澳洲堅(jiān)果果仁MiMYB44L基因克隆與結(jié)構(gòu)功能分析

摘 要：" 澳洲堅(jiān)果（Macadamia integrifolia）是一種具有高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的常綠堅(jiān)果樹，其果仁富含脂肪酸和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分。為鑒定澳洲堅(jiān)果果仁中與營養(yǎng)成分形成的相關(guān)基因，該研究采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因克隆、熒光定量和生物信息學(xué)等技術(shù)從澳洲堅(jiān)果果仁營養(yǎng)成分含量有顯著差異的品種‘桂熱1號(hào)’和‘A4’的果仁轉(zhuǎn)錄組中挖掘調(diào)控基因。結(jié)果表明：（1）轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)‘桂熱1號(hào)’相比‘A4’果仁有上調(diào)基因1 667個(gè)，下調(diào)基因1 798個(gè)；KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要在淀粉和糖代謝、氨基酸生物合成和碳代謝路徑中。（2）發(fā)現(xiàn)一個(gè)差異表達(dá)基因gene-LOC122077931，其編碼R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子MYB44L，并采用RACE技術(shù)在‘桂熱1號(hào)’果仁中克隆了MiMYB44L，其全長(zhǎng)1 165 bp，ORF長(zhǎng)度999 bp，編碼332個(gè)氨基酸。（3）生物信息學(xué)分析證明MiMYB44L蛋白含有R2R3-MYB家族特征的SANT結(jié)構(gòu)域，不含有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，含有磷酸化位點(diǎn)。（4）測(cè)定了10個(gè)澳洲堅(jiān)果品種果仁中蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)MiMYB44L在澳洲堅(jiān)果高蛋白質(zhì)含量品種中的表達(dá)量顯著高于低蛋白質(zhì)含量品種，整體相關(guān)系數(shù)為0.54，達(dá)到極顯著水平。該研究結(jié)果為深入解析MiMYB44L在澳洲堅(jiān)果營養(yǎng)成分形成中的調(diào)控作用機(jī)制提供了理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞： 澳洲堅(jiān)果， MiMYB44L， 果仁， 結(jié)構(gòu)， 表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：" Q943"文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：" A

文章編號(hào)：" 1000-3142（2024）12-2232-10

Cloning， structural and function analysis of MiMYB44L"gene in kernels of Macadamia integrifolia

XU Peng， TAN Qiujin， SONG Haiyun， ZHENG Shufang， YANG Xiaozhou， HUAN Xiuju，ZHANG Tao， ZHOU Chunheng， WEI Yuanrong， WANG Wenlin*

（ Guangxi South Subtropical Agricultural Science Research Institute， Chongzuo 532400， Guangxi， China ）

Abstract：" Macadamia nut （Macadamia integrifolia） is an evergreen nut tree with high economic value. Its kernel is rich in nutrients such as fatty acid and protein， etc. In order to further explore the main regulatory genes related to nutrient formation in M. integrifolia kernels， transcriptomics， gene cloning， fluorescence quantification PCR and bioinformatics techniques were used to screen potential regulatory genes from the kernel transcriptomes of ‘Guire No. 1’ and ‘A4’， which have significantly different nutrient contents in M. integrifolia kernels. The results were as follows： （1） Transcriptome analysis showed that 1 667 genes were up-regulated and 1 798 genes down-regulated in ‘Guire No. 1’ kernel compared with those of ‘A4’ kernel; KEGG enrichment analysis showed that the differential genes were mainly in starch and glucose metabolism， amino acid biosynthesis and carbon metabolism pathways. （2） A significant differentially expressed gene gene-LOC122077931 encoding the R2R3-MYB transcription factor MYB44L was discovered. The MiMYB44L gene was cloned in kernels of" ‘Guire No. 1’ using RACE technology， which was 1 165 bp in length， 999 bp in ORF in length， and encoded 332 amino acids. （3） Bioinformatics analysis confirmed the presence of the SANT domain in the MiMYB44L protein， a feature of the R2R3-MYB family. The protein lacked both a signal peptide and a transmembrane domain but featured phosphorylation sites. （4） The protein contents in kernels of 10 M. integrifolia varieties were determined. And it was found that the expression of MiMYB44L gene in M. integrifolia varieties with high protein content was significantly higher than that in varieties with low protein content， and the overall correlation coefficient was 0.54， reaching a extremely significant level. The results of this study provide theoretical guidance for in-depth analysis of the regulatory mechanism of MiMYB44L gene in the formation of protein content in M. integrifolia.

