%FBS 的培養(yǎng)液中添加VC 和PLGA 納米顆粒進行改良。VC是一種常見的抗氧化劑，研究［27-28］ 證實：VC 對軟骨細胞基因表達起重要調(diào)控作用，可以促進軟骨細胞增殖。PLGA 具有良好的生物相容性和降解性，研究［29］ 顯示：陽離子PLGA 微載體有利于軟骨細胞增殖和附著，可增加與培養(yǎng)液的接觸面積。將體外培養(yǎng)的軟骨細胞和PLGA 納米顆粒共培養(yǎng)，可能有利于對人體軟骨組織缺損部位進行種子細胞及納米材料的共移植。在含1%FBS 的培養(yǎng)液中添加0. 4 g·L-1 VC 和1 μg·L-1 PLGA 彌補了培養(yǎng)液降低FBS 濃度帶來的細胞增殖活性降低的問題。本研究結(jié)果顯示：改良培養(yǎng)基培養(yǎng)后，與DMEM/F12+10%FBS 組比較， DMEM/F12+1%FBS+0. 4 g·L-1 VC+1 μg·L-1 PLGA 組細胞中SOX9 和COL2A1 表達水平明顯升高，COL10A1 和MMP13表達水平略有降低，說明改良培養(yǎng)基延緩了軟骨細胞的分化成熟與炎癥表達，改善了營養(yǎng)缺乏問題，促進了軟骨細胞增殖，維持了軟骨細胞活力。

綜上所述，本研究改進了原代軟骨細胞的分離和培養(yǎng)方法，縮短了原代軟骨細胞分離時間，提高了分離效率，降低了培養(yǎng)成本，提高了軟骨細胞質(zhì)量，為軟骨細胞原代培養(yǎng)實驗提供了一個模擬體內(nèi)環(huán)境的體外系統(tǒng)，為軟骨細胞的特性及機制研究和軟骨細胞相關(guān)疾病研究提供了科學依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：楊丹聃和陳驕陽參與論文實驗設(shè)計和實施、數(shù)據(jù)的獲取和分析、論文的撰寫及修改，王馨珩和趙澤彤參與論文的修改，潘瑩參與實驗數(shù)據(jù)的獲取，高長曌和薛百功參與實驗設(shè)計和論文撰寫指導。

*陳驕陽，吉林大學第二臨床醫(yī)學院2021 級臨床醫(yī)學專業(yè)

△趙澤彤，吉林大學口腔醫(yī)學院2022 級口腔醫(yī)學專業(yè)

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