龍牙百合遠(yuǎn)緣雜交后代鑒定及枯萎病抗性評(píng)價(jià)

摘 要： "龍牙百合（Lilium brownii var. viridulum）在栽培過程中容易感染枯萎病，而觀賞百合中的部分品種具有較強(qiáng)的枯萎病抗性。為了培育抗枯萎病的龍牙百合雜交后代，該文選擇抗病性強(qiáng)的觀賞百合品種與龍牙百合分別進(jìn)行正交和反交，通過SSR分子標(biāo)記鑒定雜種的真實(shí)性，并對(duì)雜交后代的枯萎病抗性進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：（1）‘Black stone’等亞洲百合雜種系品種枯萎病抗病性較強(qiáng)，而龍牙百合、‘Pink planet’等品種枯萎病抗性最弱。（2）將龍牙百合作母本的正交組合共獲得28個(gè)蒴果，最終獲得3株龍牙百合 × ‘Black stone’的雜種苗；將龍牙百合作父本的反交組合共獲得74個(gè)蒴果，最終獲得1株‘Strawberry event’×龍牙百合的雜種苗。（3）SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果顯示，龍牙百合 × ‘Black stone’的3個(gè)雜種株系為真實(shí)雜種，‘Strawberry event’×龍牙百合的1個(gè)雜種株系為假雜種。（4）所獲得的3個(gè)龍牙百合 × ‘Black stone’雜種株系枯萎病抗性均為中抗。該研究結(jié)果為龍牙百合與觀賞百合的遠(yuǎn)緣雜交提供了技術(shù)參考，也為后期培育枯萎病抗性強(qiáng)的百合新品種提供了材料基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 龍牙百合， 遠(yuǎn)緣雜交， 枯萎病抗性， 胚珠培養(yǎng)， SSR分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)： "Q945.8"文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： "A

文章編號(hào)： "1000-3142（2024）12-2172-15

Identification and Fusarium wilt resistance evaluation of distant hybrid offspring of Lilium brownii var. viridulum

LI Ze1，2， CHEN Miao1，2， ZHOU Li4， SUN Mengshan 4， XIANG Wei1，

MA Jie5， ZHENG Sixiang 4， ZENG Jianguo 3， LI Yufan 1，2*

（ 1. College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China; 2. Hunan Mid-Subtropical Quality Plant Breeding andUtilization Engineering Technology Research Center， Changsha 410128， China; 3. College of Veterinary Medicine， Hunan AgriculturalUniversity， Changsha 410128， China; 4. Hunan Institute of Agricultural Environmental Ecology， Changsha 410128，China; 5. Hunan Cotton Research Institute， Changde 415000， Hunan， China ）

Abstract： "During the cultivation process of Lilium brownii var. viridulum， it is easy to be infected with wilt disease， while some varieties of ornamental lilies have strong resistance to wilt disease. The study aimed to create hybrids with improved resistance to wilt disease by crossbreeding Lilium brownii var. viridulum with various ornamental lily varieties. Disease-resistant ornamental lily cultivars were specifically chosen for reciprocal crosses with Lilium brownii var. viridulum. The authenticity of the hybrids was confirmed through SSR molecular markers， and the resistance of the hybrid offspring to wilt disease was subsequently assessed. The results were as follows： （1） Lilium Asiatic hybrids such as ‘Black stone’ had strong resistance to Fusarium wilt， while Lilium brownii var. viridulum and ‘Pink planet’ had the weakest resistance to Fusarium wilt. （2） A total of 28 capsules were obtained from the orthogonal combination using Lilium brownii var. viridulum as the maternal parent， and three Lilium brownii var. viridulum × ‘Black stone’ hybrid seedlings were finally obtained. The cross combination of Lilium brownii var. viridulum as the male parent obtained a total of 74 capsules， and ultimately obtained a hybrid seedling of ‘Strawberry event’ × Lilium brownii var. viridulum. （3） SSR molecular marker identification results showed that three hybrid seedlings of Lilium brownii var. viridulum" × ‘Black stone’ were real hybrids， while one hybrid seedlings of ‘Strawberry event’ × Lilium brownii var. viridulum was a 1 hybrid. （4） The three Lilium brownii var. viridulum × ‘Black stone’ hybrid seedlings obtained had moderate resistance to Fusarium wilt. This study provides a reference for the distant hybridization of Lilium brownii var. viridulum and ornamental lilies， and proves that Lilium brownii var. viridulum" hybrids with Fusarium wilt resistance can be obtained through hybridization. This study provides a technical guidance for the distant hybridization of Lilium brownii var. viridulum" with ornamental lily varieties， laying the groundwork for the breeding of new lily varieties with enhanced resistance to wilt disease in the future.

