木薯糖轉(zhuǎn)運蛋白基因MeSWEET17b的克隆及表達(dá)分析

摘 要：" 木薯 （Manihot esculenta） 是熱帶亞熱帶地區(qū)重要的糧食作物。糖轉(zhuǎn)運蛋白SWEETs能夠促進(jìn)糖在細(xì)胞間的流動，在植物生長發(fā)育過程中起著重要作用。為明確 SWEET 家族基因在木薯生長發(fā)育過程中的功能，該研究以木薯‘KU50’為實驗材料，采用基因克隆、生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位、體外酵母檢測及RT-qPCR等方法研究木薯MeSWEET17b的基因特性。結(jié)果表明： （1） MeSWEET17b基因開放閱讀框為726 bp，編碼242個氨基酸，定位于細(xì)胞膜；MeSWEET17b蛋白與AtSWEET16、AtSWEET17 親緣關(guān)系較近，含有7個跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于疏水性蛋白。（2） 體外酵母檢測表明MeSWEET17b主要轉(zhuǎn)運果糖。（3） RT-qPCR結(jié)果表明，MeSWEET17b在葉柄和莖桿中表達(dá)趨勢基本一致，成熟期相對表達(dá)量最高，在葉片中相對表達(dá)量較低，在塊根膨大期相對表達(dá)量最高，隨著塊根生長發(fā)育，相對表達(dá)量急速下降。（4） 對‘KU50’水培苗進(jìn)行高鹽（8 g·L-1 NaCl）、干旱（100 mmol·L-1甘露醇）、氧化（10% H2O2）和低溫（15 ℃ 24 h，后降至4 ℃ 24 h）等非生物脅迫處理。RT-qPCR結(jié)果顯示，干旱脅迫下，MeSWEET17b在葉片和莖桿中的相對表達(dá)量變化差異最大；鹽脅迫下，MeSWEET17b在葉片和須根中的相對表達(dá)量變化最顯著；氧化和低溫脅迫下，MeSWEET17b在須根中和葉柄中的相對表達(dá)量隨著處理時間的延長呈極顯著上升趨勢。該研究為進(jìn)一步研究糖轉(zhuǎn)運蛋白SWEETs在木薯中的作用機制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 木薯， 糖轉(zhuǎn)運蛋白， 亞細(xì)胞定位， 糖轉(zhuǎn)運能力， 非生物脅迫

中圖分類號：" Q943" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：" A

Cloning and expression analysis of sugar transporter protein gene MeSWEET17b in cassava

XUE Jingjing1，2， WEI Zhuowen1， LUO Xiuqin1， AN Feifei1，2*

（ 1. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Conservation and Utilization for Cassava Germplasm Resources， Haikou 571101， China; 2. Sanya Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Sanya" 572025， Hainan， China ）

Abstract：" Cassava （Manihot esculenta） is an important food crop in tropical and subtropical regions. Sugar transporter protein SWEETs facilitate the flow of sugar between cells and play an important role in plant growth and development. In order to clarify the function of SWEET family genes in cassava， cassava‘KU50’ was used as material in this study， and the gene properties of MeSWEET17b were studied by gene cloning， bioinformatics analysis， subcellular localization， in vitro yeast detection and RT-qPCR， etc. The results were as follows： （1） The open reading frame of MeSWEET17b was 726 bp， encoding 242 amino acids， and located in the plasma membrane. MeSWEET17b had the closer genetic relationship with AtSWEET16 and AtSWEET17， containing 7 transmembrane domains， and belonging to hydrophobic protein. （2） MeSWEET17b mainly transport fructose through the in vitro yeast detection. （3） The results of RT-qPCR showed that the expression trend of MeSWEET17b in stem was basically consistent with in petiole， and the expression was the highest at maturity. The relative expression of MeSWEET17b was relatively low in leaves， and the highest in the expansion stage of tuberous root， while decreased rapidly with the growth of tuberous roots. （4） The ‘KU50’ seedlings were subjected to abiotic stress treatments such as high salt （8 g·L-1 NaCl）， drought （100 mmol·L-1 mannitol）， oxidation （10% H2O2） and cold （15 ℃ for 24 h， then dropped to 4 ℃ for 24 h）. RT-qPCR showed that the relative expressions of MeSWEET17b in leaf and stem had the greatest difference under drought stress. The relative expressions of MeSWEET17b in leaf and fibrous root changed most significantly under salt stress; under oxidation and cold stress， the relative expressions of MeSWEET17b in fibrous root and petiole increased significantly with the extention of treating" time. This study provides a theoreticac reference for further studying the function mechanism of sugar transporter protein SWEETs in cassava.

