達沙替尼可抑制丙酸睪酮誘導(dǎo)的小鼠前列腺增生

Dasatinib inhibits testosterone propionate-induced benign prostate hyperplasia in mice

GU Yue，WANG Yiwei，XU Bin

（Department of Urology，Shanghai Ninth People’s Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200011，China）

ABSTRACT：Objective To analyze the therapeutic effects of dasatinib on testosterone propionate （TP）-induced benign prostatic hyperplasia （BPH） in animal experiments.Methods Institute of Cancer Research （ICR） mice were randomly divided into normal control group （n=5），BPH group （n=5），finasteride group （n=8），vehicle group （n=8），dasatinib intermittent administration group （n=10） and dasatinib continuous administration group （n=10）.Except for the normal control group，BPH modelling was performed by subcutaneous injection of TP，and the groups were treated with saline，finasteride，polyethylene glycol 400 （PEG400） and dasatinib by gavage，respectively. The mice were sacrificed after a 14-day modelling period and a 28-day administration period. The prostate and spleen were dissected，and serum was sampled. Prostate weight was measured and prostate index （PI） was calculated. HE staining was conducted on the prostate and spleen，and Ki-67 immunohistochemical staining was performed on the prostate. Differences in the levels of serum dihydrotestosterone （DHT） and prostate-specific antigen （PSA） were detected with ELISA.Results The prostate weight and PI were significantly reduced in the dasatinib intermittent and continuous administration groups than in the BPH group （Plt;0.000 1），and the serum DHT level was also significantly reduced （Plt;0.01），but there were no significant differences in prostate weight，PI and serum DHT between dasatinib intermittent and continuous administration groups （Pgt;0.05），and no significant difference in PSA level among the three groups （Pgt;0.05）. After dasatinib treatment，the pathological manifestations of prostate glandular and interstitial hyperplasia were significantly improved；the positive rate of Ki-67 was lower in the dasatinib intermittent and continuous administration groups than in the BPH group （Plt;0.001）.Conclusion Dasatinib can inhibit TP-induced BPH，reduce serum DHT level，and inhibit the proliferation of prostate glandular and interstitial cells in mice. The therapeutic effects of intermittent administration of dasatinib are consistent with those of continuous administration.

KEY WORDS：benign prostate hyperplasia；dasatinib；finasteride；Ki-67；testosterone propionate

摘要：目的 通過動物實驗分析達沙替尼對丙酸睪酮（TP）誘導(dǎo)的小鼠良性前列腺增生（BPH）的抑制作用。方法 將美國癌癥研究所（ICR）小鼠隨機分為正常對照組（n=5）、BPH組（n=5）、非那雄胺組（n=8）、溶劑對照組（n=8）、達沙替尼間斷給藥組（n=10）和達沙替尼持續(xù)給藥組（n=10）。除正常對照組外，其余組采用皮下注射TP的方法進行BPH小鼠造模，各組分別給予生理鹽水、非那雄胺、聚乙二醇400（PEG400）和達沙替尼灌胃治療，在14 d的造模期和28 d的給藥期后處死，解剖小鼠前列腺、脾臟并取血清，比較各組小鼠前列腺質(zhì)量及前列腺指數(shù)（PI）的差異，對前列腺和脾臟進行HE染色，對前列腺做Ki-67免疫組化染色。使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測各組小鼠血清雙氫睪酮（DHT）和前列腺特異性抗原（PSA）水平。結(jié)果 達沙替尼持續(xù)給藥組和間斷給藥組的小鼠前列腺質(zhì)量及PI相較BPH組顯著減小（P＜0.000 1），血清DHT水平也顯著降低（P＜0.01），但達沙替尼間斷給藥組和持續(xù)給藥組間的小鼠前列腺質(zhì)量、PI及DHT水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）；各組間的PSA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。達沙替尼治療后小鼠前列腺腺體與間質(zhì)增生的病理表現(xiàn)有明顯改善，達沙替尼間斷給藥組和持續(xù)給藥組的Ki-67陽性率均顯著小于BPH組（P＜0.001），但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 達沙替尼可抑制TP誘導(dǎo)的小鼠BPH，降低血清DHT水平，抑制小鼠前列腺腺體與間質(zhì)細胞的增殖，且達沙替尼間斷給藥與持續(xù)給藥效果一致。