Key words： Lilium brownii var. viridulum， distant hybridization， Fusarium wilt resistance， ovule culture， SSR molecular markers

龍牙百合（Lilium brownii var. viridulum）主產(chǎn)于湖南、江西、貴州、四川等地，是我國(guó)傳統(tǒng)的食用百合栽培種類，亦是一種道地藥材。此外，龍牙百合觀賞價(jià)值較高，是一種藥食賞兼用的多功能植物，在鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮重要作用。近年來，湖南、江西等龍牙百合主產(chǎn)區(qū)面臨著因品種退化、土傳病害嚴(yán)重而導(dǎo)致的連作障礙問題（蔣思佳，2023）。百合栽培過程中面臨的土傳病害是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）引起的枯萎?。≒rados-Ligero et al.， 2008；王麗波等，2018；Sun et al.， 2024），通常采用化學(xué)方式進(jìn)行防治。但是，由于化學(xué)防治容易造成農(nóng)殘含量超標(biāo)等一系列問題，而利用抗性品種進(jìn)行枯萎病防治則更加安全、環(huán)保，因此利用雜交進(jìn)行龍牙百合抗性育種具有重要意義。目前，雜交育種既是培育百合新品種的主要手段，也是近代育種工作中最常采取的方法，育種學(xué)家已經(jīng)培育出大量枯萎病抗性強(qiáng)的觀賞百合品種（楊秀梅等，2010；龍彬等，2018）。然而，鮮有人利用雜交育種進(jìn)行龍牙百合抗病性種質(zhì)創(chuàng)新。

目前，已有大量學(xué)者對(duì)不同百合品種的枯萎病抗性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。其中，亞洲百合雜種系（Lilium Asiatic hybrids）的抗性最強(qiáng)，麝香百合雜種系（Lilium longiflorum hybrids）的抗性次之，東方百合雜種系（Lilium Oriental hybrids）的抗性最弱（Lim et al.， 2003；楊秀梅等，2010）。由于百合商業(yè)栽培品種更新較快，因此近年來暢銷的觀賞百合栽培品種的枯萎病抗性并未獲得鑒定。已有一些學(xué)者將易感枯萎病的百合品種與枯萎病抗性強(qiáng)的百合品種進(jìn)行雜交，成功選育出抗枯萎病的雜交后代。例如，謝松林（2011）將易感枯萎病的麝香百合‘White fox’與具有枯萎病抗性的亞洲百合‘Connecticut king’進(jìn)行雜交，獲得了具有枯萎病抗性的雜種后代；龍彬等（2018）利用枯萎病抗性強(qiáng)的東方百合‘Huaxianzi’作母本參與雜交，培育出了對(duì)鐮刀菌有很強(qiáng)抗性的東方百合新品種‘驚鴻’。利用枯萎病抗性強(qiáng)的觀賞百合與易感枯萎病的龍牙百合進(jìn)行雜交，有望獲得具有枯萎病抗性的龍牙百合新種質(zhì)。當(dāng)前，有關(guān)龍牙百合的雜交育種研究主要聚焦于培育賞食兼用的龍牙百合雜交后代，如武利可（2020）將萬載龍牙百合和蘭州百合（Lilium davidii var. unicolor）進(jìn)行雜交，崔羅敏（2021）將三倍體觀賞百合與二倍體食用龍牙百合進(jìn)行雜交。以上2個(gè)研究均成功獲得了雜交后代，但未對(duì)親本及后代的抗病性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