Key words： cassava （Manihot esculenta）， sugar transporter protein， subcellular localization， sugar transport capacity， abiotic stress

糖是真核生物和原核生物重要的能量來源。糖轉(zhuǎn)運蛋白SWEETs是真核生物和原核生物中主要的轉(zhuǎn)運蛋白，能夠促進(jìn)糖在細(xì)胞間的流動。SWEET家族基因及其同源物廣泛分布于包含細(xì)菌和古生菌的幾乎所有生命領(lǐng)域 （Chen et al.， 2015）。所有真核生物的SWEETs都是由7個預(yù)測的跨膜 （7TM） 結(jié)構(gòu)域組成，其中3TM重復(fù)序列由連接螺旋連接起來。整個結(jié)構(gòu)以3+1+3的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)排列在細(xì)胞膜上 （Chen et al.， 2010）。植物中，SWEETs主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，存在于不同細(xì)胞器官，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和液泡 （Feng amp; Frommer， 2015）。定位于質(zhì)膜上的SWEET轉(zhuǎn)運蛋白可以將胞液中的糖轉(zhuǎn)運到質(zhì)外體，行使不同的功能，如花蜜分泌 （Lin et al.， 2014）、質(zhì)外體韌皮部裝載 （Chen et al.， 2015）、種子灌漿 （Guan et al.， 2008）、花粉營養(yǎng) （Sun et al.， 2013）、病原體感染 （Chen et al.， 2010）以及非生物脅迫 （Wu et al.， 2023） 等。