關(guān)鍵詞：良性前列腺增生；達沙替尼；非那雄胺；Ki-67；丙酸睪酮

中圖分類號：R697.32 文獻標(biāo)志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2024.12.016

良性前列腺增生（benign prostate hyperplasia，BPH）是一種以排尿障礙為主要癥狀的慢性疾病，多見于中老年男性，其發(fā)病率隨年齡增長而增加?！?0歲男性中50%～75%會出現(xiàn)BPH的臨床表現(xiàn)，且BPH引起的下尿路癥狀（lower urinary tract symptoms，LUTS）發(fā)生率與年齡呈正相關(guān)^[1-2]。中國BPH的患病率從1990年的763.65/10萬升高至2019年的1 430.25/10萬，BPH所致的健康壽命損失也逐年上升，隨著中國社會老齡化進程加快，BPH引起的疾病負擔(dān)可能會持續(xù)增長^[3]。盡管目前BPH的藥物治療已經(jīng)比較成熟，仍有約25%的患者在規(guī)范服藥后癥狀沒有明顯好轉(zhuǎn)甚至進一步惡化^[4]，最終超過20%的BPH患者需要手術(shù)干預(yù)^[5]。

達沙替尼是一種酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI），其靶點包括斷裂點簇集區(qū)-艾貝爾遜白血病病毒蛋白（breakpoint cluster region-abelson leukemia virus，BCR-ABL）、Src、c-KIT、血小板衍生生長因子受體α（platelet derived growth factor receptor α，PDGFR-α）、血小板衍生生長因子受體β（platelet derived growth factor receptor β，PDGFR-β）等^[6]，常用于治療慢性髓性白血病，亦可與槲皮素聯(lián)用作為抗衰老療法的一部分。有研究報道了TKIs對前列腺體積有縮小作用^[7-8]，但尚未見達沙替尼對BPH作用的研究。本研究旨在通過動物實驗評估達沙替尼對丙酸睪酮（testosterone propionate，TP）誘導(dǎo)的小鼠BPH的抑制作用，以期為BPH的治療提供新的參考方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 46只6～8周齡的美國癌癥研究所（Institute of Cancer Researcch，ICR）小鼠，體質(zhì)量22～26 g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司[動物許可證號：SCXK（蘇）2021-0013]。所有小鼠均飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動物房[許可證號：SYXK（滬）2020-0025]，采用標(biāo)準(zhǔn)飼料（美迪森，貨號MD12062），分籠飼養(yǎng)，室溫維持在20～25 ℃，濕度40%～60%，12 h光/暗環(huán)境循環(huán)，小鼠自由飲食。本研究通過了本院實驗動物倫理委員會審批（SH9H-2024-A014-SB）。

1.1.2 藥物及試劑 TP，德國Dr.Ehrenstorfer（貨號DRE-C17322540）；非那雄胺，安耐吉化學(xué)（貨號98319-26-7）；聚乙二醇400（polyethylene glycol 400，PEG400），上海阿拉丁深化科技股份有限公司（貨號25322-68-3）；小鼠激肽釋放酶1相關(guān)肽酶b3（mouse kallikrein 1-related peptidase b3，KLK3）酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒，武漢華美生物（貨號CSB-E08276m）；小鼠雙氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）ELISA試劑盒，武漢華美生物（貨號CSB-E07880m）；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色液，賽維爾生物（貨號G1005）；Ki-67抗體，賽維爾生物（貨號GB111141）；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG，塞維爾生物（貨號GB23303）；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑，賽維爾生物（貨號G1212）；達沙替尼，正大天晴連云港潤眾制藥有限公司（批號06623009）。