雖然枯萎病已成為遏制龍牙百合種球生產(chǎn)的重要因素之一，但有關(guān)培育龍牙百合抗枯萎病雜交后代的研究鮮見報(bào)道。因此，本研究以湖南省隆回縣的龍牙百合，以及目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上暢銷的14個(gè)百合栽培品種為材料，對(duì)其進(jìn)行枯萎病的抗性評(píng)價(jià)，將篩選出抗病性強(qiáng)的百合栽培品種與龍牙百合分別進(jìn)行正交和反交，并對(duì)雜交后代進(jìn)行枯萎病抗性鑒定，以期為龍牙百合的遠(yuǎn)緣雜交提供參考，為后期培育抗性強(qiáng)的百合新品種提供材料基礎(chǔ)。本研究擬探討以下問題：（1）參與雜交的親本材料的枯萎病抗性；（2）通過重復(fù)授粉、子房切片及胚珠離體培養(yǎng)能否克服龍牙百合遠(yuǎn)緣雜交障礙；（3）通過SSR分子標(biāo)記鑒定以及雜交后代的枯萎病抗性鑒定能否鑒定出具有枯萎病抗性的龍牙百合雜交后代。

1 材料與方法

1.1 材料

研究所用植物材料包括傳統(tǒng)栽培變種龍牙百合（購(gòu)自湖南一線情農(nóng)業(yè)有限公司）和觀賞百合栽培品種（5個(gè)雜種系14個(gè)品種，均購(gòu)自浙江的虹越花卉股份有限公司和湖南的龍山縣印家界生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司）。其中，亞洲百合雜種系品種（A）為‘金百合’、‘Tresor’、‘Red county’、‘Peter’、‘Black stone’、‘Secret kiss’、‘Strawberry event’；東方百合雜種系品種（O）為‘Sorbonne’；麝香百合雜種系品種（L）為新鐵炮百合（Lilium×formolongi）、‘Pink planet’；麝亞百合雜種系品種（Lilium longiflorum hybrids×Lilium Asiatic hybrids，LA）為‘Yellow brush’、‘Brindisi’；麝東百合雜種系品種（Lilium longiflorum hybrids×Lilium Oriental hybrids，LO）為‘Cali’、‘Magnefique’。以上植物材料的種球均于2022年春季栽培于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林花卉基地，植物材料開花圖片如圖1所示。供試菌種尖孢鐮刀菌（菌株編號(hào)為ACCC37262，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心），該菌為百合枯萎病的致病菌。菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，37 g·L-1，置于25 ℃下培養(yǎng)7 d后保存于4 ℃冰箱待用。

1.2 方法

1.2.1 枯萎病抗性鑒定 對(duì)所有百合材料采用離體葉片接種法進(jìn)行枯萎病抗性鑒定。（1）離體葉片的準(zhǔn)備：每個(gè)百合品種選擇生長(zhǎng)健壯發(fā)育階段一致的植株，每個(gè)品種分別從上、中、下 3個(gè)部位等量摘取葉片，共摘取30片葉片。（2）菌絲塊的準(zhǔn)備：用直徑為0.5 cm的打孔器將尖孢鐮刀菌打成菌絲塊，待用。（3）接種：將摘取的葉片用75%酒精滅菌15 s，用無菌水沖洗干凈，擺放于鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿上，濾紙用無菌水保濕；用接種針挑取菌絲塊，每個(gè)葉片上分別接種2個(gè)菌絲塊，菌絲面朝下和葉片充分接觸；將葉片基部用濕潤(rùn)的棉球覆蓋，接種完成后包上保鮮膜，置于25 ℃條件下培養(yǎng)，分別于1 d、3 d、5 d、7 d、9 d的同一時(shí)間調(diào)查葉片的發(fā)病情況，每日觀察時(shí)在濾紙上滴加無菌水。

百合尖孢鐮刀菌侵染葉片致病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)、枯萎病抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照朱麗梅等（2012）的方法?？菸∪~部病斑分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)，無病斑；1級(jí)，葉片病斑較少，病斑面積占整片葉面積的 5%以下；3級(jí)，病斑較多，病斑面積占整個(gè)葉面積的 5%～30%；5級(jí)，病斑較多，病斑面積占整個(gè)葉面積的 31%～50%；7級(jí)，病斑很多或融合成大斑，病斑面積占整個(gè)面積的比例在50%以上。根據(jù)相對(duì)抗性指數(shù)進(jìn)行抗性劃分，抗性水平及對(duì)應(yīng)的相對(duì)抗性指數(shù)分別為高抗（HR）=0.70～1.00、中抗（MR）=0.40～0.69、中感（MS）=0.20～0.39、高感（HS）lt;0.20。