木薯（Manihot esculenta）塊根富含淀粉，是世界三大薯類作物之一，也是熱帶亞熱帶地區(qū)重要的糧食作物，全世界約有10億人以木薯作為主要糧食（Cai et al.， 2023）。木薯以蔗糖為主要運輸物質(zhì)。木薯光合產(chǎn)物的分配是糖通過韌皮部維管系統(tǒng)從氣生葉向地下貯藏根的長距離運輸過程。[JP3]SWEET蛋白屬于MtN3/saliva gene family，也稱為MtN3/saliva/SWEET，可以轉(zhuǎn)運己糖和蔗糖，并介導(dǎo)糖外流到質(zhì)外體。木薯SWEET家族共有28個同源基因，根據(jù)其轉(zhuǎn)運不同糖的特性，可以分為4個亞類。其中，對MeSWEET10a的研究最為深入。Zárate-Chaves等（2021）研究顯示，地毯黃單胞菌的毒力可以通過轉(zhuǎn)錄激活因子TAL20特異性誘導(dǎo)木薯MeSWEET10a的表達(dá)，增加糖的積累并最終導(dǎo)致木薯細(xì)菌性枯萎病的蔓延。此外，MeSWEET1、MeSWEET3b、MeSWEET15a、MeSWEET15b及MeSWEET18也有報道。其中，木薯MeSWEET1基因定位于細(xì)胞膜上，在成熟葉片的表達(dá)量最高 （劉秦等，2017）；木薯MeSWEET3b主要轉(zhuǎn)運半乳糖，黃單胞菌Xam 能夠誘導(dǎo)其表達(dá)（朱柏光等，2022）；木薯MeSWEET15a及MeSWEET15b基因可以轉(zhuǎn)運蔗糖、葡萄糖、果糖和甘露糖，VIGS沉默能夠增強木薯對干旱脅迫和鹽脅迫的耐受性（Fan et al.， 2023）；木薯MeSWEET18主要轉(zhuǎn)運果糖，VIGS沉默會導(dǎo)致其葉片中果糖含量的增加 （薛晶晶等， 2022， 2023）；GWAS分析發(fā)現(xiàn)MeSWEET18與木薯塊根干物質(zhì)含量緊密相關(guān)，該基因主要在木薯塊根中發(fā)揮作用（Rabbi et al.， 2022）。前人對木薯糖轉(zhuǎn)運蛋白SWEET家族基因的研究多集中在基因克隆，糖轉(zhuǎn)運特性分析及非生物脅迫的表達(dá)特性等，其調(diào)控木薯塊根淀粉含量、干物率的作用機制還未深入研究。本研究前期研究發(fā)現(xiàn)，木薯糖轉(zhuǎn)運蛋白MeSWEET17b與MeSWEET18親緣關(guān)系最近，但其功能尚未報道。因此，本研究以木薯‘KU50’為研究材料，通過克隆、亞細(xì)胞定位、糖轉(zhuǎn)運特性分析以及非生物脅迫等方法，探究木薯MeSWEET17b的蛋白質(zhì)性質(zhì)、糖轉(zhuǎn)運特性以及非生物脅迫下的表達(dá)變化。擬探討與MeSWEET18親緣關(guān)系最近的MeSWEET17b在木薯中的表達(dá)情況，從而為糖轉(zhuǎn)運蛋白SWEETs在木薯中的功能研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用生長于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所國家木薯種質(zhì)資源圃的‘KU50’種質(zhì)作為研究材料，分別取‘KU50’形成期（植后4個月）、膨大期（植后7個月）及成熟期（植后10個月）葉片、葉柄、莖桿和塊根。非生物脅迫主要是將生長20 d的‘KU50’水培苗，分別放入含有8 g·L-1 NaCl、100 mmol·L-1甘露醇及10% H2O2的溶液中進(jìn)行鹽、干旱和氧化處理，各處理時間分別為0 h （對照，CK）、12 h、24 h和36 h。低溫處理則將水培苗直接放入植物光照培養(yǎng)箱采用15 ℃ 24 h，后降至4 ℃ 24 h進(jìn)行處理。采集的樣本立即在液氮中冷凍并儲存 -80 ℃冰箱，每個樣本重復(fù)3次。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成 總RNA的提取參照RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Tiangen）的操作說明進(jìn)行。cDNA第一鏈的合成參照RevertAid RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo）的操作說明進(jìn)行。

1.2.2 MeSWEET17b 基因全長cDNA擴增 以Phytozome 12.0中Manihot esculenta v7.1數(shù)據(jù)庫的MeSWEET17b序列設(shè)計引物（表1），以‘KU50’的cDNA為模板進(jìn)行序列克隆。全長cDNA的擴增體系含PrimeSTAR Max Premix（2×） 25 μL、MeSWEET17b-F （10 μmol·L-1） 2.5 μL、MeSWEET17b-R （10 μmol·L-1） 2.5 μL、cDNA模板0.5 μL、滅菌水補足50 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產(chǎn)物，回收純化目的條帶，克隆至pEASY-Blunt Simple Cloning Vector載體上測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用NCBI網(wǎng)站ORF Finder軟件對獲得的KU50 cDNA序列進(jìn)行開放閱讀框（open reading frame，ORF）預(yù)測，同時翻譯成蛋白序列；ProtParam軟件分析該蛋白的分子量與等電點；NCBI在線軟件CDD分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；TMHMM Server v.2.0在線軟件進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析；ProtScale在線軟件預(yù)測該氨基酸序列的疏水性／親水性；SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD在線軟件預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)。從擬南芥TAIR 數(shù)據(jù)庫下載所有SWEET的蛋白序列，利用MEGA 5.0軟件，選擇鄰接模型（neighbour-joining，NJ），并進(jìn)行1 000次Bootstrap統(tǒng)計學(xué)檢驗，構(gòu)建包括MeSWEET17b蛋白序列在內(nèi)的木薯和擬南芥SWEET蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用DNAMAN軟件比對MeSWEET17b與AtSWEET16、 AtSWEET17的序列同源性。

