單氰胺破除葡萄休眠生理生化響應(yīng)及相關(guān)基因克隆與表達(dá)分析

摘 要： "為探究單氰胺破除葡萄休眠的生理生化響應(yīng)及分子調(diào)控機(jī)理，該研究以‘水晶’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca ‘Shuijing’）為試驗材料，測定單氰胺處理 ‘水晶’葡萄后芽內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性，丙二醛（MDA）和H2O2含量及氧自由基產(chǎn)生速率的變化，并通過RT-PCR技術(shù)克隆得到其葡萄芽的2個FT （Flowering locus T） 基因（VvFT1和VvFT2）和1個CBF（C-repeat Binding Factor）基因（VvCBF）的全長cDNA序列，分析其理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化、保守基序及結(jié)構(gòu)域和單氰胺處理后其在葡萄芽中的表達(dá)水平差異等。結(jié)果表明：（1）生理生化指標(biāo)分析表明，單氰胺處理后葡萄芽內(nèi)SOD、POD和CAT活性，MDA和H2O2含量及氧自由基產(chǎn)生速率均明顯增加。（2）‘水晶’葡萄VvFT1和VvFT2的cDNA全長為525 bp，編碼174個氨基酸（aa）；VvCBF的cDNA全長為826 bp，編碼237 aa。（3）同源性分析表明，‘水晶’葡萄VvFT1與荔枝（Litchi chinensis，LcFT：AEU08960.1）和龍眼（Dimocarpus longan，DlFT2：ALA55998.1）的氨基酸同源性最高，VvFT2與LcFT（AEU08961.1）和DlFT2（AHF27444.1）的氨基酸同源性最高。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，VvFT1、VvFT2、LcFT（AEU08960.1，AEU08961.1）和DlFT2（ALA55998.1，AHF27444.1）聚為一支，親緣關(guān)系最近；VvCBF與野扁桃（Prunus ledebouriana，PlCBF：AEB69782.1）的氨基酸同源性最高，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明VvCBF和PlCBF聚為一支，親緣關(guān)系最近。（4）qRT-PCR分析表明，單氰胺處理后葡萄芽中VvFT1和VvFT2基因的表達(dá)量顯著增加，而VvCBF基因的表達(dá)量顯著降低。該研究較為全面地分析了VvFT1、VvFT2和VvCBF基因的系統(tǒng)進(jìn)化和單氰胺處理后葡萄芽內(nèi)各基因表達(dá)模式及生理生化指標(biāo)變化，為單氰胺破除葡萄休眠的分子和生理機(jī)制研究提供了理論參考。

關(guān)鍵詞： 單氰胺， 葡萄， 休眠， 轉(zhuǎn)錄因子， VvCBF， VvFTs

中圖分類號： "Q943 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： "A

文章編號： "1000-3142（2024）12-2197-15

Physiological and biochemical responses of grape dormancy breaking with cyanamide and expression analysis of related genes

LI Xiaoqin， TAO Xingmei， WANG Kai， QIAO Zuqin， LIU Zhao， ZHANG Yongfu*

（ School of Agriculture and Life Sciences， Kunming University， Kunming 650214， China ）

Abstract： "To explore the responses of physiological and biochemical and mechanism of molecular regulatory for grape dormancy breaking with cyanamide， Vitis vinifera × V. labrusca" ‘Shuijing’ was used as experimental material in this study to determine the changes in activities of superoxide dismutase （SOD）， peroxidase （POD）， catalase （CAT）， contents of malondialdedyde （MDA） and H2O2， and oxygen free radical production rate， and the full-length cDNA sequences of two FT （Flowering location T） genes （VvFT1 and VvFT2） and one CBF （C-repeat Binding Factor） gene （VvCBF） from its buds were cloned and obtained by RT-PCR technology， then their physicochemical properties， phylogenetic evolution， conserved motifs and domains， and expression levels differences in grape buds after cyanamide treatment were analyzed. The results were as follows： （1） The analysis of physiological and biochemical indicators showed that activities of SOD， POD and CAT，" contents of MDA and H2O2， and oxygen free radical production rate in grape buds were significantly increased after treated with cyanamide. （2） The full-length cDNA sequences of VvFT1 and VvFT2 genes were 525 bp from Vitis vinifera × V. labrusca ‘Shuijing’， encoding 174 aa amino acids， and the full-length cDNA sequences of VvCBF gene was 826 bp， encoding 237 aa amino acids. （3） The homology analysis showed that VvFT1 of Vitis vinifera × V. labrusca ‘Shuijing’ had the highest amino acid homology with Litchi chinensis （LcFT： AEU08960.1） and Dimocarpus longan （DlFT2： ALA55998.1）， VvFT2 had the highest amino acid homology with LcFT （AEU08961.1） and DlFT2 （AHF27444.1）. The phylogenetic analysis showed that VvFT1， VvFT2， LcFT （AEU08960.1， AEU08961.1） and DlFT2 （ALA55998.1， AHF27444.1） clustered into a branch， with the closest genetic relationship; VvCBF had the highest amino acid homology with Prunus ledebouriana （PlCBF： AEB69782.1）， and the phylogenetic analysis showed that VvCBF and PlCBF clustered into a branch， with the closest genetic relationship. （4） qRT-PCR analysis showed that VvFT1 and VvFT2 expression levels were significantly increased in buds after treated with cyanamide， while VvCBF expression level was significantly decreased. This study comprehensively analyzed the phylogenetic evolution of VvFT1， VvFT2， and VvCBF genes， as well as the expression patterns of these genes and physiological and biochemical indicators in grape buds after treated with cyanamide， which provides a theoretical reference for the molecular and physiological mechanisms of grape dormancy breaking with cyanamide.