1.1.3 儀器 脫水機購自武漢俊杰電子有限公司（型號JJ-12J），包埋機購自武漢俊杰電子有限公司（型號JB-P5），病理切片機購自上海徠卡儀器有限公司（型號RM2016），組織攤片機購自浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司（型號KD-P），顯微鏡購自尼康儀器有限公司（型號E100），多功能酶標(biāo)儀購自深圳匯松公司（型號MB-530）。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗分組與給藥 46只ICR小鼠經(jīng)過14 d的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，按隨機數(shù)字表法分為正常對照組（n=5）、BPH組（n=5）、非那雄胺組（n=8）、溶劑對照組（n=8）、達沙替尼間斷給藥組（n=10）和達沙替尼持續(xù)給藥組（n=10）。整個實驗包括14 d的造模期與28 d的給藥期。參考已有方法^[9-10]，將TP溶于橄欖油后，除正常對照組外的其余組小鼠每日皮下注射TP 7.5 mg/kg，正常對照組小鼠皮下注射等體積的橄欖油，持續(xù)14 d。

造模期結(jié)束后，對正常對照組的5只小鼠繼續(xù)皮下注射等體積的橄欖油，并灌胃生理鹽水，持續(xù)28 d。其余5組則在繼續(xù)每日皮下注射TP 7.5 mg/kg，持續(xù)28 d的基礎(chǔ)上，如下給藥：①BPH組：每日灌胃等體積生理鹽水；②非那雄胺組：每日灌胃非那雄胺1 mg/kg；③溶劑對照組：每日灌胃等體積10% （體積分數(shù)） PEG400；④達沙替尼間斷給藥組：在每14 d的前3 d每日灌胃達沙替尼5 mg/kg（溶于10% PEG400），其余時間每日灌胃等體積10% PEG400；⑤達沙替尼持續(xù)給藥組：每日灌胃達沙替尼5 mg/kg（溶于10% PEG400）。

在給藥結(jié)束后24 h，對每只小鼠稱重，行頜下靜脈采血并分離血清后行安樂死，取前列腺和脾臟組織，并對前列腺組織進行稱重，計算小鼠的前列腺指數(shù)（prostate index，PI）：PI=小鼠前列腺質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量。

1.2.2 HE染色 將動物實驗獲取的組織石蠟包埋、切片后，依次行脫蠟至水、蘇木素染色、伊紅染色、脫水封片獲得HE染色組織切片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 免疫組化染色 將切片后的石蠟組織脫蠟至水，依次行抗原修復(fù)、過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、加一抗、二抗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染細胞核、脫水封片。在白光顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果并拍照。隨機選取3個視野，計算每個視野內(nèi)Ki-67陽性細胞率并取平均值。其中一抗（抗-Ki67兔pAb）的稀釋比為1∶500，二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG）稀釋比為1∶200。

1.2.4 ELISA 根據(jù)廠家提供的使用說明書操作，將小鼠血清離心后，在酶標(biāo)板上分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品50 μL，加入孵育液50 μL，酶結(jié)合物50 μL充分混勻后37 ℃孵育1 h，洗板，加底物溶液100 μL顯色20 min后加終止液50 μL，用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的吸光度（A值），并根據(jù)計算機擬合的濃度-吸光度曲線反推出樣本中DHT或前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）的濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 25.0軟件及GraphPad Prism 9.5軟件進行統(tǒng)計分析與作圖，所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，使用Bartlett檢驗分析方差齊性。其中各組小鼠血清PSA水平和前列腺Ki-67陽性率方差不齊，組間比較使用Welch方差分析，組間多重比較使用Dunnett T3法檢驗。其余各組數(shù)據(jù)均滿足方差齊性，組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較使用改進Tukey法檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 達沙替尼對BPH小鼠體質(zhì)量、前列腺質(zhì)量及PI的影響 各組小鼠的體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖1A）；BPH組小鼠的前列腺質(zhì)量、PI均顯著高于正常對照組（P＜0.001）；BPH組與溶劑對照組間小鼠前列腺質(zhì)量、PI差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；非那雄胺組、達沙替尼間斷給藥組和持續(xù)給藥組的小鼠前列腺質(zhì)量、PI均顯著小于BPH組（Plt;0.05），但達沙替尼間斷給藥組和持續(xù)給藥組間各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖1B、C）。