1.2.4 MeSWEET17b亞細(xì)胞定位 使用含有pCAMBIA1302表達(dá)載體同源序列的引物（表1）擴增MeSWEET17b不含終止密碼子的CDS序列，利用重組克隆試劑盒ClonExpress Ⅱ One Step Cloning （Vazyme） 將 MeSWEET17b亞克隆至 pCAMBIA1302-GFP 空載體上，構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體 35S∷MeSWEET17b-GFP，以35S∷GFP 作為對照。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞 GV3101，挑取單菌落用YEP液體培養(yǎng)基（含50 μg·mL-1 Kana，25 μg·mL-1 Rif），28 ℃ 220 r·min-1進(jìn)行活化后擴大培養(yǎng)直至菌液OD600在0.8～1.0間。將菌液置于離心機中，5 000 r·min-1離心10 min后收集菌體沉淀。用15 mL侵染液（10 mmol·L-1 MgCl2、10 mmol·L-1 MES pH 5.8、100 μmol·L-1 AS）洗滌菌體，重復(fù)洗滌一次。用侵染液重懸菌體，調(diào)OD600約為0.8，黑暗靜置活化2～3 h，侵染煙草葉片，25 ℃黑暗培養(yǎng)48～72 h，通過熒光共聚焦激光掃描顯微鏡觀察，拍照。

1.2.5 實時熒光定量PCR分析 采用Thermo公司的CFX實時熒光定量PCR系統(tǒng)，實驗操作按儀器使用說明書進(jìn)行。將cDNA稀釋10倍作為RT-qPCR分析的模板。10 μL反應(yīng)體系包含1 μL模板、5 μL 2×SYBR Green qPCR Mix、0.8 μL 10 μmol·L-1 MeSWEET17b-qPCR引物、滅菌水補足10 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s共40個循環(huán)，循環(huán)完成后進(jìn)行產(chǎn)物熔解曲線分析。以MeActin作為內(nèi)參基因，以2-△△Ct算法進(jìn)行基因的相對定量表達(dá)分析。

1.2.6 MeSWEET17b的糖轉(zhuǎn)運特性分析 EBY.VW4000酵母是一種己糖轉(zhuǎn)運功能缺陷型酵母突變體，此菌株無法在己糖為唯一碳源的尿嘧啶（ura）缺陷型選擇培養(yǎng)基SD-ura平板上生長，可以在麥芽糖為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基SD-ura平板上恢復(fù)生長。將MeSWEET17b的CDS序列構(gòu)建到酵母功能穿梭載體 pDR196（表1）上，使用YeastmakerTM Yeast Transformation System 2 kit 酵母轉(zhuǎn)化試劑盒（Clontech）的聚乙二醇/醋酸鋰高效酵母轉(zhuǎn)化法將重組后的MeSWEET17b-pDR196質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到EBY.VW4000酵母菌中。在選擇培養(yǎng)基SD-ura + 2%麥芽糖平板上劃線培養(yǎng)，倒置于 30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3～5 d。挑單菌落放入SD-ura + 2%麥芽糖液體培養(yǎng)基中過夜搖菌 （30 ℃，220 r·min-1）。待 OD600 為 1 左右時，停止搖菌。取 1 mL 菌液加入 1.5 mL 無菌離心管中，室溫下，高速離心15 s，收集菌體，棄上清。加入 1 mL 無菌超純水，重懸菌體，再次高速離心 15 s，收集菌體，棄上清。如此清洗重懸2～3次菌體，盡量降低液體培養(yǎng)基的影響。取4 μL菌液為×1倍，依次稀釋×10倍、×100倍、×1 000 倍和×10 000 倍，均勻點涂到施加不同唯一碳源的SD-ura 選擇培養(yǎng)基上 （SD-ura + 2%麥芽糖、SD-ura + 2%葡萄糖、SD-ura + 2%果糖、SD-ura + 2%蔗糖），倒置30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 3～5 d，觀察生長情況。

1.2.7 分析方法及數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2021分析數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 5.0軟件作圖以及Dunnetts 檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1" MeSWEET17b基因全長CDS克隆及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性分析