Key words： cyanamide， grape， dormancy， transcription factors， VvCBF， VvFTs

葡萄是世界性的重要果樹之一，也是繼擬南芥、水稻、楊樹之后完成全基因測序的第4種開花植物（楊光等，2010），具有非常強(qiáng)的季節(jié)性，即具有明顯的生長期和休眠期（劉芳，2018）。休眠是植物生長發(fā)育過程中的一個暫?，F(xiàn)象，是一種有益的生物學(xué)特性，是植物長期演化獲得的一種適應(yīng)環(huán)境條件及季節(jié)性變化的特性，其中芽休眠是最為常見的休眠方式（閔卓和房玉林，2016）。葡萄作為一種典型的落葉果樹，休眠是葡萄生長發(fā)育過程中不可逾越的重要階段，隨著我國北方葡萄設(shè)施栽培面積的不斷擴(kuò)大，低溫不足造成葡萄休眠期延長而推遲成熟造成萌芽不整齊、產(chǎn)量下降等突出問題。此外，隨著葡萄市場競爭加大，促進(jìn)葡萄打破休眠、提早萌芽，是目前葡萄栽培產(chǎn)業(yè)中亟待解決的一項關(guān)鍵技術(shù)問題（譚一婷等，2021）。單氰胺（cyanamide）是一種氰氨類化學(xué)試劑，近年來常常被用于打破葡萄休眠，起到促進(jìn)葡萄芽提早萌發(fā)和發(fā)育整齊的作用，特別是應(yīng)用于冬季低溫積累量不足且濕度大的地區(qū)（Sudawan et al.， 2016；Wang et al.， 2016；牛歆雨等，2018），然而對單氰胺打破葡萄休眠的機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

CBF（C-repeat Binding Factor）和FT（Flowering locus T）基因廣泛存在于不同的植物中，并參與植物的生長發(fā)育、抗非生物逆境脅迫等多個階段。FT是磷脂酸乙醇胺結(jié)合蛋白（phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP）家族成員，具有保守的PEBP結(jié)構(gòu)域（Hanano amp; Goto， 2011），是光周期途徑植物決定開花時間的關(guān)鍵基因（楊光等，2010），具有季節(jié)性變化（王云夢等，2022），在成花轉(zhuǎn)變和生殖器官的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用（陳仲等，2011）。另外，F(xiàn)T基因在儲藏器官發(fā)育（Navarro et al.， 2015）、腋芽形成（Hiraola et al.， 2013）、氣孔開閉（Kinoshita et al.， 2011）、植物及種子休眠（Carmona et al.， 2007；Vergara et al.， 2016）等方面也發(fā)揮重要作用。CBF屬于AP2/ERF（APETALA2/ethylene response protein）類家族，能夠與啟動子中的核心片段相結(jié)合從而調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，目前CBF被證明是植物抗冷途徑的主要樞紐，通過調(diào)控下游大量抗冷基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗冷能力（呂勝男等，2011；趙峻麗等，2020）。另外，CBF還在干旱、高鹽、極端高溫等非生物脅迫方面起重要作用（Chen et al.， 2016），以及還參與植物的生長（趙濤，2013）和休眠（Wisniewski et al.， 2011）等過程，但目前CBF在植物休眠方面的研究較少。Wisniewski等（2011）將桃子CBF轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)至蘋果中異位表達(dá)，首次發(fā)現(xiàn)該基因過表達(dá)導(dǎo)致短日照誘導(dǎo)的休眠；Saito等（2015）研究發(fā)現(xiàn)CBF可以調(diào)控休眠相關(guān)MADS-box（Dormancy-associated MADS-box，DAM）基因，從而影響植物的休眠，并且FT基因也參與此過程。綜上所述， CBF與FT基因均對植物休眠起到重要作用（Carmona et al.， 2007；Wisniewski et al.， 2011；Saito et al.， 2015；Vergara et al.， 2016），并且聯(lián)系緊密，但其是否也參與到單氰胺破除葡萄休眠這一過程中，值得深入探討。