Key words： Macadamia integrifolia， MiMYB44L， kernel， structure， expression analysis

澳洲堅(jiān)果（Macadamia integrifolia）是一種高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的常綠堅(jiān)果樹，原產(chǎn)于澳大利亞東海岸的熱帶雨林。因其優(yōu)質(zhì)的可食用性，在世界各地的熱帶和亞熱帶無霜區(qū)被進(jìn)行商業(yè)種植（Yang et al.， 2023）。澳洲堅(jiān)果果仁的主要成分是脂肪、蛋白和多種微量元素等（Wojdylo et al.， 2022）。前期研究表明，澳洲堅(jiān)果果仁的營養(yǎng)成分含量在不同澳洲堅(jiān)果種質(zhì)之間變化較大，果仁內(nèi)的變異系數(shù)由高到低依次為Ca＞Zn＞P＞Mg＞可溶性糖＞Fe＞蛋白質(zhì)＞氨基酸＞K＞脂肪，主成分分析可將主要營養(yǎng)成分聚為4個(gè)，即氨基酸組分因子、礦物質(zhì)因子、脂肪因子、蛋白質(zhì)因子，累積貢獻(xiàn)率為87.91%（譚秋錦等，2021a）?？梢?，蛋白組分在澳洲堅(jiān)果果實(shí)營養(yǎng)成分中具有重要作用。然而，在澳洲堅(jiān)果研究中，對(duì)脂肪酸（Richards et al.， 2020）和微量元素營養(yǎng)的研究較多（de Silva et al.， 2023），但對(duì)蛋白質(zhì)含量及其調(diào)控的研究較少。蛋白質(zhì)作為重要的生命大分子，除了提供營養(yǎng)價(jià)值外，還作為轉(zhuǎn)錄因子（Zumajo-Cardona et al.， 2023）、酶（Gabrielli et al.， 2022）、蛋白復(fù)合體（Gisriel et al.， 2022）參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆等多種生物過程。