2.2 達沙替尼對BPH小鼠DHT、PSA的影響 BPH組小鼠的血清DHT水平顯著高于正常對照組（Plt;0.000 1），BPH組與溶劑對照組間血清DHT水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；經(jīng)過非那雄胺或達沙替尼治療后，非那雄胺組、達沙替尼間斷給藥組和持續(xù)給藥組的血清DHT水平均低于BPH組（Plt;0.05），但達沙替尼間斷給藥組和持續(xù)給藥組間血清DHT水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖2A）。各組間血清PSA水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖2B）。

2.3 達沙替尼作用于小鼠前列腺與脾臟的組織學(xué)觀察

2.3.1 各組小鼠前列腺組織學(xué)觀察 相較于正常對照組整齊且厚度均一的單層柱狀上皮排布，BPH組前列腺腺體擴張迂曲，管腔上皮細胞可見假復(fù)層排布，腺體上皮層厚度變厚，部分腺體可見腔內(nèi)乳頭樣增生和梅花狀腺腔，可見較多基底細胞，基底膜部分增厚，形狀不規(guī)則，薄厚不均，腺體周圍的間質(zhì)組織及平滑肌增生。

溶劑對照組的前列腺組織表現(xiàn)與BPH組相似，而非那雄胺組、達沙替尼間斷給藥組、達沙替尼持續(xù)給藥組的前列腺組織鏡下觀相較BPH組有不同程度的改善，表現(xiàn)為上皮恢復(fù)正常的單層柱狀結(jié)構(gòu)，基底膜薄厚較均勻，腺體形狀變規(guī)則，梅花狀腺腔、樹枝樣腺腔少見，間質(zhì)增生不明顯（圖3）。

2.3.2 各組小鼠脾臟組織學(xué)觀察 各組的脾臟組織病理學(xué)觀察無明顯差異，各組小鼠脾臟的紅髓/白髓比例無顯著差異，脾小體未見明顯增大，血竇、淋巴濾泡無明顯差異，造血性幼紅細胞島未見增殖或減少（圖4）。

2.4 達沙替尼對小鼠前列腺Ki-67表達的影響 Ki-67定位于細胞核內(nèi)，在正常對照組中少量表達于管腔上皮細胞，在BPH組中Ki-67的染色較深，除管腔上皮陽性著色增多，亦有少許間質(zhì)細胞、基底細胞的著色，溶劑對照組的結(jié)果與BPH組相似。而在非那雄胺組、達沙替尼的兩個治療組中，可見管腔上皮細胞陽性著色相較BPH組減少，且間質(zhì)細胞、基底細胞中罕見陽性著色。在量化分析中，達沙替尼間斷給藥組和持續(xù)給藥組的Ki-67陽性率均顯著小于BPH組（P＜0.001），但兩組間的Ki-67陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖5）。

