ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族與膀胱癌免疫治療效果的關(guān)聯(lián)性分析

Analysis of the association between ATP-binding cassette transporter family and the efficacy of immunotherapy for bladder cancer

WANG Tingzheng^1，2，ZHANG Qing²，GUO Hongqian^1，2

（1.Drum Tower Clinical Medicine College of Nanjing Medical University，Nanjing 210029; 2.Department of Urology，Nanjing Drum Tower Hospital，The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School，Nanjing 210008，China）

ABSTRACT：Objective To investigate the clinical utility of ATP-binding cassette transporter family in immunotherapy for bladder cancer based on IMvigor210 and UNC-108 （GSE176307） datasets.Methods Gene expression data of 348 patients with bladder urothelial carcinoma were downloaded from the IMvigor210 database.Firstly，consensus clustering was performed to the gene expression levels of the ATP-binding cassette transporter family，resulting in two clusters：Cluster 1 and Cluster 2.Survival analysis was conducted between the two clusters.Next，univariate Cox regression was employed to identify ATP-binding cassette transporter family genes significantly affecting prognosis.A predictive model was constructed using the random survival forest algorithm to predict treatment response and survival outcomes in patients with bladder cancer receiving immunotherapy.The model’s accuracy was validated with UNC-108 dataset.Then，ESTIMATE and ssGSEA were applied to analyze differences in the tumor microenvironment.Furthermore，oncoPredict algorithm was used to predict the sensitivity of patients to cisplatin.Results A total of 9 ATP-binding cassette transporter family genes were selected to construct the ABC score predictive model.In the IMvigor210 datasets，the Kaplan-Meier analysis revealed that patients with low ABC score had significantly longer overall survival compared to those with high ABC score （P＜0.001）.The ABC score model demonstrated good performance with area under the ROC curve （AUC） of 0.80，0.87，and 0.88 for predicting 0.5-year，1-year，and 1.5-year survival，respectively.The predictive ability of the ABC score for immunotherapy response，with an AUC of 0.78，outperformed that of TMB （AUC：0.72） and PD-L1 （AUC：0.58）.The ABC score also exhibited favorable predictive performance in the UNC-108 validation cohort.ABC score was also significantly correlated with tumor microenvironment immune scores，various immune cells，and the expression of immune checkpoint genes.Conclusion ATP-binding cassette transporter family is closely associated with the tumor microenvironment and the efficacy of immunotherapy for bladder cancer，making it a potential novel biomarker for immunotherapy.

KEY WORDS：bladder cancer; ATP-binding cassette transporters; immunotherapy；tumor microenvironment；gene；predictive model；survival analysis；cisplatin

摘要：目的 基于IMvigor210和UNC-108（GSE176307）數(shù)據(jù)集分析探討ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族在膀胱癌患者免疫治療中的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 從IMvigor210數(shù)據(jù)集下載348例接受免疫治療的膀胱尿路上皮癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，將患者基于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因表達(dá)水平進(jìn)行共識(shí)聚類，分為聚類1和聚類2進(jìn)行生存分析。通過單因素Cox回歸分析篩選出對(duì)預(yù)后有影響的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因，使用隨機(jī)生存森林算法構(gòu)建ABC評(píng)分預(yù)測模型，用于預(yù)測患者的生存期及免疫治療反應(yīng)，利用UNC-108數(shù)據(jù)集進(jìn)一步驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。最后，采用ESTIMATE、ssGSEA算法評(píng)估患者的腫瘤微環(huán)境情況、oncoPredict算法預(yù)測患者對(duì)化療藥物順鉑的敏感性。結(jié)果 篩選出9個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因用于構(gòu)建ABC評(píng)分預(yù)測模型。在IMvigor210隊(duì)列中，Kaplan-Meier生存分析顯示ABC評(píng)分低的患者總生存時(shí)間明顯長于ABC評(píng)分高的患者（P＜0.001）；ABC評(píng)分模型對(duì)患者0.5年、1年和1.5年生存預(yù)測的受試者工作特征曲線下面積（AUC）分別為0.80、0.87和0.88；ABC評(píng)分對(duì)免疫治療效果的預(yù)測能力的AUC為0.78，高于腫瘤突變負(fù)荷（AUC：0.72）和程序性死亡受體配體1（AUC：0.58）。ABC評(píng)分在UNC-108驗(yàn)證隊(duì)列中也有著良好的預(yù)測效果。ABC評(píng)分與腫瘤微環(huán)境、多種免疫細(xì)胞、免疫表型、免疫評(píng)分、免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)情況顯著相關(guān)。結(jié)論 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族與膀胱癌的腫瘤微環(huán)境、免疫治療效果關(guān)系密切，有望成為膀胱癌免疫治療的新型生物標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞：膀胱癌；ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；免疫治療；腫瘤微環(huán)境；基因；預(yù)測模型；生存分析；順鉑

