兩樣本孟德爾隨機(jī)化分析4種常量營養(yǎng)素相對攝入量與腎結(jié)石的因果關(guān)系

Two sample Mendelian randomization analysis of the causal relationship between relative intake of four constant nutrients and kidney stones

WANG Cong^1，2，XI Yujia^1，2，WANG Zhenxing²，JIA Yijun^1，2，HAO Chuan²

（1.The Second Clinical Medical College，2.Department of Urology，The Second Hospital，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China）

ABSTRACT：Objective To investigate the causal relationship between the relative intake of dietary components （including carbohydrate，added sugar，protein，and fat） and kidney stones using two sample Mendelian randomization （MR）.Methods The genetic instrumental variables （IVs） from genome-wide association study （GWAS） statistics，exposure-related summary data from the SSGAC genome study，and kidney stone data from the Finn Gen Consortium were collected，which were then analyzed with inverse variance weighting （IVW）.The MR results and sensitivity were assessed with MR-Egger，weighted median，MR-PRESSO test，Cochran’s Q test，leave-one analysis，and Steiger filter.Results IVW results showed that the relative intake of carbohydrate （OR=2.01，95%CI：1.02-3.96，P=0.042） and added sugar （OR=2.07，95%CI：1.00-4.29，P=0.049） had a causal relationship and were risk factors for the development of kidney stones.Relative intake of protein （OR=0.70，95%CI：0.38-1.29，P=0.249） and fat （OR=0.79，95%CI：0.27-2.35，P=0.671） were not associated with kidney stones.Sensitivity analysis showed no heterogeneity or pleiotropy （Pgt;0.05）.Conclusion Relative intake of carbohydrate and added sugar are risk factors for kidney stones，suggesting that limiting carbohydrate and added sugar intake may prevent the development of kidney stones.

KEY WORDS：Mendelian randomization; kidney stones; diet; carbohydrate; added sugar

摘要：目的 通過兩樣本孟德爾隨機(jī)化（MR）探討飲食成分相對攝入量（即碳水化合物、添加糖、蛋白質(zhì)和脂肪）與腎結(jié)石（KSD）之間的因果關(guān)系，為KSD的預(yù)防提供參考。方法 檢索整理全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）統(tǒng)計數(shù)據(jù)，暴露組數(shù)據(jù)來自社會科學(xué)遺傳協(xié)會聯(lián)合會的基因組研究，KSD數(shù)據(jù)選自Finn Gen生物樣本庫。使用逆方差加權(quán)法（IVW）作為兩樣本MR分析的主要方法，采用MR-Egger、加權(quán)中位數(shù)法、MR-多效性殘差和離群值（MR-PRESSO）檢驗(yàn)、Cochran’s Q檢驗(yàn)、“留一法”分析和Steiger濾波作為MR結(jié)果和敏感性分析的補(bǔ)充。結(jié)果 IVW結(jié)果顯示碳水化合物相對攝入量（OR=2.01，95%CI：1.02～3.96，P=0.042）、添加糖相對攝入量（OR=2.07，95%CI：1.00～4.29，P=0.049）與KSD之間存在因果關(guān)系，是其發(fā)生發(fā)展的危險因素。未發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)相對攝入量（OR=0.70，95%CI：0.38～1.29，P=0.249）和脂肪相對攝入量（OR=0.79，95%CI：0.27～2.35，P=0.671）與KSD存在關(guān)聯(lián)。敏感性分析顯示上述結(jié)果無異質(zhì)性和多效性（P＞0.05）。結(jié)論 碳水化合物相對攝入量與添加糖相對攝入量可能是KSD的危險因素，提示控制碳水化合物與添加糖的攝入可預(yù)防KSD的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：孟德爾隨機(jī)化；腎結(jié)石；飲食；碳水化合物；添加糖