通過RT-PCR擴增及測序，獲得MeSWEET17b 基因編碼框序列726 bp， 編碼242個氨基酸 （圖1： A） ，蛋白分子質(zhì)量為26.32 kDa，理論等電點為7.72，不穩(wěn)定系數(shù)為40.54，屬于不穩(wěn)定類蛋白。通過NCBI 在線軟件CDD 分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白N端含有MtN3_slv蛋白結(jié)構(gòu)域，含有2個PQ-loop superfamily。TMHMM Server v.2.0在線軟件預(yù)測顯示，該蛋白含有7個跨膜結(jié)構(gòu)域，是典型的膜蛋白（圖1： B）；ProtScale預(yù)測表明，MeSWEET17b蛋白屬于疏水性蛋白 （圖1： C）；SOPMA分析顯示，MeSWEET17b蛋白二級結(jié)構(gòu)由49.79%α-螺旋、27.39% 延伸鏈、4.56%β-轉(zhuǎn)角和18.26%無規(guī)則卷曲組成。

2.2 MeSWEET17b 的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析及氨基酸序列比對

對木薯糖轉(zhuǎn)運蛋白SWEETs和擬南芥SWEET蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)MeSWEET17b與擬南芥AtSWEET16和AtSWEET17位于同一進(jìn)化枝上，屬于第四亞類（Clade Ⅳ）（圖2： A）。采用DNAMAN軟件對MeSWEET17b、AtSWEET16和AtSWEET17氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示MeSWEET17b和AtSWEET16的同源性達(dá)到51.24%，MeSWEET17b和AtSWEET17的同源性達(dá)到53.72%，含有兩個明顯的PQ-loop superfamily結(jié)構(gòu)（圖2： B）。

2.3 MeSWEET17b 的亞細(xì)胞定位

將35S∷GFP和35S∷MeSWEET17b-GFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101，并侵染煙草葉片，在熒光共聚焦顯微鏡下觀察其在煙草中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示35S∷GFP在細(xì)胞膜和細(xì)胞核中均能觀察到熒光信號，而 35S∷MeSWEET17b-GFP只在細(xì)胞膜上存在熒光信號，推測 MeSWEET17b定位于細(xì)胞膜（圖3）。

2.4 MeSWEET17b 的糖轉(zhuǎn)運特性

為驗證 MeSWEET17b 的糖轉(zhuǎn)運特性，將pDR196和重組后的MeSWEET17b-pDR196質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至以麥芽糖作為唯一碳源的己糖轉(zhuǎn)運缺陷型酵母 EBY.VW4000 中。將含有pDR196 和MeSWEET17b-pDR196的轉(zhuǎn)化酵母按照1、10-1、10-2、10-3、10-4稀釋，分別點涂于含有2%麥芽糖（對照）、2%葡萄糖、2%果糖及2%蔗糖等不同碳源的選擇培養(yǎng)基SD-ura平板上，30 ℃，倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察生長情況。由圖4可知， pDR196和MeSWEET17b-pDR196均能在2%麥芽糖為唯一碳源的SD-ura平板上生長；同時，MeSWEET17b-pDR196也能在2%果糖為唯一碳源的SD-ura平板上生長，推測MeSWEET17b主要轉(zhuǎn)運果糖。

2.5 MeSWEET17b 在木薯不同器官不同發(fā)育時期的表達(dá)

分別取‘KU50’形成期、膨大期及成熟期葉片、葉柄、莖桿和塊根材料，提取總RNA后，進(jìn)行RT-qPCR分析。由圖5可知：MeSWEET17b在木薯葉片中的相對表達(dá)量較低，在成熟期時降到最低；在葉柄中的相對表達(dá)量隨著木薯的生長持續(xù)上升，在成熟期時達(dá)到最大；在膨大期和形成期時的莖桿中相對表達(dá)量無差異，在成熟期時呈顯著上升趨勢；在木薯塊根膨大期時的相對表達(dá)量為最高，隨著塊根生長，相對表達(dá)量低于形成期。