中圖分類號(hào)：R737.14 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2024.12.002

膀胱癌（bladder cancer，BCa）是最常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居高不下，嚴(yán)重威脅患者的生存和生活質(zhì)量^[1]。BCa病例中90%～95%病理類型為尿路上皮癌，基于鉑類藥物的化療是晚期尿路上皮癌患者的一線治療方式^[2]，即使接受化療，患者的平均總生存期也僅為12～14個(gè)月^[3]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint blockade，ICB），尤其是針對(duì)程序性死亡受體1/程序性死亡受體配體1（programmed cell death-1/programmed death-ligand 1，PD-1/PD-L1）的靶向抗體藥物，可以改善對(duì)以順鉑為主的輔助化療無效的BCa患者預(yù)后^[4]。然而，由于腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）的異質(zhì)性，這種治療的應(yīng)答率仍然相對(duì)較低，只有50%的患者可以從中獲益^[5]。雖然腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden，TMB）、PD-L1表達(dá)情況和一些免疫相關(guān)基因簽名已被發(fā)現(xiàn)可以作為BCa患者ICB治療預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物，但其適用性仍然有限^[6]。因此，在臨床實(shí)踐中迫切需要可靠的生物標(biāo)志物來準(zhǔn)確預(yù)測哪些患者能更好地響應(yīng)這些治療策略，以便制定個(gè)性化的治療方案。

ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族由51個(gè)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)組成，隸屬于7個(gè)亞家族。研究表明ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族與TME存在復(fù)雜的聯(lián)系，可以影響癌癥免疫治療效果，并與多藥的耐藥性相關(guān)^[7]。YUAN等^[8]通過構(gòu)建ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因特征，發(fā)現(xiàn)其可以在評(píng)價(jià)乳腺癌患者預(yù)后和免疫治療效果方面發(fā)揮一定的作用。WANG等^[9]研究發(fā)現(xiàn)了5個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與甲狀腺癌的免疫調(diào)節(jié)以及預(yù)后密切相關(guān)。然而，目前對(duì)于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族與BCa之間的聯(lián)系仍知之甚少，因此非常有必要探索分析以明確ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族在其中的作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)TME的狀態(tài)對(duì)惡性腫瘤的預(yù)后及療效有顯著影響^[10]，深入研究ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族與BCa的TME之間的相互作用，可提高對(duì)BCa分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為制定新的治療方案提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 從IMvigor210數(shù)據(jù)集（http：//research-pub.gene.com/IMvigor210CoreBiologie s/）下載348例接受免疫治療的膀胱尿路上皮癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。IMvigor210研究是用于評(píng)價(jià)阿替利珠單抗在鉑類化療后進(jìn)展的晚期尿路上皮癌中的治療效果的臨床研究，患者的藥物反應(yīng)、臨床資料和生存信息等從“IMvigor210CoreBiologies” 包中獲取^[11]。根據(jù)免疫治療反應(yīng)效果將患者分反應(yīng)組和非反應(yīng)組，反應(yīng)組包括完全緩解（complete response，CR）和部分緩解（partial response，PR），非反應(yīng)組包括疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）和疾病進(jìn)展（progressive disease，PD）。

從GEO數(shù)據(jù)庫（https：/www.ncbi.nimn.nih.gov/）下載UNC-108（GSE176307）數(shù)據(jù)集，包括90例接受ICB治療的尿路上皮癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床特征^[12]。

1.2 共識(shí)聚類 通過“ConsensusClusterPlus” R軟件包^[13]對(duì)348個(gè)樣本中的51個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因進(jìn)行共識(shí)聚類，得到2～9個(gè)聚類，當(dāng)K=2時(shí)，取得了最好的聚類效果。

1.3 預(yù)測模型的構(gòu)建 使用單因素Cox回歸分析比較ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因?qū)颊哳A(yù)后的影響，篩選出與總生存期相關(guān)的基因。使用篩選出的基因，應(yīng)用“randomForestSRC” R軟件包^[14]構(gòu)建隨機(jī)森林生存模型。通過隨機(jī)森林生存分析，對(duì)每個(gè)患者輸出對(duì)應(yīng)的生存風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)，稱為ABC評(píng)分，根據(jù)ABC評(píng)分的中位數(shù)劃分高低分組。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線衡量模型的預(yù)測價(jià)值，采用“timeROC” R軟件包^[15]進(jìn)行時(shí)間依賴ROC曲線分析，采用“pROC” R軟件包^[16]評(píng)估對(duì)治療反應(yīng)的預(yù)測效果。