中圖分類號：R692.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2024.12.011

收稿日期：2024-03-07 修回日期：2024-06-02

基金項目：山西省醫(yī)師協(xié)會 （No.YSXH-QL2023MN002）

通信作者：郝川，碩士研究生導(dǎo)師，主任醫(yī)師。

E-mail：haochuan2003@sina.com

作者簡介：王聰，碩士研究生在讀。研究方向：泌尿系結(jié)石。

E-mail：wc18834563080@163.com

腎結(jié)石（kidney stone，KSD）是泌尿系統(tǒng)最常見的疾病之一，其臨床表現(xiàn)包括腰部或上腹部陣發(fā)性劇烈絞痛、血尿、腎積水等。這些臨床表現(xiàn)不但給患者帶來了巨大的身體和精神負(fù)擔(dān)^[1]，而且頗高的復(fù)發(fā)率也增加了治療的經(jīng)濟(jì)衛(wèi)生成本^[2]。因此，針對KSD的誘發(fā)因素制定詳細(xì)的預(yù)防及治療策略是一個全球性的醫(yī)療保健問題。有研究表明通過調(diào)控飲食和生活方式，KSD發(fā)病率可降低50%以上^[3]。先后有隨機(jī)對照研究及觀察性研究報道，4種常量營養(yǎng)素（即碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、添加糖）相對攝入量的改變會增加或降低KSD發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險。然而上述研究采用傳統(tǒng)研究方法受混雜因素和反向因果關(guān)系的影響，結(jié)論在很大程度上存在偏倚性。

為了得到更明確的結(jié)果，本研究利用兩樣本孟德爾隨機(jī)化（mendelian randomization，MR）方法來推斷上述4種飲食的攝入量與KSD發(fā)生的潛在因果關(guān)系。與傳統(tǒng)對照試驗(yàn)相比，此方法利用了樣本量龐大的數(shù)據(jù)庫，避免了長期隨訪這一耗時且高成本的環(huán)節(jié)。此外，MR選用了單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)（single nucleotide polymorphism，SNP）作為工具變量（instrumental variables，IVs），而基因在受孕時具有隨機(jī)分配性，基因變異先于疾病的發(fā)展，且不受外界環(huán)境、社會行為等因素的影響，因此在推斷因果關(guān)聯(lián)時具有合理的時序性，很大程度上減少了傳統(tǒng)觀察性研究中存在的混雜因素和反向因果關(guān)系影響^[4]，并且本研究使用的暴露與結(jié)局樣本無重疊，保證了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，為KSD的飲食預(yù)防提供更精確的證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究設(shè)計 采用兩樣本MR模型評價飲食成分相對攝入量（即碳水化合物、添加糖、脂肪、蛋白質(zhì)）與腎結(jié)石之間的潛在因果關(guān)系。IVs滿足以下3個假設(shè)^[5]：①相關(guān)性假設(shè)：IVs與暴露（即4種營養(yǎng)素相對攝入量）間密切相關(guān)，P＜5×10^-8為強(qiáng)相關(guān)；②排他性假設(shè)：確保IVs與結(jié)局（腎結(jié)石）無直接聯(lián)系，在結(jié)局變量的全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）數(shù)據(jù)中查找并篩選出IVs，同時剔除與結(jié)局因素高度相關(guān)的IVs，以確保IVs不直接與結(jié)局產(chǎn)生關(guān)聯(lián)；③獨(dú)立性假設(shè)：IVs與暴露和結(jié)局之間潛在的混雜因素?zé)o關(guān)。本研究的流程圖見圖1。

1.2 數(shù)據(jù)來源 關(guān)于KSD的IVs，本研究選擇了Finn Gen（https：//www.finngen.fi/en）生物樣本庫中的GWAS數(shù)據(jù)。在調(diào)整年齡、性別、遺傳相關(guān)性、基因分型批次和前10個主要成分后，收集到關(guān)于KSD的相關(guān)數(shù)據(jù)包括376 406名芬蘭成人受試者，其中病例有9713例，對照組有366 693例^[6]。