‘水晶’葡萄（Vitis vinifera×V. labrusca‘Shuijing’）原產(chǎn)于美洲，成熟后呈黃綠色，具有肉厚多汁、含糖量高、適口性好及可溶性固形物較高等特點且有較高的營養(yǎng)價值（田竹希等，2021）。單氰胺常作為‘水晶’葡萄的破眠劑，促進(jìn)葡萄提前萌芽，CBF和FT作為植物打破休眠過程中重要的調(diào)控因子，還未見其基因序列及蛋白功能在‘水晶’葡萄植物中被報道，因此本研究以‘水晶’葡萄為材料，進(jìn)行單氰胺處理后，通過RT-PCR技術(shù)克隆獲得參與‘水晶’葡萄芽休眠的CBF與FT基因cDNA全序列，并利用實時熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）技術(shù)對其進(jìn)行表達(dá)量分析，以及結(jié)合噴施單氰胺后‘水晶’葡萄芽內(nèi)過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，丙二醛（malondialdehyde，MDA）和H2O2含量及氧自由基產(chǎn)生速率的測定分析，探討單氰胺打破‘水晶’葡萄芽休眠的分子和生理生化機(jī)制，為解析單氰胺打破葡萄休眠的機(jī)理并進(jìn)一步指導(dǎo)單氰胺的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。本研究旨在探討以下問題：（1）VvFT1、VvFT2和VvCBF 蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及物種間的進(jìn)化關(guān)系；（2）單氰胺破除葡萄休眠過程中VvFT1、VvFT2和VvCBF基因的表達(dá)模式變化；（3）單氰胺破除葡萄休眠過程中CAT、POD和SOD活性變化，MDA和H2O2含量變化及氧自由基產(chǎn)生速率變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘水晶’葡萄來源于云南省彌勒市東風(fēng)農(nóng)場管理局的生長狀況健康、一致的冬剪枝條，利用清水進(jìn)行葡萄枝條扦插，每3 d對其噴施一次2.5%單氰胺（劉芳，2018；邱棟梁等，2022），以噴施清水作為對照（CK），分別在第0、第7、第14、第21、第28 天取‘水晶’葡萄芽立即利用液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。TPIzol提取液和DL 2 000 DNA Marker均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 生理指標(biāo)的測定

利用雙組分光光度法和硫酸鈦-濃氨水顯色法分別進(jìn)行MDA和H2O2含量的測定，利用鹽酸羥胺法進(jìn)行氧自由基產(chǎn)生速率的測定，利用氮藍(lán)四唑法、愈創(chuàng)木酚法和紫外吸收法分別進(jìn)行SOD、POD和CAT活性的測定（鄒琦，2000；高俊鳳，2006；張志良等，2009）。

1.3 葡萄芽總RNA的提取和cDNA的合成

取‘水晶’葡萄芽于研缽中，加入適量液氮研磨成粉末后，取葡萄芽粉末迅速轉(zhuǎn)移至2.0 mL滅菌離心管中，加入1 mL TPIzol提取液上下輕柔混勻后，加入200 μL氯仿于室溫放置5 min，12 000 r·min-1、4 ℃條件下離心10 min；取上清液于1.5 mL滅菌離心管中，加入500 μL異丙醇后混勻，12 000 r·min-1、4 ℃條件下離心10 min，倒去濾液；加入1 mL 75%乙醇，用移液槍輕柔吹洗數(shù)下后倒去乙醇（該步驟重復(fù)2次），室溫下放置2～3 min，風(fēng)干沉淀，加DEPC水100 μL溶解RNA，用移液槍輕柔吹洗混勻，置于-80 ℃?zhèn)溆谩DNA第1鏈?zhǔn)褂肨aKaRa公司的PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成，方法參照說明書，獲得的cDNA馬上進(jìn)行后續(xù)PCR擴(kuò)增或置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 VvFTs和VvCBF全長cDNA克隆

以GenBank中多個FT（GenBank：JN214350.1、KP099711.1、JN214351.1、KF881011.1）和CBF（GenBank：HQ908653.1、JX464665.1、XM_021947969.1、KU587043.1） 同源基因序列進(jìn)行比對，使用Premier 5.0設(shè)計引物并由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成，相關(guān)引物堿基序列見表1。使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系（50 μL）：10 μL的5× PrimeSTAR Buffer（Mg2+ Plus），4 μL的dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1 each），0.5 μL的 PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U·μL-1），正向引物（F）和反向引物（R）各1 μL，2 μL的cDNA，31.5 μL的滅菌蒸餾水。PCR擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，58 ℃復(fù)性10 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸2 min。擴(kuò)增結(jié)束后，PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上點樣進(jìn)行電泳檢測，切膠回收獲得的目的條帶，利用Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR試劑盒在目的條帶3′端添加A堿基后，連接pMD20-T vector載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑出陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，最終獲得2個‘水晶’葡萄FT基因，分別命名為VvFT1和VvFT2，獲得‘水晶’葡萄CBF基因1個，命名為VvCBF。