其中，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子MYB44參與逆境抗性和多種植物激素傳導(dǎo)調(diào)控，是植物激素信號(hào)交互的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（Wang et al.， 2023）。在擬南芥基因組中，AtMYB44屬于第22亞組，保守基序?yàn)?2.1 （TGLYMSPxSP）和22.2 （GxFMxVVQEMIxxEVRSYM）（Stracke et al.， 2001），通過與PYL9、WRKY70等蛋白結(jié)合從而調(diào)控?cái)M南芥等植物的抗逆反應(yīng)、參與乙烯和茉莉酸等激素信號(hào)傳導(dǎo)過程，其自身亦受轉(zhuǎn)錄和翻譯后調(diào)節(jié)。例如，AtMYB44提高擬南芥對(duì)桃蚜的抗性是通過激活乙烯信號(hào)途徑EIN2來實(shí)現(xiàn)（Liu et al.， 2011）；MYB44競(jìng)爭(zhēng)性抑制MYB340-bHLH2-NAC56復(fù)合體形成進(jìn)而調(diào)控紫瓤甘薯花青素的生物合成（Wei et al.， 2020）；AtMYB44啟動(dòng)子區(qū)域核小體密度低，便于多種信號(hào)的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控其表達(dá)（Nguven amp; Cheong， 2018）。在調(diào)控其他蛋白的相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)牡丹PsMYB44通過抑制二氫黃酮醇-4-還原酶基因表達(dá)負(fù)調(diào)節(jié)花瓣斑點(diǎn)分布（Luan et al.， 2023）。來自中國野生紫葡萄的VaMYB44轉(zhuǎn)錄因子負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)基因擬南芥和葡萄植株的耐寒性（Zhang et al.， 2022）。綜上可知，MYB44轉(zhuǎn)錄因子可能參與澳洲堅(jiān)果中果實(shí)營養(yǎng)成分含量的調(diào)控。本研究以廣西壯族自治區(qū)重要經(jīng)濟(jì)果樹澳洲堅(jiān)果為研究對(duì)象，依托澳洲堅(jiān)果高低果仁蛋白質(zhì)含量差異顯著品種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和澳洲堅(jiān)果‘桂熱1號(hào)’品種基因組數(shù)據(jù)（Xia et al.， 2022），采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因克隆和生物信息學(xué)等方法，通過鑒定果仁中差異顯著基因的結(jié)構(gòu)與功能，擬探討以下問題：（1）澳洲堅(jiān)果果仁中與營養(yǎng)成分形成相關(guān)的主效調(diào)控基因是哪些種類；（2）基因具有哪些特異性的結(jié)構(gòu)與功能；（3）不同澳洲堅(jiān)果品種果仁蛋白質(zhì)含量積累與基因表達(dá)量的關(guān)系如何。本研究對(duì)MYB轉(zhuǎn)錄因子22亞家族成員MiMYB44L進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析、表達(dá)分析以及表達(dá)量與蛋白質(zhì)含量之間的相關(guān)分析等，為深入開展澳洲堅(jiān)果營養(yǎng)成分的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2021—2023年在廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源圃進(jìn)行。該地區(qū)屬南亞熱帶季風(fēng)氣候，熱量豐富，雨量充沛，日照充足。選取不同果仁蛋白質(zhì)含量差異顯著的10個(gè)品種‘JW’‘SH’‘A16’‘桂熱1號(hào)’‘B7’‘B4’‘皇家大果’‘B3’‘A38’和‘A4’果仁為材料測(cè)定蛋白質(zhì)含量并提取RNA。根據(jù)本單位自主研發(fā)的主推品種‘桂熱1號(hào)’基因組數(shù)據(jù)、‘桂熱1號(hào)’和‘A4’果仁轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選和克隆MiMYB44L基因。

1.2 MiMYB44L克隆與表達(dá)規(guī)律分析

基因克隆采用MiMYB44L-F1 5′-TCCGTTTCTCTCATCTTCTC-3′和MiMYB44L-R1 5′-GTCTGTCTTCCATCTTCAATC-3′這對(duì)引物進(jìn)行克隆。熒光定量MiACTIN為內(nèi)參基因和相應(yīng)的熒光定量引物為MiMYB44L-QF 5′-AATCGCTCGTCTCCTCTC -3′和MiMYB44L-QR 5′-GGCTTGAACCACCTGAAC-3′；MiACTIN-QF 5′-TCTTCATTGCCTGCACTCCAGA-3′和MiACTIN-QR 5′-TTCCACCTGAATGCCGTCTAGC-3′。在美國Bio-rad（伯樂）公司CFX96熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)程序參照宋海云等（2023）的方法，并使用2-ΔΔCt方法分析處理熒光定量數(shù)據(jù)。

1.3 澳洲堅(jiān)果蛋白質(zhì)含量測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)試依據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》GB/T5009．5—2016中的凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定（譚秋錦等，2021a）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin pro 2021科技繪圖軟件和Office 365進(jìn)行數(shù)據(jù)整理。所有基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次生物重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。采用SPSS 27版本對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析、多重比較分析和相關(guān)分析（宋海云等，2023）。