暴露組的數(shù)據(jù)來源于社會科學(xué)遺傳協(xié)會聯(lián)合會（Social Science Genetic Associations Consortium，SSGAC）由MEDDENS等^[7]科研團(tuán)隊整理的GWAS研究數(shù)據(jù)，包括碳水化合物相對攝入量、蛋白質(zhì)相對攝入量、脂肪相對攝入量、添加糖相對攝入量，該研究對超過 235 000 名具有歐洲血統(tǒng)的人進(jìn)行問卷案調(diào)查，調(diào)查所得的24 h飲食回憶問卷的信息被用于英國生物庫（UK Biobank，UKB）隊列中進(jìn)行分析，食物頻率問卷的結(jié)果用于復(fù)制隊列?！俺Ａ繝I養(yǎng)素密度”是通過將常量營養(yǎng)素攝入量除以總攝入量而獲得的。由于常量營養(yǎng)素的攝入量與總攝入量呈非線性關(guān)系，作者使用修正因子β進(jìn)行修正，即

相對攝入量=常量營養(yǎng)素的攝入量/總攝入量×β

最終采用上式來衡量脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物和添加糖的相對攝入量。

MR研究要求SNP暴露和SNP結(jié)局關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)具有獨(dú)立性^[8]，本研究暴露與結(jié)局IVs來源于不同的生物樣本庫，樣本之間基本不存在重疊，并且受試者的倫理批準(zhǔn)和書面知情同意情況在原始出版物中均有說明。

1.3 篩選IVs IVs篩選標(biāo)準(zhǔn)：IVs與暴露間強(qiáng)相關(guān)P＜5×10^-8。為減少偏倚結(jié)果的發(fā)生，以r²＜0.001、窗口大小為10 000 kb的等位基因?yàn)榧s束條件，消除具有強(qiáng)連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）的SNPs^[9]。使用F統(tǒng)計量來確定是否存在弱 IVs偏倚^[10]。Steiger濾波用于解釋暴露和結(jié)局的方差比，明確單個SNP的方向性^[11]。通過Phenosanner數(shù)據(jù)庫（http：//www.phenoscanner.medschl.cam.ac.uk/）篩查相關(guān)混雜因素^[12]，排除有混雜關(guān)系的SNPs。

1.4 因果效應(yīng)分析 逆方差加權(quán)（inverse variance weighting，IVW）法作為主要分析方法來評估4種飲食成分相對攝入量與KSD之間的關(guān)系，其結(jié)果在IVs不存在水平多效性的情況下無偏倚^[13]。其中水平多效性通過MR-Egger法進(jìn)行檢驗(yàn)，此方法在計算分析中考慮了截距項的存在，當(dāng)截距項恰好為零時，MR-Egger法的結(jié)果等同于IVW法，本研究用MR-Egger法作為補(bǔ)充方法以評估IVW法結(jié)果的穩(wěn)健性。由于加權(quán)中位數(shù)法（weighted median method，WMM）在高達(dá)50%對結(jié)局不產(chǎn)生影響的IVs中，仍可以得出更接近真實(shí)值的估計結(jié)果，故本研究也用其作為IVW法的一個有效補(bǔ)充方法^[11]。

1.5 質(zhì)量控制 使用R軟件（版本4.2.0）進(jìn)行分析，R包為“Two-sample MR”和“MR-PRESSO”。MR多效性殘差和離群值（MR-pleiotropy residual sum and outlier，MR-PRESSO）方法可以用來檢測異常值，并校正水平多效性^[14]。采用Cochran’s Q檢驗(yàn)對異質(zhì)性進(jìn)行量化，P＜0.05表明分析結(jié)果存在顯著的異質(zhì)性^[15]，通過散點(diǎn)圖將暴露與結(jié)局SNP的聯(lián)系可視化。MR-Egger回歸用于分析評價無效IVs和水平多效性效應(yīng)引起的偏倚，如果截距項的Pgt;0.05，則表明所選IVs不存在水平多效性^[16]。通過Steiger tests判斷暴露與結(jié)局因果關(guān)系的方向^[11]。此外，應(yīng)用“留一法”檢驗(yàn)結(jié)果是否穩(wěn)健，通過逐個剔除SNPs后計算剩余SNPs的合并效應(yīng)，以評估單個SNP對暴露和結(jié)局變量之間關(guān)聯(lián)的影響^[17]。