3 討 論

BPH的發(fā)病機制尚不明確，一般認為性激素水平與其發(fā)病密切相關(guān)^[11]。前列腺管腔上皮細胞和間質(zhì)細胞內(nèi)的5-α還原酶將睪酮轉(zhuǎn)換為活性程度更高的DHT，DHT與雄激素受體（androgen receptor，AR）結(jié)合后促進PSA及各種生長因子，如表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、角質(zhì)細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和胰島素樣生長因子（insulin-like growth factors，IGFs）的生成^[12-13]，從而促進細胞增殖。其他假說如慢性炎癥及免疫細胞浸潤、增殖/凋亡失衡、代謝、基質(zhì)-上皮互相作用等也與BPH的發(fā)生相關(guān)^[14]。一些研究已報道了舒尼替尼、索拉非尼、雷帕霉素等靶向藥物對前列腺體積的縮小作用^[7-8，15]，本研究通過動物實驗發(fā)現(xiàn)了達沙替尼可能具有治療BPH的潛力。

達沙替尼除了作為白血病的一線治療藥物，還可與槲皮素聯(lián)用（D+Q）抗衰老。D+Q間斷給藥（僅在每1或2周的前3 d服用）的senolytics療法已有多項臨床試驗正在進行，其中一項完結(jié)的臨床試驗（NCT02874989）發(fā)現(xiàn)，14例肺纖維化的患者在D+Q治療后6 min步行距離等體能指標(biāo)有明顯改善^[16]；另一項臨床試驗（NCT02848131）的中期報告報道了一次性連續(xù)3 d的D+Q治療即可顯著降低皮下脂肪組織和表皮基底層中的衰老細胞比例，且一次給藥的有效時間至少可持續(xù)2周^[17]。

本研究使用TP建立小鼠BPH模型，并使用了兩種不同的達沙替尼治療方式分組，其中持續(xù)給藥組用法用量參照白血病的治療方式，而間斷給藥組參考了抗衰老D+Q療法^[18]。本文結(jié)果顯示，達沙替尼治療后，BPH小鼠的前列腺質(zhì)量、PI顯著減小，但持續(xù)給藥組與間斷給藥組間各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；達沙替尼可降低小鼠血清DHT的水平，但對PSA水平無影響；組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)達沙替尼可改善BPH的病理表現(xiàn)，抑制腺體及間質(zhì)的增生。Ki-67是位于細胞核內(nèi)的細胞增殖標(biāo)志物，廣泛應(yīng)用于細胞增殖水平的檢測。本文的Ki-67免疫組化染色結(jié)果表明，達沙替尼對前列腺上皮和間質(zhì)細胞的增殖有抑制作用。造血抑制是達沙替尼的常見不良反應(yīng)之一，小鼠的脾臟在免疫功能之外，終生維持造血功能，小鼠脾臟的異常病變在本研究中并未觀察到。綜合上述結(jié)果，推測達沙替尼可抑制前列腺上皮和間質(zhì)細胞的增殖，并降低血清DHT水平，最終達到抑制TP誘導(dǎo)的小鼠BPH的治療效果。且達沙替尼的間斷給藥和持續(xù)給藥在治療效果、造血及免疫系統(tǒng)不良反應(yīng)方面均無顯著差異。

本研究創(chuàng)新性的發(fā)現(xiàn)了達沙替尼對于BPH的治療潛力，且達沙替尼的間斷給藥在減少用藥負擔(dān)、降低不良反應(yīng)發(fā)生率的同時對BPH的治療效果也與持續(xù)給藥一致，為BPH的藥物治療提供了新的思路，亦增加了達沙替尼在腫瘤治療之外的可能性，為達沙替尼治療BPH的后續(xù)研究提供了依據(jù)。但本研究也存在一些不足，如缺乏對達沙替尼抑制前列腺上皮和間質(zhì)細胞增殖的機制研究。此外達沙替尼通常與槲皮素聯(lián)用作為抗衰老治療，BPH也是一種老年疾病，D+Q聯(lián)合用藥是否可以得到更好的治療效果也值得探討。后續(xù)可能還需要進行回顧性研究或小范圍的前瞻性研究以驗證達沙替尼對人類前列腺組織的作用效果。另外達沙替尼作為一種多靶點的TKI，需要更進一步的體外實驗探究其作用于BPH的治療靶點。

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（編輯 閆玉梅）