2 結(jié)果與分析

2.1 澳洲堅(jiān)果‘桂熱1號(hào)’和‘A4’果仁轉(zhuǎn)錄組分析

采用北京百邁客生物科技有限公司的Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)澳洲堅(jiān)果高蛋白質(zhì)含量品種‘桂熱1號(hào)’和低蛋白質(zhì)含量品種‘A4’果仁的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析。共獲得39.34 Gb Clean Data，各樣品Clean Data均達(dá)到5.92 Gb，Q30堿基百分比在94.06%及以上。‘桂熱1號(hào)’比‘A4’果仁上調(diào)基因1 667個(gè)，下調(diào)基因1 798個(gè)。進(jìn)一步采用GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要在淀粉和糖代謝、氨基酸生物合成和碳代謝路徑（圖1：A）。隨后發(fā)現(xiàn)一個(gè)差異基因gene-LOC122077931，編碼R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子MYB44L，在‘桂熱1號(hào)’中表達(dá)量顯著高于其在‘A4’果仁中的表達(dá)量（圖1：B）。

2.2 MiMYB44L的生物信息學(xué)分析

根據(jù)澳洲堅(jiān)果高蛋白質(zhì)含量品種‘桂熱1號(hào)’和低蛋白質(zhì)含量品種‘A4’果仁的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，從中篩選到一個(gè)差異顯著的MYB轉(zhuǎn)錄因子。進(jìn)一步搜索‘桂熱1號(hào)’基因組設(shè)計(jì)引物在澳洲堅(jiān)果‘桂熱1號(hào)’品種果仁中克隆了MiMYB44L基因。該基因核苷酸全長(zhǎng)1 165 bp，cDNA編碼ORF長(zhǎng)度999 bp，編碼332個(gè)氨基酸（圖2）。其編碼蛋白分子量36.3 kDa，等電點(diǎn)8.19，分子式為C1572H2486N464O500S13，總原子數(shù)5 035，不穩(wěn)定系數(shù)62.96，是不穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)67.26，親水性值-0.636，為疏水性蛋白。

為進(jìn)一步分析MiMYB44L蛋白的結(jié)構(gòu)和特殊的基序，采用NCBI在線工具和MEME分析網(wǎng)站進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，澳洲堅(jiān)果MiMYB44L與蒂羅花（Telopea speciosissima）的TsMYB44和荷花（Nelumbo nucifera）的NnMYB44蛋白序列相似度最高，聚為一個(gè)亞族（圖3）。含有8個(gè)特征的基序：1. HRAFTPEEDETIIRAHARFGNKWATIARLLSGRTDNAIKNHWNSTLKRKC；2. DRIKGPWSPEEDEALQKLVQKHGPRNWSLISKSIPGRSGKSCRLRWCNQL；3. QFFSAEFLAVMQEMIRKEVRNYMSGJEQN；4. NPSSPSGSDVSDSSLPVMSSSHVYRPVARTGGVLPPVQTIE；5. CLQAEGIRNAVVKRIGISKIE；6. DPPTSLSLSLPGSDS；7. HSQQPLKRSASAGAATPVSG；8. MASTRKDV。這說明其結(jié)構(gòu)與植物MYB44家族蛋白序列一致。

經(jīng)過對(duì)蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)（圖4），MiMYB44L與其他植物的MYB在功能域序列方面相似度高，均含有SANT superfamily結(jié)構(gòu)域。其特征為在8～173氨基酸序列中含有MDRIKGPWSPEEDDSLQKLVQKHGPRNWSLISKSIPGRSGKSCRLRWCNQLSPQVEHRAFTPEEDETIIRAHAKFGNKWATIARLLSGRTDNAIKNHWNSTLKRKCSSMvddaSDDAQAHQPLKRSNSAGAAVAPVSSLYFNSPSSPSGSDVSDSSLPVMSSSHVY序列。MYB超家族蛋白具有轉(zhuǎn)錄、RNA加工和修飾、細(xì)胞分裂和染色體分割等作用。SANT結(jié)構(gòu)域結(jié)合端粒DNA串聯(lián)重復(fù)序列的串聯(lián)拷貝是加帽復(fù)合體的一部分。對(duì)于包含G/C豐富基序 ［C2-3 A （CA）1-6］的重復(fù)序列，其結(jié)合是序列依賴性的。該結(jié)構(gòu)域也發(fā)現(xiàn)于與DNA結(jié)合的調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄抑制物復(fù)合物中，在所有物種中極端保守。蛋白特性結(jié)果（圖5）顯示，MiMYB44L蛋白為疏水性蛋白，不含有跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽，主要含有絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)。

在蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了MiMYB44L蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。MiMYB44L蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)具體如下：α螺旋為86個(gè)氨基酸，占比25.90%；延長(zhǎng)鏈為19個(gè)氨基酸，占比5.72%；β轉(zhuǎn)角為10個(gè)氨基酸，占比3.01%；隨機(jī)卷曲為217個(gè)氨基酸，占比65.36% （圖6）。

分析‘桂熱1號(hào)’‘A38’‘JW’等10個(gè)品種澳洲堅(jiān)果果仁中的蛋白質(zhì)含量表明，蛋白質(zhì)含量間存在顯著性差異。進(jìn)一步提取10個(gè)品種果仁的RNA分析表明，MiMYB44L在‘JW’‘SH’等高蛋白質(zhì)含量品種中表達(dá)量最高，在‘A4’‘B4’等品種中表達(dá)量最低（圖7）。蛋白質(zhì)含量和表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)為0.54（P=0.002），達(dá)到極顯著水平。

3 討論

研究轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控澳洲堅(jiān)果蛋白質(zhì)含量的分子機(jī)制和栽培技術(shù)的報(bào)道較少，但是國內(nèi)外已經(jīng)開展了相關(guān)的生理與分子生物學(xué)研究。如Yang等（2023）在研究澳洲堅(jiān)果早期花序的代謝物和內(nèi)源激素含量變化規(guī)律中發(fā)現(xiàn)， 隨著果實(shí)的生長(zhǎng)，包括脂類、糖類和醇類、氨基酸、有機(jī)酸和核苷酸在內(nèi)的大部分差異累積代謝物在果實(shí)中顯著降低，除氨基酸外，大部分差異累積代謝物在葉軸中顯著增加，與弱花序相比，強(qiáng)花序果實(shí)中以脂質(zhì)為主進(jìn)行積累，葉軸中則積累脂質(zhì)、核苷酸和糖。譚秋錦等（2021b）在澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源收集的基礎(chǔ)上，也對(duì)不同品種的營養(yǎng)成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)果仁營養(yǎng)成分均以脂肪為主。其中，‘GR1’種質(zhì)的脂肪含量最高為78 g·100g-1，‘A4’ 種質(zhì)的脂肪含量最低為69.90 g·100g-1，果實(shí)品質(zhì)性狀間存在顯著相關(guān)性。據(jù)此，推測(cè)調(diào)控澳洲堅(jiān)果果實(shí)蛋白質(zhì)含量的因子也是調(diào)控果仁其他營養(yǎng)成分的因子。MYB44是一個(gè)多功能的轉(zhuǎn)錄因子，也是眾多植物激素信號(hào)下游的關(guān)鍵調(diào)控因子。最新研究表明，在擬南芥中，MYB44通過促進(jìn)EIN2和MPK3/6的表達(dá)來調(diào)控病原體相關(guān)分子模式（PAMP）觸發(fā)的免疫（PTI）（Wang et al.， 2023）。在擬南芥根中韌皮部移動(dòng)的MYB44負(fù)性調(diào)節(jié)磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)植物對(duì)低磷脅迫的耐受 （Olukayode et al.， 2023）。植物激素脫落酸信號(hào)途徑關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ABI5通過調(diào)控MYB44的穩(wěn)定性促進(jìn)熱激脅迫誘導(dǎo)的黃瓜葉綠素降解（Liu et al.， 2023）。除了在擬南芥等模式植物中發(fā)現(xiàn)和證明MYB44的新功能，在熱帶喬木中也相繼證明了MYB44的多樣性作用，如在橡膠樹中證明HbMYB44受多種激素信號(hào)誘導(dǎo) （Qin et al.， 2022）。在油菜中證明BcMYB44既能調(diào)控花青苷合成又能調(diào)控對(duì)干旱的抗性（Hao et al.， 2022）。可見，MYB44保守的結(jié)構(gòu)賦予了其在不同植物中具有類似的功能。本研究中，克隆MiMYB44L蛋白具有保守的SANT結(jié)構(gòu)域，與蒂羅花和荷花的MYB44劃分為一類。分子結(jié)構(gòu)分析證明了它是植物MYB44轉(zhuǎn)錄家族的成員之一。果仁中蛋白質(zhì)含量分析和表達(dá)分析之間具有極顯著的相關(guān)性，說明MiMYB44L可能是澳洲堅(jiān)果中蛋白質(zhì)含量的調(diào)控因子。

隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，可引入更多和更新的研究方法鑒定其在澳洲堅(jiān)果中的功能。盡管植物中暫沒發(fā)現(xiàn)MYB44轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控蛋白質(zhì)含量的報(bào)道，但在芥菜中，已經(jīng)證明靶向沉默BjMYB28轉(zhuǎn)錄因子基因直接調(diào)控芥菜低硫代葡萄糖苷系的發(fā)育（Augustine et al.， 2013）。

最近，采用系統(tǒng)發(fā)育、共線性和生化分析相結(jié)合的方法，鑒定并研究了月桂科植物特有的檸檬醛生物合成基因簇，包含MYB44作為轉(zhuǎn)錄因子和兩個(gè)乙醇脫氫酶（ADHs）作為修飾酶，它們來源于物種特異性串聯(lián)和近端復(fù)制事件（Zhao et al.， 2023）。牡丹PsMYB44氨基酸序列的C端有一個(gè)完整的影響花青素生物合成的C2基序，其聚集在MYB44L轉(zhuǎn)錄抑制分支中。PsMYB44位于細(xì)胞核

中，其時(shí)空表達(dá)模式與斑點(diǎn)形成呈負(fù)相關(guān)（Luan et al.， 2023）?？梢?，可以采用進(jìn)化、轉(zhuǎn)基因等新技術(shù)證明MiMYB44L在澳洲堅(jiān)果果仁營養(yǎng)成分合成中具有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。下一步，可采取進(jìn)化分析方法分析不同物種中MYB44的進(jìn)化關(guān)系并分析復(fù)制事件。提取10個(gè)蛋白質(zhì)含量差異顯著品種的基因組DNA，擴(kuò)增每個(gè)品種基因組中的MiMYB44L基因全長(zhǎng)，分析外顯子和內(nèi)含子結(jié)果，并與蛋白質(zhì)、脂肪酸等營養(yǎng)含量進(jìn)行相關(guān)性分析。構(gòu)建了帶有35s × 2pro強(qiáng)啟動(dòng)子和GFP標(biāo)簽的pGREEN載體，進(jìn)行煙草瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)證明該基因的功能。在本研究的基礎(chǔ)上，建立澳洲堅(jiān)果的遺傳轉(zhuǎn)化體系，采用過表達(dá)和敲除MiMYB44L基因的方法證明其對(duì)蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分含量的調(diào)控，對(duì)促進(jìn)澳洲堅(jiān)果品質(zhì)育種的發(fā)展具有重要意義。

4 結(jié)論

MiMYB44L蛋白含有R2R3-MYB家族特征的SANT結(jié)構(gòu)域，是典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。MiMYB44L基因在澳洲堅(jiān)果高蛋白質(zhì)含量品種中的表達(dá)量顯著高于低蛋白質(zhì)含量品種，相關(guān)系數(shù)為0.54，達(dá)到極顯著水平。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）

基金項(xiàng)目：" 廣西重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（桂科AB22035012）； 崇左市科技計(jì)劃項(xiàng)目（崇科20210710）； 廣西農(nóng)科院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（桂農(nóng)科2023YM46）。

第一作者： 許鵬（1988—），農(nóng)藝師，主要從事南亞熱帶果樹新品種選育及高效栽培技術(shù)研究與推廣工作，（E-mail）275327444@qq.com。

*通信作者：" 王文林，碩士，研究員，主要從事澳洲堅(jiān)果遺傳育種和栽培技術(shù)研究等相關(guān)工作，（E-mail）22312595@qq.com。