2 結(jié) 果

2.1 IVs的提取 通過嚴(yán)格把控篩選標(biāo)準(zhǔn)，并且排除混雜因素相關(guān)的SNPs，最終篩選出18個SNP。具體信息見表1，P值均遠(yuǎn)小于5×10^-8，說明這些SNPs與暴露因素高度相關(guān)。r²均小于0.001，說明SNPs之間不具有LD。F值均大于10，說明納入的SNP均不是弱IVs。

2.2 4種常量營養(yǎng)素相對攝入量與KDS因果關(guān)系的MR分析結(jié)果 使用IVW、WMM、MR-Egger、MR-PRESSO法逐一分析4種常量營養(yǎng)素相對攝入量與KSD的因果關(guān)系，結(jié)果見圖2。IVW法分析顯示碳水化合物相對攝入量（OR=2.01，95%CI=1.02～3.96，P=0.042），添加糖相對攝入量（OR=2.07，95%CI=1.00～4.29，P=0.049）是KSD的危險因素。蛋白質(zhì)相對攝入量（OR=0.70，95%CI=0.38～1.29，P=0.249），脂肪相對攝入量（OR=0.79，95%CI=0.27～2.35，P=0.671）與KSD無顯著因果關(guān)系。

2.3 結(jié)果可視化 運(yùn)用TwoSample包可視化得出相關(guān)SNPs對KSD因果影響的散點(diǎn)圖（圖3），圖上的每一個點(diǎn)代表一個SNP，每個點(diǎn)上的線實(shí)際反映的是95%CI，彩色的線表示MR的擬合結(jié)果。

從圖3C、D可以得出，IVW彩色線隨著暴露的升高，結(jié)局的發(fā)病風(fēng)險也在升高。MR可視化森林圖（圖2）中的每一條水平實(shí)線反映的是對應(yīng)的暴露對象用不同方法估計出來的結(jié)果：從圖中可以得出添加糖、碳水化合物實(shí)線完全在紅色虛線的右邊，說明由這兩種暴露對象增加能升高結(jié)局的發(fā)病風(fēng)險。綜上兩種可視化圖可以得出，添加糖、碳水化合物相對攝入量的增加會提高KSD的發(fā)病風(fēng)險。

2.4 異質(zhì)性分析 上述有意義的兩個分析結(jié)果經(jīng)MR-PRESSO Global 檢驗(yàn)P均 gt; 0.05（碳水化合物P=0.746、添加糖P=0.645），表明IVs不存在水平多效性，未發(fā)現(xiàn)離群值。Cochran’s Q檢驗(yàn)（碳水化合物IVW：P=0.519，MR-Egger：P=0.501；添加糖IVW：P=0.549，MR-Egger：P=0.356）表明結(jié)果無異質(zhì)性。MR-Egger截距試驗(yàn)結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義（碳水化合物：截距=0.038，P=0.404；添加糖：截距=－0.010，P=0.850），表明沒有觀察到多效性。Steiger檢驗(yàn)方向分析示暴露工具與結(jié)局保持正確的因果關(guān)系方向（表2）。漏斗圖由于分析所篩選的SNP數(shù)量較少，無法有效觀察是否基本對稱。

2.5 敏感性分析 對分析結(jié)果有意義的IVs的敏感性進(jìn)行“留一法”分析如圖4所示，每個黑點(diǎn)代表1個SNP，均位于0的右側(cè)，表示無論去除哪個SNP都不會對結(jié)果產(chǎn)生根本影響，表明結(jié)果是穩(wěn)健的。