病情指數(shù)的計(jì)算公式如下：

病情指數(shù)（%）=Σ（病級(jí)葉片數(shù)×病級(jí)代表值）/（調(diào)查總?cè)~片數(shù)×最高病級(jí)代表值）×100；相對(duì)抗性指數(shù)（%）=100-相對(duì)病情指數(shù)。

1.2.2 雜交組合與雜交方式的確定 根據(jù)不同百合種及品種的枯萎病抗病程度、前期測(cè)定的花粉生活力情況，確定雜交組合。選擇枯萎病抗性為高抗、中抗的觀賞百合栽培品種與龍牙百合分別進(jìn)行正交和反交，作父本的觀賞百合栽培品種要求具有較強(qiáng)的花粉生活力。采用常規(guī)雜交授粉方式，分別于花蕾期、盛花期、末花期進(jìn)行不同時(shí)期授粉，每天早、中、晚重復(fù)授粉3次，每個(gè)雜交組合雜交 30 朵花以上，授粉后套袋，并掛上標(biāo)簽（周敏等，2023）。授粉后30 d統(tǒng)計(jì)子房膨大率，子房膨大率（%）=膨大子房數(shù)/授粉花朵數(shù)×100。

1.2.3 子房切片培養(yǎng)及胚珠離體培養(yǎng) 授粉50 d后，摘下尚未成熟的子房，刷洗表面污垢，于自來流水下沖洗1 h左右，在組培臺(tái)上用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3次，放于10%次氯酸鈉溶液（NaClO）中不斷搖晃5 min，無菌水沖洗5次，置于接種盤上將子房橫切為0.3 cm的薄切片；之后接種在子房切片培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為1/2 MS+30 g·L-1蔗糖+0.01 mg·L-1萘乙酸（NAA）+0.1 mg·L-1 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+7.5 g·L-1瓊脂，pH值為5.8～6.0。培養(yǎng)25 d后，將膨大胚珠取出放于胚珠離體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為MS+30 g·L-1蔗糖+0.01 mg·L-1 NAA+7.5 g·L-1瓊脂，pH值為5.8～6.0。大約2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)胚珠的萌發(fā)率，胚珠萌發(fā)率（%）=萌發(fā)出苗的胚珠數(shù)/膨大胚珠數(shù)×100。

1.2.4 雜種苗SSR分子標(biāo)記鑒定 采用SSR分子標(biāo)記鑒定雜種的真實(shí)性，采集雜種苗及其親本的新鮮幼嫩葉片，并提取DNA。利用周艷萍（2020）篩選發(fā)表的百合SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系25.0 μL：2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL，DNA模板1.0 μL，10 μmol·L-1上游和下游引物各1.0 μL，補(bǔ)足ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃15 s，56～63 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。用2%瓊脂糖凝膠電泳篩選出條帶穩(wěn)定清晰、無雜帶且多態(tài)性較好的引物，加上熒光標(biāo)記后送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

1.2.5 雜交后代枯萎病抗性鑒定 選取直徑1.5 cm左右的組培小鱗莖移植到無菌基質(zhì)中培養(yǎng)7 d，將小鱗莖移入大小一致的裝有滅菌基質(zhì)的花盆中，用直徑1 cm的打孔器將尖孢鐮刀菌打成菌絲塊放入基質(zhì)中，每5小球?yàn)橐唤M，設(shè)置3次重復(fù)，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、18 d、21 d、24 d、27 d、30 d后分別對(duì)病情進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。百合尖孢鐮刀菌侵染百合鱗莖致病的鑒定方法、病級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)均參考羅建讓和謝松林（2015）的方法?？菸△[莖病級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：1級(jí)，無癥狀；2級(jí)，莖盤處稍有鐮刀菌侵染癥狀；3級(jí)，莖盤已有明顯腐爛，外部鱗片易脫落；4級(jí)，球莖盤嚴(yán)重腐爛，外部鱗片脫落；5級(jí)，球莖盤完全腐爛，鱗片觸手即散；6級(jí)，種球完全腐爛，無法找到。根據(jù)相對(duì)抗性指數(shù)進(jìn)行抗性劃分，抗性水平及對(duì)應(yīng)的相對(duì)抗性指數(shù)分別為高抗（病情指數(shù)＜0.25）、中抗（0.25≤病情指數(shù)＜0.5）、中感（0.5≤病情指數(shù)＜0.75）和高感（0.75≤病情指數(shù)＜1）。