1.5 VvFT1、VvFT2和VvCBF基因生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 8進(jìn)行堿基序列的比對和蛋白質(zhì)序列翻譯；使用ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行蛋白質(zhì)分子量和理論等電點分析；使用GOR4（http：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）和NetSurfP3.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetSurfP-3.0/）在線工具預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)；使用SWISS-MODEL（http：//www.swissmodel.expasy.org/interactive）進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測；使用NCBI中的CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）數(shù)據(jù)庫對蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；使用MEGA-X軟件，采用相鄰連接方法（Neighbor-Joining，NJ）、Poisson模型、Complete deletion模式建樹，Bootstrap值取1 000，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.6 VvFT1、VvFT2和VvCBF基因qRT-PCR檢測

用PrimeScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒進(jìn)行第1鏈cDNA的逆轉(zhuǎn)錄合成后，再使用TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）進(jìn)行 qRT-PCR 反應(yīng)，操作方法參照說明書。以UBQ基因作為內(nèi)參基因（張永福等，2022），對單氰胺誘導(dǎo)后的‘水晶’葡萄芽的VvFT1、VvFT2和VvCBF基因進(jìn)行qRT-PCR檢測，引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單氰胺噴施后‘水晶’葡萄芽中MDA、SOD、POD、CAT、H2O2和氧自由基產(chǎn)生速率變化

MDA、SOD、POD、CAT、H2O2和氧自由基產(chǎn)生速率生理生化指標(biāo)是芽萌發(fā)的重要指標(biāo)，在芽萌發(fā)的過程中起到重要作用。本研究對單氰胺處理‘水晶’葡萄芽后分別在第0、第7、第14、第21、第28天進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測定（圖1）。由圖1可知，單氰胺處理后葡萄芽的MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性、H2O2含量和氧自由基產(chǎn)生速率均在不同時期得到提升。其中，單氰胺處理后葡萄芽的MDA含量、H2O2含量和氧自由基產(chǎn)生速率在第0、第7、第14、第21、第28天呈先上升后降低的趨勢；但是未處理單氰胺的條件（對照，CK）下，MDA含量、H2O2含量和氧自由基產(chǎn)生速率在第0、第7、第14、第21、第28天呈上升趨勢。單氰胺處理下，葡萄芽內(nèi)MDA含量在第21天最高，H2O2含量在第7天最高，氧自由基產(chǎn)生速率則在第14天最高。但值得注意的是，單氰胺處理后的MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性、H2O2含量和氧自由基產(chǎn)生速率在第7、第14、第21、第28天均較CK高。單氰胺噴施后MDA含量在第7、第14、第21、第28天較CK分別提高了98.20%、96.22%、96.05%和47.29%（圖1：A）；SOD和POD可通過分解活性氧來防止膜脂被氧化破壞，其活性與防止膜脂被氧化破壞的能力呈正相關(guān)，SOD活性在第7、第14、第21、第28天較CK分別提高了23.51%、49.73%、45.80%和52.78%（圖1：B），POD活性在第7、第14、第21、第28天較CK分別提高了59.34%、41.03%、40.55%和43.00%（圖1：C）；CAT活性在第7、第14、第21、第28天較CK分別提高了80.86%、136.18%、115.21%和100.65%（圖1：D）；H2O2含量在第7、第14、第21、第28天較CK分別提高了67.51%、31.31%、20.88%和26.51%（圖1：E）；氧自由基產(chǎn)生速率在第7、第14、第21、第28天較CK分別提高了149.48%、161.41%、80.39%和6.13%（圖1：F）?？梢?，可通過噴施單氰胺誘導(dǎo)葡萄芽的MDA、SOD、POD、CAT、H2O2和氧自由基產(chǎn)生速率的生理生化反應(yīng)從而使葡萄打破休眠，提前萌發(fā)，在單氰胺噴施‘水晶’葡萄后第28天葡萄芽生長明顯較CK長（圖2）。