1.4 生存分析 為明確BCa患者接受免疫治療后總生存期與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因的相關(guān)性，應(yīng)用“survival” R軟件包進(jìn)行生存分析并繪制Kaplan-Meier生存曲線圖。使用“forestplot” R軟件包繪制森林圖。

1.5 模型的驗(yàn)證 為驗(yàn)證模型的泛化能力，在獨(dú)立的UNC-108數(shù)據(jù)集上采用與訓(xùn)練集一致的變量參數(shù)進(jìn)行隨機(jī)生存森林分析，輸出每例患者的ABC評(píng)分，根據(jù)ABC評(píng)分的中位數(shù)劃分高低分組，通過ROC曲線分別驗(yàn)證模型對(duì)生存時(shí)間、治療效果的預(yù)測能力。

1.6 TME分析 使用單樣本基因集富集分析（single sample Gene Set Enrichment Analysis，ssGSEA），應(yīng)用“GSVA” R軟件包^[17]估算28種腫瘤浸潤免疫細(xì)胞亞型的相對(duì)比例。TME評(píng)分由“ESTIMATE” R 軟件包^[18]進(jìn)行評(píng)估，包括基質(zhì)評(píng)分、免疫評(píng)分和ESTIMATE評(píng)分。提取免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)量，通過“pheatmap” R軟件包繪制熱圖。

1.7 藥物敏感性分析 基于公開藥物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫“癌癥藥物敏感性基因組學(xué)”預(yù)測每個(gè)樣本的化療反應(yīng)，數(shù)據(jù)來自https：//www.cancerrxgene.org/。應(yīng)用“oncoPredict” R軟件包^[19]計(jì)算藥物的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC₅₀），評(píng)估患者對(duì)順鉑的藥物敏感性差異。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用R 4.3.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的資料，兩組組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組的組間比較采用單因素方差分析。不符合正態(tài)分布的資料，兩組組間比較采用 Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組組間比較采用Kruskal-Wallis（H）檢驗(yàn)。對(duì)于計(jì)數(shù)資料采用例（%）描述，采用χ²檢驗(yàn)或Fisher確切概率法比較組間差異。雙側(cè)檢驗(yàn) P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因共識(shí)聚類分析 基于51個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因表達(dá)量對(duì)IMvigor210隊(duì)列的348個(gè)樣本進(jìn)行共識(shí)聚類分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)聚類數(shù)K=2時(shí)，聚類效果最佳（圖1A），這證實(shí)可以通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因?qū)颊哌M(jìn)行分類。生存分析顯示聚類2的患者生存期顯著高于聚類1的患者（P=0.012，圖1B）。

2.2 ABC評(píng)分模型的構(gòu)建 對(duì)在IMvigor210隊(duì)列中的51個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因進(jìn)行單因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，TAP1、TAP2、ABCD3、ABCA3、ABCF1和ABCD2為接受免疫治療的膀胱尿路上皮癌患者預(yù)后的保護(hù)因素，而CFTR、ABCG5和ABCG8為患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P＜0.05，圖2A）。進(jìn)一步應(yīng)用隨機(jī)生存森林算法依據(jù)以上9個(gè)與預(yù)后顯著相關(guān)的基因構(gòu)建生存模型（圖2B）。

2.3 ABC評(píng)分模型用于生存分析、療效預(yù)測及其驗(yàn)證 Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，IMvigor210隊(duì)列中ABC評(píng)分低的患者比ABC評(píng)分高的患者的總生存時(shí)間更長（P＜0.001，圖3A）。IMvigor210隊(duì)列中患者0.5年、1年和1.5年生存預(yù)測的ROC曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.80、0.87和0.88（圖3B）。ABC評(píng)分預(yù)測免疫治療反應(yīng)的AUC為0.78，高于TMB（AUC：0.72）和PD-L1（AUC：0.58），說明該模型具有良好的預(yù)測能力（圖3C）。

使用UNC-108隊(duì)列驗(yàn)證ABC評(píng)分模型的預(yù)測效果，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，UNC-108隊(duì)列中ABC評(píng)分低的患者的總生存時(shí)間長于ABC評(píng)分高的患者（P＝0.041，圖3D）。UNC-108隊(duì)列中患者0.5年、1年和1.5年生存預(yù)測的AUC分別為0.62，0.70和0.67（圖3E）。此外，預(yù)測患者免疫治療反應(yīng)的AUC為0.64（圖3F）。這些結(jié)果驗(yàn)證了ABC評(píng)分模型的準(zhǔn)確性和可靠性。