3 討 論

KSD患病率逐年上升，飲食習(xí)慣在疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著一定的作用，通過控制飲食可以有效減少結(jié)石的產(chǎn)生率及復(fù)發(fā)率^[18]。在本項MR分析中，IVs從大規(guī)模、非重疊的GWAS的匯總統(tǒng)計中提取。通過使用遺傳基因替代碳水化合物、添加糖、脂肪和蛋白質(zhì)相對攝入量作為暴露工具，結(jié)局為KSD，應(yīng)用兩樣本MR分析分別評估上述4種飲食相對攝入量與KSD風(fēng)險的潛在因果關(guān)系。本研究結(jié)果表明，碳水化合物及添加糖的相對攝入量與KSD風(fēng)險呈正相關(guān)，且通過對有意義的結(jié)果進(jìn)行異質(zhì)性、多效性的評估，結(jié)果不存在明顯偏差。

先前有隨機(jī)對照研究報道，KSD患者和對照組的碳水化合物攝入量相似^[19-20]。另一項健康人群與特發(fā)性鈣結(jié)石的對照試驗(yàn)表明結(jié)石組碳水化合物攝入量更高^[21]。BARGHOUTHY等^[22]在一篇關(guān)于營養(yǎng)與KSD的綜述中總結(jié)了碳水化合物攝入量的改變可通過多種途徑影響KSD的發(fā)生風(fēng)險。TRINCHIERI等^[23]的一項回顧性研究發(fā)現(xiàn)單純尿酸KSD患者以及混合尿酸/草酸鈣KSD患者的碳水化合物攝入量顯著高于健康對照組。一項前瞻性研究報道年輕女性蔗糖攝入量與結(jié)石形成的風(fēng)險呈正相關(guān)^[24]。另一項關(guān)于年輕女性的大型流行病學(xué)研究也提到，高蔗糖飲食攝入量會提高KSD的發(fā)病率及復(fù)發(fā)率^[25]，然而在男性的觀察性研究中未發(fā)現(xiàn)兩者存在關(guān)聯(lián)^[13，24]。NGUYEN等^[26]研究發(fā)現(xiàn)簡單碳水化合物食用負(fù)荷增加會導(dǎo)致尿液中鈣鹽、草酸鹽的增加，精制碳水化合物攝入量的增加同樣會提高尿液中鈣排泄量水平^[23]，這是草酸鈣結(jié)石復(fù)發(fā)的主要尿液決定因素^[27]。LEMANN等^[28]的隨機(jī)對照研究發(fā)現(xiàn)，健康對照組與草酸鈣結(jié)石患者在口服100 g葡萄糖或蔗糖后，尿鈣排泄率有不同程度的升高。蔗糖攝入增加會提高人體內(nèi)胰島素水平，轉(zhuǎn)而抑制腎臟對鈣的重吸收，可能是內(nèi)在的機(jī)制之一^[29]。

飲食中的添加糖主要成分為果糖，果糖攝入量增加顯著提高了結(jié)石形成的風(fēng)險^[30]，這與本研究結(jié)果一致。果糖可以通過影響尿酸代謝從而增加結(jié)石形成的風(fēng)險^[31]，這可能是因?yàn)楣谴x顯著抑制了三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的再生，使尿酸產(chǎn)生的前體成分—磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）含量升高，從而進(jìn)一步促進(jìn)了嘌呤合成和尿酸水平的提高^[32]。NGUYEN等^[26]在研究中也提到，果糖的攝入增加同樣會提高尿液中草酸鹽及尿鈣水平。此外，提高果糖攝入量會增加血管升壓素的釋放^[33-34]，血清和尿液滲透壓升高，排尿量隨之減少，同樣增加了KSD的發(fā)生風(fēng)險。綜上所述，高碳水化合物攝入以及膳食中過多的添加糖會提高KSD的發(fā)生風(fēng)險。