2.2 葡萄VvFT1、VvFT2和VvCBF基因全長cDNA克隆

為探明單氰胺破除‘水晶’葡萄休眠的分子機(jī)制，本研究以單氰胺處理‘水晶’葡萄后第28天的葡萄芽作為材料提取其總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后獲得其cDNA為模板，用特異性引物進(jìn)行VvFT1、VvFT2和VvCBF基因的擴(kuò)增。VvFT1和VvFT2擴(kuò)增出的大小約為500 bp，VvCBF擴(kuò)增出的大小約為800 bp，均與目標(biāo)基因大小一致（圖3）。將VvFT1、VvFT2和VvCBF基因的克隆進(jìn)行測序，最終獲得VvFT1和VvFT2的基因序列為525 bp，VvCBF基因序列為826 bp，通過DNAMAN 8.0分析得出VvFT1和VvFT2基因編碼174個氨基酸（aa），VvCBF基因在第712至第715核苷酸為終止密碼子，因此VvCBF基因編碼237 aa。

2.3 VvFT1和VvFT2氨基酸序列的理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測、進(jìn)化樹及其氨基酸保守結(jié)構(gòu)域分析

2.3.1 VvFT1和VvFT2氨基酸序列的理化性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 利用ProtParam tool在線工具對VvFT1和VvFT2基因的多肽鏈氨基酸數(shù)目、分子式、等電點、相對分子量等進(jìn)行預(yù)測。VvFT1基因共編碼174 aa，分子式為C874H1359N247O256S4，分子質(zhì)量為19.55 kDa，理論等電點（pI）為8.81，含2 740個原子；VvFT2基因共編碼174 aa，分子式為C856H1335N245O263S6，分子質(zhì)量為19.46 kDa，pI為6.11，含2 705個原子。利用GOR4和NetSurfP 3.0 在線分析軟件對VvFT1和VvFT2基因編碼的蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，結(jié)果顯示在組成VvFT1蛋白的174個氨基酸中，無規(guī)則卷曲占62.64%、α-螺旋占9.77%、折疊延伸鏈占27.59%（圖4：A）；在組成VvFT2蛋白的174個氨基酸中，無規(guī)則卷曲占70.11%、α-螺旋占2.30%、折疊延伸鏈占27.59%（圖4：B）。利用SWISS-MODEL在線工具進(jìn)行預(yù)測后發(fā)現(xiàn)，VvFT1（圖4：C）和VvFT2（圖4：D）蛋白的結(jié)果也包括無規(guī)則卷曲、α-螺旋和折疊延伸鏈，其中無規(guī)則卷曲含量，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。綜上所述，VvFT1和VvFT2基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)中占比由高到低均為無規(guī)則卷曲、 折疊延伸鏈、α-螺旋，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的主要作用是決定蛋白質(zhì)功能，說明VvFT1和VvFT2蛋白在單氰胺破除葡萄休眠過程中可能具有重要功能。

2.3.2 VvFT1和VvFT2氨基酸保守結(jié)構(gòu)域分析 使用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫預(yù)測葡萄 VvFT1和VvFT2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，圖5：A、B結(jié)果顯示葡萄VvFT1和VvFT2蛋白的氨基酸序列具有PEBP超家族結(jié)構(gòu)域，其底物結(jié)合位點為第70位至第119位氨基酸。同時，經(jīng)過BLAST比對分析，選擇與VvFT1同源性最高的2個FT，即荔枝 （Litchi chinensis，LcFT：AEU08960.1）和龍眼（Dimocarpus longan，DlFT2：ALA55998.1），氨基酸同源性分別為94.83%和93.68%，以及VvFT2同源性最高的2個FT，即荔枝（Litchi chinensis，LcFT：AEU08961.1）和龍眼（Dimocarpus longan，DlFT2：AHF27444.1），氨基酸同源性分別為95.98%和93.68%。利用DNAMAN 8軟件進(jìn)行氨基酸序列比對分析，圖5：C結(jié)果顯示 VvFT1和VvFT2的氨基酸序列包含DPPAP和GIHR模塊，具有PEBP家族典型功能結(jié)構(gòu)域，并且VvFT1和VvFT2均具有關(guān)鍵的保守氨基酸位點Tyr84（Y）和Cln139（Q），具有 FT 活性起關(guān)鍵作用的11個保守氨基酸殘基序列（RQTxYAPGWRQ）。綜上所述，利用NCBI中CDD數(shù)據(jù)庫以及同源比對分析結(jié)果顯示，VvFT1和VvFT2具有PEBP家族典型功能結(jié)構(gòu)域，并且該結(jié)構(gòu)域保守，說明該結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍坠δ艿陌l(fā)揮非常重要。