病情指數(shù)的計(jì)算公式如下：

各基因型病情指數(shù)=∑（病級(jí)數(shù)×鱗莖個(gè)數(shù)）/（最高級(jí)×總鱗莖數(shù)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同百合種及品種枯萎病抗性鑒定

不同百合種及品種枯萎病的病情發(fā)展動(dòng)態(tài)及抗性鑒定結(jié)果如表1所示，由于觀察到第9天時(shí)，大部分百合都達(dá)到最高感病等級(jí)，因此以第7天時(shí)的相對(duì)抗性指數(shù)確定抗性水平。7 d時(shí)不同百合種及百合品種枯萎病病情如圖2所示。表1和圖2結(jié)果表明，龍牙百合、‘Tresor’、‘Secret kiss’、‘Pink planet’ 感抗類型為中感； ‘金百合’、 ‘Redcounty’、‘Peter’、‘Strawberry event’、‘Sorbonne’、新鐵炮百合、‘Yellow brush’、‘Brindisi’、‘Cali’、‘Magnefique’的感抗類型為中抗；‘Black stone’的感抗類型為高抗。多數(shù)感病品種（龍牙百合、‘Secret kiss’、‘Pink planet’）發(fā)病早，病情發(fā)展迅速，多數(shù)抗性品種（‘Black stone’、‘Sorbonne’等）發(fā)病晚，病情發(fā)展緩慢。

2.2 雜交組合的確定及子房膨大率分析

根據(jù)不同百合種及品種枯萎病抗性鑒定結(jié)果，‘Tresor’、‘Secret kiss’和‘Pink planet’感抗類型為中感，不參與雜交，其余12個(gè)觀賞百合栽培品種的感抗類型為中抗或高抗，與中感類型的龍牙百合進(jìn)行雜交，希望能獲得枯萎病抗性更強(qiáng)的后代。根據(jù)課題組前期花粉萌發(fā)率測(cè)定結(jié)果，‘Yellow brush’、‘Brindisi’、‘Cali’和‘Magnefique’的花粉萌發(fā)率基本為0，這4個(gè)百合品種僅作為母本參與雜交。因此，本研究以龍牙百合為母本，以‘金百合’、‘Red county’、‘Peter’、‘Black stone’、‘Strawberry event’、‘Sorbonne’和新鐵炮百合為父本進(jìn)行正交，共7個(gè)雜交組合；以‘金百合’、‘Red county’、‘Peter’、‘Black stone’、‘Strawberry event’、‘Sorbonne’、新鐵炮百合、‘Yellow brush’、‘Brindisi’、‘Cali’和‘Magnefique’為母本，以龍牙百合為父本進(jìn)行反交，共11個(gè)雜交組合。

授粉50 d后，以龍牙百合作母本時(shí)，所有雜交組合的子房均有膨大，但不同品種間的子房膨大率存在顯著差異，其中龍牙百合בStrawberry event’的子房膨大率最高，為26.09%；以‘金百合’、‘Black stone’（圖3：A）、‘Peter’3個(gè)亞洲百合品種作父本時(shí)，子房膨大率在11%～13%之間；以新鐵炮百合作父本時(shí)，子房膨大率最低，為3.23%（表2）。以龍牙百合作父本時(shí)，只有‘Red county’、‘Black stone’、‘Strawberry event’、新鐵炮百合、‘Brindisi’、‘Cali’和‘Magnefique’為母本的雜交組合的子房出現(xiàn)膨大，其中以‘Red county’、‘Strawberry event’、‘Brindisi’為母本的雜交組合的子房膨大率較高，均在40%以上，而以‘Black stone’作母本的子房膨大率最低，為2.50%（表3）。