2.6" MeSWEET17b在非生物脅迫下的表達(dá)分析

將‘KU50’莖桿水培培養(yǎng)20 d后，進(jìn)行干旱、鹽、氧化以及低溫脅迫，干旱、鹽和氧化脅迫處理時間分別為0 h、12 h、24 h、36 h，低溫脅迫采用15 ℃ 24 h，后降至4 ℃ 24 h的處理方式。采集每個時間點的葉片、葉柄、莖桿和須根進(jìn)行RT-qPCR表達(dá)分析。RT-qPCR分析結(jié)果（圖6）顯示，干旱脅迫和鹽脅迫下，隨著處理時間的延長，MeSWEET17b的相對表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢；當(dāng)干旱脅迫24 h時，MeSWEET17b在葉片、莖桿和須根的相對表達(dá)量達(dá)到最高，與0 h相比，葉片和莖桿在處理24 h時相對表達(dá)量分別提高了11.17倍和20.95倍；鹽脅迫12 h時，MeSWEET17b在葉片和莖桿中的表達(dá)較對照分別提高了42.46倍和3.62倍；氧化脅迫下，MeSWEET17b在須根中的相對表達(dá)量最高，24 h時較對照提高了1 876倍且葉片和須根中的相對表達(dá)量均呈先上升后下降的趨勢，而葉柄和莖桿的相對表達(dá)量則呈先下降再上升的趨勢，至36 h達(dá)到最大值；低溫（15 ℃）處理24 h，MeSWEET17b在葉柄、莖桿和須根中的相對表達(dá)量呈上升趨勢，低溫（4 ℃）處理24 h后，葉柄和須根中的相對表達(dá)量進(jìn)一步上調(diào)，但其在葉片中的相對表達(dá)量則呈先下降再上升的趨勢。

3 討論與結(jié)論

糖在植物的生理代謝、生長發(fā)育等方面具有重要作用，不僅是植物生長和細(xì)胞新陳代謝的能量來源，也是細(xì)胞的重要信號分子 （Liu et al.， 2019）；而糖轉(zhuǎn)運蛋白SWEET基因能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外以及器官間的糖含量，影響植物的源庫關(guān)系 （Yin et al.， 2009），進(jìn)而協(xié)調(diào)植物生長發(fā)育及環(huán)境響應(yīng) （Yu et al.， 2012）。以木薯‘KU50’葉片cDNA為模板，擴增MeSWEET17b的CDS序列，與Manihot esculenta v7.1數(shù)據(jù)庫中AM560的序列進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無堿基差異，表明MeSWEET17b在木薯中高度保守。利用RT-qPCR分析MeSWEET17b在‘KU50’不同發(fā)育期的葉片、葉柄、莖桿和塊根的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)MeSWEET17b在葉柄中高表達(dá)，其成熟期的相對表達(dá)量達(dá)到最大，在葉片、莖桿和塊根中的相對表達(dá)量均較低。與木薯栽培種‘TME204’不同組織/器官中的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致 （Wilson et al.， 2017）。體外酵母檢測發(fā)現(xiàn)MeSWEET17b主要轉(zhuǎn)運果糖，推測木薯MeSWEET17b主要負(fù)責(zé)將葉柄中聚集的果糖進(jìn)行外排，在木薯的‘流’器官中發(fā)揮作用。煙草瞬時表達(dá)顯示MeSWEET17b主要定位于細(xì)胞膜，是典型的膜蛋白，與MeSWEET1（劉秦等，2017），以及MeSWEET15a和MeSWEET15b（Fan et al.， 2023）的研究結(jié)果一致。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，MeSWEET17b 位于Clade Ⅳ，與擬南芥 AtSWEET16 和 AtSWEET17 屬于同一進(jìn)化分支。MeSWEET17b與木薯MeSWEET18親緣關(guān)系最近，氨基酸序列同源性達(dá)到82.79%。木薯MeSWEET18主要轉(zhuǎn)運果糖，VIGS沉默MeSWEET18后，其沉默株系葉片的果糖含量增多 （薛晶晶等，2022，2023）。擬南芥AtSWEET17在葉片的果糖分配上發(fā)揮著重要作用，并且AtSWEET17 沉默株系表現(xiàn)為果糖積累功能紊亂、植株發(fā)育不良等（Chardon et al.， 2013）。對MeSWEET17b的糖轉(zhuǎn)運特性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其主要轉(zhuǎn)運果糖，與MeSWEET18和 AtSWEET17 主要影響果糖積累的研究結(jié)果一致。