蛋白質(zhì)、脂肪同樣在飲食結(jié)構(gòu)中占據(jù)不小的比例，但在本研究中未發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)相對攝入量、脂肪相對攝入量與KSD存在關(guān)聯(lián)。一項大型流行病學(xué)研究報道，高蛋白攝入會增加男性KSD發(fā)病風(fēng)險或復(fù)發(fā)風(fēng)險^[35]。然而，PEDERSEN等^[36]的綜述認(rèn)為蛋白質(zhì)攝入與腎結(jié)石風(fēng)險之間的關(guān)系尚無定論。ASOUDEH等^[37]通過一項薈萃分析得出總蛋白質(zhì)攝入量包括動物蛋白與KSD的發(fā)生風(fēng)險之間不存在顯著關(guān)聯(lián)。TAYLOR等^[38]卻認(rèn)為動物蛋白攝入量僅在BMI＜25的男性人群中與KSD形成存在因果關(guān)系，其相關(guān)原因可能是尿液鈣平衡失調(diào)、尿液酸堿度降低以及尿液排出的其他成分變化^[39]。很少有報道提到乳制品蛋白及植物蛋白攝入增加會增加KSD的風(fēng)險^[40]?？紤]到本研究未將蛋白質(zhì)攝入的來源詳細(xì)分類，可能是導(dǎo)致結(jié)果陰性的一個原因。關(guān)于脂肪攝入量和尿路結(jié)石形成風(fēng)險之間因果聯(lián)系的研究較少，而且結(jié)論不一致。兩項隨機(jī)對照研究顯示結(jié)石患者和對照組脂肪攝入量無明顯區(qū)別^[19-20]。NAYA等^[41]通過分析58例特發(fā)性草酸鈣結(jié)石患者的24 h尿樣和膳食記錄，結(jié)果表明膳食中脂肪酸的含量與尿草酸排泄量顯著相關(guān)，可能會增加草酸鹽結(jié)石的發(fā)生率。

本研究的優(yōu)點(diǎn)在于基于大樣本人群，首次系統(tǒng)地從遺傳學(xué)角度探討不同飲食成分相對攝入量與KSD發(fā)生的潛在因果關(guān)聯(lián)。通過運(yùn)用遺傳變異作為IVs，有效降低了傳統(tǒng)觀察性研究中混雜因素和反向因果關(guān)系的影響，并且研究中使用的暴露和結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)樣本沒有重疊，確保了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外還采用了IVW、WMM、MR-Egger回歸分析及MR-PRESSO法等多種統(tǒng)計學(xué)方法驗(yàn)證了結(jié)果的穩(wěn)定性。但是該研究也存在一定的局限性，例如①為了減少人口分層的風(fēng)險，納入的GWAS數(shù)據(jù)來源于歐洲人群，所得結(jié)果和結(jié)論可能不適用于其他種族人群。因此，有必要在其他種族人群中進(jìn)一步研究。②由于飲食數(shù)據(jù)本身的原因，4項MR分析納入的SNP數(shù)量較少，并且研究中P未進(jìn)行校正，可能會導(dǎo)致統(tǒng)計學(xué)效能較低，得出的結(jié)論存在偏倚。但是本研究通過嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)篩選了IVs變量，保證其都是強(qiáng)IVs，且研究結(jié)果不存在水平多效性和異質(zhì)性，為研究結(jié)論的可靠性提供了理論支撐。③本次研究未將暴露與結(jié)局IVs進(jìn)一步詳細(xì)分類，例如，膳食攝入的蛋白質(zhì)包括動物蛋白、植物蛋白，脂肪攝入分為飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸，而KSD包括鈣鹽結(jié)石、尿酸結(jié)石等不同亞組，未來仍需要更進(jìn)一步的研究。

總而言之，本研究發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)有力的遺傳證據(jù)，證明碳水化合物相對攝入量、添加糖相對攝入量是增加KSD發(fā)生風(fēng)險的危險性因素，蛋白相對攝入量、脂肪相對攝入量與KSD發(fā)生風(fēng)險無明顯相關(guān)性，該結(jié)論對KSD的飲食預(yù)防策略有重要意義，值得在更全面的隨機(jī)臨床試驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。

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（編輯 郭楚君）