因此，以龍牙百合做母本時(shí)，所有雜交組合都存在子房膨大現(xiàn)象，但子房膨大率普遍不高，較高的幾個(gè)組合均為以亞洲百合品種作父本的雜交組合；以龍牙百合做父本時(shí)，只有一部分雜交組合獲得了膨大蒴果，但子房膨大率明顯高于以龍牙百合做母本的。

2.3 不同雜交組合幼胚萌發(fā)率分析

以龍牙百合作母本時(shí)，通過子房切片（圖3：B）及胚珠離體培養(yǎng)（圖3：C），僅有龍牙百合בBlack stone’這一雜交組合中有幼胚萌發(fā)，萌發(fā)率為12.90%（圖3：D；表2）。以龍牙百合作父本時(shí)，僅有‘Strawberry event’×龍牙百合有胚珠萌發(fā)，萌發(fā)率為7.69%（表3）。胚珠經(jīng)過120 d無菌培養(yǎng)后，共獲得龍牙百合בBlack stone’（LYA-1、LYA-2、LYA-3）的3個(gè)雜種單株（圖3：E）和‘Strawberry event’×龍牙百合（ALY）的1個(gè)雜種單株。其他雜交組合所獲胚珠均未出現(xiàn)萌發(fā)現(xiàn)象。

2.4 雜種苗SSR分子標(biāo)記鑒定

使用SSR分子標(biāo)記對(duì)雜交后代的真實(shí)性進(jìn)行檢測(cè)，利用瓊脂糖凝膠電泳篩選，得到11對(duì)條帶清晰、具有多態(tài)性的SSR引物，并用這些引物進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)（表4）。圖4、圖5結(jié)果表明，LYA-1、LYA-2、LYA-3在引物SB091中同時(shí)擴(kuò)增出了母本和父本的特異性片段，LYA-1、LYA-3在引物MJ014中同時(shí)擴(kuò)增出了母本和父本的特異性片段；圖6結(jié)果表明，LYA-2、LYA-3在引物XT094中同時(shí)擴(kuò)增出了母本和父本的特異性片段；ALY在11對(duì)引物中均只擴(kuò)增出了母本的特異性片段。因此，LYA-1、LYA-2、LYA-3均為龍牙百合בBlack stone’的真實(shí)雜交后代，而ALY不是‘Strawberry event’× 龍牙百合的雜交后代。

2.5 雜交后代枯萎病抗性鑒定

以親本為對(duì)照，龍牙百合 × ‘Black stone’雜交后代枯萎病的病情發(fā)展動(dòng)態(tài)及抗性鑒定結(jié)果如表5所示，以30 d時(shí)的感病指數(shù)確定抗性水平。龍牙百合在接菌培養(yǎng)24 d后1個(gè)小鱗莖完全腐爛至無法找見，第30天時(shí)3個(gè)小鱗莖腐爛至完全找不見，而30 d時(shí)其他百合種類均未存在完全腐爛至無法找見的情況，第21天時(shí)雜交后代LYA1及親本小鱗莖生長(zhǎng)狀況如圖7所示。因此，龍牙百合感抗類型為高感，‘Black stone’、LYA-1、LYA-2、LYA-3感抗類型為中抗；龍牙百合發(fā)病早、病情發(fā)展迅速，而‘Black stone’、LYA-1、LYA-2、LYA-3病情發(fā)展較為緩慢。

3 討論

3.1 百合種質(zhì)資源枯萎病抗性評(píng)價(jià)