2.3.3 VvFT1和VvFT2蛋白進(jìn)化樹構(gòu)建 VvFT1和VvFT2序列分析表明，核苷酸同源性為90.29%，氨基酸同源性為83.30%，將獲得的VvFT1和VvFT2蛋白序列BLAST比對后下載同源性最高的10種植物FT蛋白序列及葡萄中同源性高的2個FT蛋白序列，利用MEGA-X構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)，與VvFT1同源性最高的FT蛋白序列依次為LcFT（AEU08960.1）、DlFT2（ALA55998.1）、歐洲栓皮櫟（Quercus suber， QsFT：XP_023899320.1）、水青岡（Fagus crenata，F(xiàn)cFT：BAP28173.1）、棗（Ziziphus jujuba，ZjFT：XP_015873598.1）、糙葉山黃麻（Parasponia andersonii，PanFT：PON55382.1）、可可（Theobroma cacao，TcFT： XP_007028083.1）、銀白楊（Populus alba，PaFT：KAJ6891859.1）、毛白楊（P. tomentosa，PtFT：AFU08240.1）、金銀花（Lonicera japonica，LjFT：WGO49542.1）、葡萄（Vitis vinifera，VvFT：ABF56526.1）和VvFT（NP_001267907.1），與VvFT1蛋白同源性分別為94.83%、93.68%、86.78%、85.06%、85.63%、84.48%、84.48%、83.91%、83.91%、83.33%、80.46%和79.31%。與VvFT2同源性最高的FT蛋白序列依次為LcFT（AEU08961.1）、DlFT2（AHF27444.1）、歐洲栓皮櫟、水青岡、番木瓜（Carica papaya，CpFT：XP_021911503.1）、棗、獨腳金（Striga hermonthica， ShFT：CAA0821245.1）、毛果楊（Populus trichocarpa，PtFT：XP_002311264.1）、月季（Rosa chinensis，RcFT：XP_024189593.1）、枇杷（Rhaphiolepis bibas，RbFT2：ALA56300.1）、VvFT（ABF56526.1）和VvFT（NP_001267907.1），與VvFT2蛋白同源性分別為95.98%、 93.68%、85.63%、85.06%、84.48%、84.48%、84.48%、83.33%、83.33%、83.33%、81.03%和79.89%。FT的系統(tǒng)發(fā)生較為復(fù)雜，VvFT1和VvFT2與荔枝和龍眼聚成一支，遺傳距離較近，而其余植物FT蛋白聚成一支（圖6），這說明 FT 在物種之間發(fā)生分化較早且分化差異較高。

2.4 VvCBF氨基酸序列的理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測、進(jìn)化樹及其氨基酸保守結(jié)構(gòu)域分析

2.4.1 VvCBF氨基酸序列的理化性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 用ProtParam tool在線工具對VvCBF基因的多肽鏈氨基酸數(shù)目、分子式、等電點、相對分子量等進(jìn)行預(yù)測。VvCBF基因共編碼237 aa，分子式為C1158H1839N335O354S15，分子質(zhì)量為26.60 kDa， pI為8.31，含3 701個原子。用GOR4對VvCBF基因編碼的蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，圖7：A結(jié)果顯示在組成VvCBF蛋白中α-螺旋占32.91%、折疊延伸鏈占22.36%、無規(guī)則卷曲占44.73%。用SWISS-MODEL在線工具進(jìn)行預(yù)測后發(fā)現(xiàn)，VvCBF蛋白中無規(guī)則卷曲和α-螺旋含量最多，而折疊延伸鏈含量最少，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致（圖7：B）。

2.4.2 VvCBF氨基酸保守結(jié)構(gòu)域分析 使用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫預(yù)測葡萄 VvCBF蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，圖8：A結(jié)果顯示葡萄VvCBF蛋白的氨基酸序列具有AP2超家族結(jié)構(gòu)域，其DNA結(jié)合位點第58位至第86位氨基酸。同時，經(jīng)過BLAST比對分析，選擇與VvCBF同源性最高的2個CBF，即野扁桃（Prunus ledebouriana，PlCBF：AEB69782.1）和山桃（P. davidiana，PdCBF：AFU54607.1），氨基酸同源性分別為100%和95.40%。利用DNAMAN 8軟件進(jìn)行氨基酸序列比對分析，圖8：B結(jié)果顯示 VvCBF的氨基酸序列存在 AP2 DNA 結(jié)合域以及位于該結(jié)合域兩端的特征序列 PKK/RAGRRVFKETRHP和DSAWR（典型的CBFs轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白結(jié)構(gòu)）。