前人已有較多研究表明，SWEET家族基因在非生物脅迫下的表達(dá)情況。例如，蘋果糖轉(zhuǎn)運蛋白基因MdSWEET17轉(zhuǎn)化番茄后，能夠增強番茄對干旱的耐受性，同時積累更多的果糖 （Lu et al.， 2019）；過表達(dá)擬南芥AtSWEET17和AtSWEET16會導(dǎo)致冷脅迫下葉片液泡中果糖積累減少 （Chardon et al.， 2013）；定位于液泡膜上的果糖特異性轉(zhuǎn)運蛋白SWEET17能夠影響干旱條件下擬南芥?zhèn)雀纳L（Valifard et al.， 2021）；茶樹CsSWEET16基因參與糖在液泡膜上的分配，能夠影響擬南芥低溫脅迫下的耐受性（Wang et al.， 2018）；百合LoSWEET14基因在干旱、低溫、鹽等非生物脅迫及脫落酸處理下的表達(dá)顯著增加， LoSWEET14基因過表達(dá)煙草株系顯著增強了對干旱和低溫等非生物脅迫及脫落酸的敏感性，但其與擬南芥AtSWEET10 親緣關(guān)系最近，主要轉(zhuǎn)運蔗糖（Zeng et al.， 2022）。本研究對木薯‘KU50’水培苗進(jìn)行鹽、干旱、氧化和低溫處理，對處理不同時間的葉片、葉柄、莖桿和須根等器官進(jìn)行RT-qPCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：非生物脅迫下，MeSWEET17b 在葉片、葉柄、莖桿和須根等器官的相對表達(dá)量隨著處理時間的延長呈顯著性變化；干旱脅迫下，MeSWEET17b在葉片和莖桿中的相對表達(dá)量變化差異最大；鹽脅迫下，MeSWEET17b在葉片和須根中的相對表達(dá)量變化最為顯著；氧化和低溫脅迫下，MeSWEET17b在須根中的相對表達(dá)量呈現(xiàn)飛躍式上升，在葉柄中的相對表達(dá)量隨著處理時間的延長呈極顯著上升趨勢。MeSWEET17b在葉柄中相對表達(dá)量最高，可能主要作用于葉柄的糖轉(zhuǎn)運。因此，推測木薯MeSWEET17b可能主要在氧化脅迫和低溫脅迫下起作用。

因此，基于以上研究結(jié)果，在后續(xù)研究中，將利用木薯原生質(zhì)體對MeSWEET17b進(jìn)行亞細(xì)胞定位，明確其定位的具體細(xì)胞類型。分析MeSWEET17b啟動子序列中與非生物脅迫、糖信號等相關(guān)的順式作用元件，構(gòu)建pMeSWEET17b∷GUS載體轉(zhuǎn)化木薯，采用組織化學(xué)染色法對轉(zhuǎn)基因植株中GUS基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析。對獲得的MeSWEET17b過表達(dá)株系及Crispr Cas9基因編輯株系的葉片、葉柄、莖桿及塊根的糖含量進(jìn)行測定，并分析MeSWEET17b以及糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)趨勢；同時，選擇差異倍數(shù)明顯的株系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析及非生物脅迫研究，篩選調(diào)控MeSWEET17b的轉(zhuǎn)錄因子，深入研究木薯MeSWEET17b的基因功能，為進(jìn)一步研究糖轉(zhuǎn)運蛋白SWEETs在木薯中的功能提供理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 李 莉 周翠鳴）

基金項目：" 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)中心科技創(chuàng)新團(tuán)隊 （CATASCXTD202301） 。

第一作者： 薛晶晶（1983—），博士，副研究員，研究方向為木薯糖代謝，（E-mail）xuetao608@[KG-0.5mm]163.com。

*通信作者：" 安飛飛， 博士， 副研究員， 研究方向為木薯采后腐爛機制解析，（E-mail）anfeifei@[KG-0.5mm]catas.cn。