為選擇枯萎病抗性較強(qiáng)的親本，本研究采用離體葉片接菌法對(duì)收集到的百合種質(zhì)資源進(jìn)行枯萎病抗性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明亞洲百合雜種系、麝香百合雜種系、麝亞百合雜種系、麝東百合雜種系中大部分品種均具有一定的抗病性，存在高抗及中抗品種，這與楊秀梅等（2012）研究結(jié)果一致。楊秀梅等（2012）采用鱗片接種法對(duì)36個(gè)百合栽培品種及5個(gè)野生種進(jìn)行枯萎病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)百合野生種的抗病性較強(qiáng)，亞洲百合雜種系、麝香百合雜種系、麝亞百合雜種系的多數(shù)品種對(duì)鐮刀菌表現(xiàn)為較高的抗性，而東方百合雜種系中大部分品種則表現(xiàn)為較易感染鐮刀菌。本研究用離體葉片接菌法鑒定湖南隆回龍牙百合枯萎病抗性結(jié)果為中感，但在李潤(rùn)根和程華（2017）的研究中，采用離體葉片接種法進(jìn)行枯萎病抗性鑒定，其所選用的7個(gè)不同產(chǎn)地的龍牙百合種系枯萎病抗性鑒定結(jié)果均為高感，而在鱗片接種法中7個(gè)龍牙百合枯萎病抗性有所不同，其中‘廣西高片’、‘萬載柳片’的龍牙百合為中抗，說明不同產(chǎn)地的龍牙百合品系間的枯萎病抗性有所差異。

3.2 龍牙百合遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)研究

本研究中，以龍牙百合做母本時(shí)，盡管所有雜交組合都存在子房膨大現(xiàn)象， 但子房膨大率普遍橫向數(shù)字表示片段長(zhǎng)度， 縱向數(shù)字表示信號(hào)強(qiáng)度。下同。

不高，較高的幾個(gè)組合都是以亞洲百合品種作父本的雜交組合，以東方百合品種作父本時(shí)子房膨大率次之，而麝香百合品種最低。本研究結(jié)果表明，龍牙百合與亞洲百合系列的大部分品種親和性較高，較易獲得膨大蒴果實(shí)及雜種后代。以龍牙百合做父本時(shí)，雖然只有一部分雜交組合獲得膨大蒴果，但子房膨大率明顯高于以龍牙百合做母本的雜交組合。這說明以龍牙百合作父本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交時(shí)，較容易獲得膨大果實(shí)。盡管本研究獲得了較多以龍牙百合作父本的膨大蒴果，但未獲得雜種后代，推測(cè)可能受限于子房切片、胚珠離體培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)水平，或是沒有選擇到合適的時(shí)期，從而沒能克服受精后障礙獲得雜種苗。

近年來，部分學(xué)者對(duì)龍牙百合進(jìn)行了遠(yuǎn)緣雜交育種的研究，武利可（2020）將龍牙百合與蘭州百合進(jìn)行正交和反交，僅在以龍牙百合為母本、以蘭州百合為父本時(shí)，獲得膨大果實(shí)，并獲得166株雜種苗。Kim等（2022）將漢森百合與龍牙百合進(jìn)行正交和反交，僅有以龍牙百合為父本的雜交組合獲得了92株雜種苗。本研究將龍牙百合與觀賞百合栽培品種進(jìn)行正交和反交，僅獲得龍牙百合בBlack Stone’的3株雜種苗，與上述兩位學(xué)者的研究結(jié)果一致，僅獲得單向的雜交后代，這可能與龍牙百合跟其他百合品種進(jìn)行雜交時(shí)容易出現(xiàn)單向雜交不親和的現(xiàn)象有關(guān)。單向雜交不親和現(xiàn)象在其他百合種及品種的雜交中也較為常見，如尹燕等（2022）將蘭州百合與大花卷丹進(jìn)行正交和反交，僅獲得蘭州百合×大花卷丹的雜交后代。此外，Wu等（2021）、Kim和Kim（2017）、Kim等（2022）選用龍牙百合進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交均獲得較多的雜交后代，但本研究獲得的雜交后代較少，分析認(rèn)為，上述學(xué)者以龍牙百合為親本進(jìn)行雜交的雜交組合較少，但雜交的花朵數(shù)都在80朵以上，并選擇了切割柱頭、混合授粉等多種雜交方式克服遠(yuǎn)緣雜交障礙，從而獲得大量雜交后代。雖然本研究的雜交組合較多，但由于每一雜交組合的花朵數(shù)在30朵左右，并且僅采用重復(fù)授粉的方式克服遠(yuǎn)緣雜交障礙，因此通過雜交僅獲得3株龍牙百合雜交后代。綜上可知，擴(kuò)大雜交授粉的花朵數(shù)量和采用不同授粉方式是克服遠(yuǎn)緣雜交障礙、增加雜交成功率、獲得更多雜交后代的重要方法。