2.4.3 VvCBF蛋白進(jìn)化樹構(gòu)建 將獲得的VvCBF蛋白序列進(jìn)行BLAST比對分析后，下載同源性最高的10種植物CBF蛋白序列及葡萄中同源性高的2個CBF蛋白序列，利用MEGA-X構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)，與VvCBF同源性最高的CBF蛋白均為薔薇科植物，依次為PlCBF（AEB69782.1）、PdCBF（AFU54607.1）、甜櫻桃（Prunus avium，PaCBF：XP_021803661.1）、梅（P. mume，PmuCBF：ANW82784.1）、光核桃（P. mira，PmCBF：AFU54606.1）、桃（P. persica，PpeCBF：XP_007209842.2）、櫻花（P. yedoensis，PyCBF：PQQ14279.1）、扁桃（P. dulcis，PduCBF4：BBH03298.1）、杏（P. armeniaca，ParCBF：AWR88517.1）、櫻桃（P. pseudocerasus，PpCBF：AIU39990.1）、VvCBF4（AFV73334.1）和VvCBF4（AIL00786.1），同源性分別為100%、95.40%、94.94%、94.94%、94.14%、94.14%、94.09%、94.09%、78.01%、74.69%、39.66%和39.66%。圖9結(jié)果顯示，VvCBF與PlCBF（AEB69782.1）聚為一支，PpCBF（AIU39990.1）和ParCBF（AWR88517.1）分別單獨成一支，VvCBF4（AFV73334.1）和VvCBF4（AIL00786.1）分別單獨成一支，其他植物CBF聚為一支，說明VvCBF與野扁桃CBF蛋白同源性最高及親緣關(guān)系最近。

2.5 單氰胺噴施后‘水晶’葡萄芽中VvFT1、VvFT2和VvCBF基因的相對表達(dá)量

通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，噴施單氰胺后，葡萄的VvFT1和VvFT2基因在第7、第14、第21、第28天，均高于其CK。 ‘水晶’葡萄的VvFT1基因表達(dá)量在第7天較CK增加了135.88%，第14天增加了120.12%，第21天增加了47.13%，第28天增加了57.76%（圖10：A）；VvFT2基因的表達(dá)量在第7天較CK增加了390.08%，第14天增加了142.32%，第21天增加了129.20%，第28天增加了64.90%（圖10：B）；VvCBF基因的表達(dá)量在第7天較CK降低了26.45%，第14天降低了50.30%，第21天降低了39.87%，第28天降低了13.05%（圖10：C）。植物的FT和CBF基因在植物休眠過程中起重要作用，并且FT與CBF基因在此過程中呈負(fù)相關(guān)。本試驗結(jié)果顯示，單氰胺噴施提高了VvFT1和VvFT2基因表達(dá)量，而降低了VvCBF基因的基因表達(dá)量，表明單氰胺噴施葡萄可誘導(dǎo)其葡萄FT基因表達(dá)量的增加和CBF基因表達(dá)量的降低，從而打破葡萄的休眠，促進(jìn)葡萄提前萌發(fā)進(jìn)入生長發(fā)育。

3 討論與結(jié)論

‘水晶’葡萄具有較高的營養(yǎng)價值，深受大眾的喜愛（田竹希等，2021），單氰胺常作為‘水晶’葡萄的破眠劑，促進(jìn)葡萄提前萌芽，但是目前FT和CBF在破除葡萄休眠方面的機(jī)制研究較少（Vergara et al.， 2016）。本研究首先測定了單氰胺處理 ‘水晶’葡萄后芽內(nèi)SOD、POD和CAT活性，MDA和H2O2含量及氧自由基產(chǎn)生速率的變化，并通過RT-PCR技術(shù)克隆得到其在單氰胺破除葡萄休眠過程中起重要作用的VvFT1、VvFT2和VvCBF基因，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和表達(dá)水平差異分析，為單氰胺破除葡萄休眠的生理和分子機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。邵浩和馬鋒旺（2004）研究表明，CAT、POD、SOD、MDA、H2O2及氧自由基產(chǎn)生速率等生理生化反應(yīng)是植物解除休眠過程中的重要指標(biāo)，梨樹在解除休眠的過程中，氧自由基產(chǎn)生速率和H2O2含量呈先升高后降低的趨勢，SOD和POD活性呈上升趨勢，這與本研究單氰胺處理的‘水晶’葡萄結(jié)果一致，但其CAT呈下降趨勢，與本研究結(jié)果相反。POD活性和CAT是植物體內(nèi)重要的H2O2相關(guān)抗氧化酶，能夠?qū)⑵浞纸鉃镺2和H2O，構(gòu)成抗氧化酶防御系統(tǒng)（Mittler， 2002；譚一婷等，2021），在本研究中，單氰胺處理后葡萄芽的POD活性和CAT活性均升高且在第7、第14、第21、第28天均高于其CK，單氰胺噴施后第7天葡萄芽中H2O2含量達(dá)到最高值，后續(xù)逐漸下降，說明POD活性和CAT活性的升高有效地促進(jìn)了H2O2分解，降低了H2O2的含量，有利于葡萄芽的萌發(fā)。