3.3 雜交后代真實(shí)性鑒定及枯萎病抗性評(píng)價(jià)

本研究利用瓊脂糖凝膠電泳篩選得到11對(duì)條帶清晰、具有多態(tài)性的SSR引物，并利用SSR分子標(biāo)記的方法，鑒定出3個(gè)龍牙百合בBlack stone’的真實(shí)雜交后代，1個(gè)‘Strawberry event’×龍牙百合的假雜種，為今后開展SSR分子標(biāo)記鑒定工作提供了參考。近年來，SSR分子標(biāo)記已成為百合雜交后代鑒定的一種普遍方法。例如，李卓憶（2019）通過SSR分子標(biāo)記確定了蘭州百合בPrunotto’的15個(gè)雜交后代的真實(shí)性；舒柯（2022）利用SSR分子標(biāo)記鑒定確定出卷丹百合בTresor’的2個(gè)雜種株系為真雜種。另外，本研究以龍牙百合作父本的雜交組合獲得了假雜種，考慮可能是因重復(fù)授粉的操作過程中未能包裹好柱頭而導(dǎo)致異源花粉污染或自交授粉，胡偉榮（2021）在雜交后代鑒定時(shí)也發(fā)現(xiàn)了蘭州百合בPink flavour’的假雜種，推測(cè)有可能是因授粉時(shí)花粉污染而導(dǎo)致。

本研究對(duì)所獲得的3個(gè)雜交后代及其親本進(jìn)行枯萎病抗性鑒定，‘Black stone’、LYA-1、LYA-2、LYA-3的枯萎病抗性為中抗，龍牙百合的枯萎病抗性為高感，本研究通過雜交成功獲得了具有一定枯萎病抗性的龍牙百合雜交后代，說明通過遠(yuǎn)緣雜交進(jìn)行抗性育種在龍牙百合上切實(shí)可行。本研究采用小鱗莖栽培基質(zhì)接種病原菌方法鑒定出‘Black stone’為中抗、龍牙百合為高感，與離體葉片法鑒定結(jié)果有所不同；李潤(rùn)根和程華（2017）通過離體葉片接菌法、鱗片接種法鑒定蘭州百合、‘吉安龍牙’等百合的枯萎病抗性時(shí)，也出現(xiàn)兩種方法鑒定結(jié)果不一致的情況；張麗麗等（2012）通過用鱗片接種和離體葉片接種方法進(jìn)行枯萎病抗性鑒定時(shí)，‘Bright’和‘Snow queen’在兩種不同方法下的鑒定結(jié)果也有差異。對(duì)于同種百合在不同方法進(jìn)行枯萎病鑒定時(shí)存在差異的現(xiàn)象，可能是由于枯萎病為土傳病害，采用百合的不同部位為實(shí)驗(yàn)材料，因此所展現(xiàn)的抗病能力有所不同。

4 結(jié)論

本研究將易感枯萎病的龍牙百合與抗枯萎病的觀賞百合進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，最終獲得了具有枯萎病抗性的龍牙百合雜交后代，為之后培育抗性強(qiáng)、觀賞性狀優(yōu)良的賞食兼用百合新品種提供了材料基礎(chǔ)。目前，本研究獲得的龍牙百合雜種苗仍處于幼齡生長(zhǎng)階段，未能將其與親本進(jìn)行觀賞性、食用價(jià)值等方面的比較，本課題組成員后期將對(duì)雜交后代觀賞性和食用價(jià)值等進(jìn)一步進(jìn)行評(píng)估，為培育抗性強(qiáng)、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的食用百合新品種提供材料基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛 王登惠）

基金項(xiàng)目： "湖南省科學(xué)技術(shù)廳種業(yè)創(chuàng)新項(xiàng)目（2021NK1005）； 湖南省自然科學(xué)基金（2023JJ30292）。

第一作者： 李澤（1998—），碩士研究生，主要從事百合遺傳育種研究，（E-mail）495833558@qq.com。

*通信作者： "李玉帆，講師，主要從事百合遺傳育種研究，（E-mail）liyufan@hunau.edu.cn。