研究表明水仙花和獼猴桃的FT轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)其休眠過程中發(fā)揮重要作用（Varkonyi-Gasic et al.， 2013；Feng et al.， 2015），本研究也表明FT轉(zhuǎn)錄因子在單氰胺打破葡萄芽休眠的過程中起到重要作用。AP2/ERF超家族是一個大的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子家族，成員眾多，參與植物的生長、發(fā)育和逆境反應(yīng)等重要過程，根據(jù)AP2結(jié)構(gòu)域和其他DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，將AP2/ERF 超家族轉(zhuǎn)錄因子分為4個家族，即AP2、ERF、RAV和Soloist家族，其中ERF家族又被劃分為ERF和DREB亞家族，CBF轉(zhuǎn)錄因子則是DREB亞家族的一員（Mizoi et al.， 2012; Shu et al.， 2015）。吳家敏（2018）研究表明AP2/ERF 超家族中的ERF轉(zhuǎn)錄因子參與單氰胺打破葡萄休眠過程。然而，DREB亞家族轉(zhuǎn)錄因子是否也參與此過程卻暫無報道。本研究證明了‘水晶’葡萄的CBF轉(zhuǎn)錄因子VvCBF也參與單氰胺打破葡萄休眠的過程，但目前，AP2/ERF 超家族的 AP2和RAV等轉(zhuǎn)錄因子是否也參與單氰胺打破葡萄休眠的過程，值得進(jìn)一步研究。據(jù)報道CBF是植物冷脅迫和休眠過程中DAM（Dormancy-associated MADS-box）基因的上游反式因子，DAM可以直接調(diào)控FT轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，說明CBF與FT之間可以通過DAM相互影響且呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（Horvath et al.， 2008；Saito et al.， 2015），與本研究結(jié)果一致，在單氰胺打破‘水晶’葡萄芽休眠的過程中，VvFT1和VvFT2基因表達(dá)均隨著時間增加而上調(diào)，而VvCBF基因表達(dá)隨著時間增加而下調(diào)，VvFTs與VvCBF基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

本研究通過BLAST分別下載與VvFT1、VvFT2和VvCBF蛋白的氨基酸同源性最高的10個相關(guān)蛋白，比對發(fā)現(xiàn)與VvFT1氨基酸同源性大于90%的僅有2個 ［LcFT（AEU08960.1）、DlFT2（ALA55998.1）］，與VvFT2氨基酸同源性大于90%的也僅有2個 ［LcFT（AEU08961.1）、DlFT2（AHF27444.1）］，這4個蛋白分屬于荔枝和龍眼的FT基因且通過進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)VvFT1、VvFT2、LcFT（AEU08960.1）、DlFT2（ALA55998.1）、LcFT（AEU08961.1）和DlFT2（AHF27444.1）聚為一支，說明‘水晶’葡萄、荔枝和龍眼FT轉(zhuǎn)錄因子在進(jìn)化上較近，但是功能上是否可實現(xiàn)互補(bǔ)需要進(jìn)行后續(xù)的研究。經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)與VvCBF氨基酸同源性大于90%的有8個，除PlCBF（AEB69782.1）目前被劃分為薔薇科李屬（Orazov et al.， 2022），其余9個CBF轉(zhuǎn)錄因子均歸屬于薔薇科桃屬植物，表明‘水晶’葡萄CBF與薔薇科（特別是桃屬）植物CBF轉(zhuǎn)錄因子在進(jìn)化上具有重要聯(lián)系。

本研究通過cDNA克隆技術(shù)獲得了‘水晶’葡萄VvFT1、VvFT2和VvCBF基因，并對其編碼的蛋白做了較詳細(xì)的生物信息學(xué)功能預(yù)測分析，為VvFT1、VvFT2和VvCBF基因的功能研究起到參考作用；并利用qRT-PCR技術(shù)對VvFT1、VvFT2和VvCBF基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)VvFT1和VvFT2與VvCBF基因的表達(dá)量呈反比且受單氰胺處理的影響，說明VvFT1、VvFT2和VvCBF基因在單氰胺打破葡萄芽休眠的過程中起重要作用。在此基礎(chǔ)上，本研究還對單氰胺處理葡萄后其芽內(nèi)多項生理生化指標(biāo)進(jìn)行了測定，進(jìn)一步從生理機(jī)制方面解釋了單氰胺打破葡萄休眠的機(jī)制，為葡萄生產(chǎn)提供了理論指導(dǎo)。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）

基金項目： "國家自然科學(xué)基金（32060645）； 云南省地方本科高校基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項資金重點項目（202101BA070001-036）； 云南省教育廳科學(xué)研究基金（2023Y0876，2023Y0860，2023J0828）。

第一作者： 李小琴（1990—），博士，講師，從事園藝與植物保護(hù)研究，（E-mail）xiaoqinliarti@yeah.net。

*通信作者： "張永福，博士，教授，從事果樹育種及栽培技術(shù)研究，（E-mail）123017360@qq.com。