2.4 ABC評(píng)分與BCa患者TME的關(guān)系及藥物敏感性分析 使用“ssGSEA”方法來評(píng)估28種不同免疫細(xì)胞在BCa的TME中的浸潤水平，發(fā)現(xiàn)ABC評(píng)分高低兩組間具有不同的免疫細(xì)胞浸潤特征，ABC評(píng)分低的患者TME中的活化B細(xì)胞、活化CD4⁺T細(xì)胞、活化CD8⁺T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞較ABC評(píng)分高的患者更多（圖4A）。

使用“ESTIMATE”方法探討ABC評(píng)分與患者TME評(píng)分之間的關(guān)聯(lián)，結(jié)果提示了ABC評(píng)分低的患者的免疫評(píng)分和ESTIMATE評(píng)分比ABC評(píng)分高的患者更高（P＜0.001，P＜0.01），而基質(zhì)評(píng)分在兩組間無顯著差異（圖4B）。

進(jìn)一步探討ABC評(píng)分與患者免疫表型關(guān)系發(fā)現(xiàn)，ABC評(píng)分低的患者中，34.75%的患者為炎癥型，排除型和沙漠型分別為43.97%和21.28%；而ABC評(píng)分高的患者中，炎癥型僅占17.48%，排除型和沙漠型分別為50.35%和32.17%（圖4C）。

繼續(xù)分析ABC評(píng)分與免疫檢查點(diǎn)基因的關(guān)系，熱圖顯示ABC評(píng)分與包括CTLA4、PDCD1、CD274、TIGIT在內(nèi)的多個(gè)重要免疫檢查點(diǎn)基因存在顯著的負(fù)相關(guān)性（P＜0.05，圖4D）。

通過藥物敏感性分析評(píng)估患者對(duì)順鉑的IC₅₀，發(fā)現(xiàn)ABC評(píng)分低的患者對(duì)順鉑的IC₅₀值顯著低于ABC評(píng)分高的患者（P＜0.01，圖4E）。

3 討 論

未來，隨著預(yù)測BCa免疫治療效果的新型生物標(biāo)志物的開發(fā)，精確識(shí)別出最有可能受益的患者群體成為可能。在創(chuàng)新藥物如靶向治療藥物和抗體偶聯(lián)藥物（antibody-drug conjugates，ADC）的研究與臨床應(yīng)用不斷取得進(jìn)展的前提下，BCa的治療手段更多樣。精準(zhǔn)靶向和綜合治療策略的結(jié)合，將重構(gòu)BCa的臨床治療模式，為患者提供更多治療選擇。

近年來，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員在許多惡性腫瘤中的作用被廣泛研究。有報(bào)道顯示TAP1表達(dá)量下調(diào)可能導(dǎo)致結(jié)直腸癌的免疫逃逸，這也是Ⅰ～Ⅱ期結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素^[20]。PENG等^[21]研究發(fā)現(xiàn)CFTR的過表達(dá)與宮頸癌的腫瘤進(jìn)展、侵襲性和不良預(yù)后密切相關(guān)。ZHANG等^[22]研究發(fā)現(xiàn)ABCD3的異常表達(dá)是結(jié)直腸癌的獨(dú)立預(yù)后因素。以上研究表明ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員有望成為多種惡性腫瘤治療靶標(biāo)或生物標(biāo)志物，所以筆者推測ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族很可能也在BCa發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。然而，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族與BCa之間的具體聯(lián)系尚不明確，其對(duì)BCa的TME所產(chǎn)生的效應(yīng)以及在臨床治療中的應(yīng)用潛力仍待進(jìn)一步闡明。

本研究分析了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族在BCa中的作用，研究結(jié)果對(duì)BCa免疫治療的臨床指導(dǎo)有一定的意義，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)基于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因構(gòu)建的ABC評(píng)分模型對(duì)接受ICB治療的BCa患者的0.5年、1年和1.5年生存率具有可靠的預(yù)測能力；ABC評(píng)分低的患者接受免疫治療效果更好，生存期更長；ABC評(píng)分對(duì)ICB治療反應(yīng)的預(yù)測AUC大于TMB和PD-L1。同時(shí)，通過獨(dú)立的數(shù)據(jù)集UNC-108隊(duì)列檢驗(yàn)了ABC評(píng)分的療效評(píng)估與生存預(yù)測能力，結(jié)果表明ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有望成為免疫治療具有臨床應(yīng)用價(jià)值的生物標(biāo)志物指標(biāo)。

TME中的免疫成分在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中尤為重要，對(duì)免疫逃避、耐受和腫瘤進(jìn)展都有影響^[23]。因此，本研究以28種免疫細(xì)胞為基礎(chǔ)，通過ssGSEA算法量化了IMvigor210隊(duì)列中免疫細(xì)胞的豐度，發(fā)現(xiàn)ABC評(píng)分與BCa患者TME中的多種免疫細(xì)胞相關(guān)，提示ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族可能在調(diào)節(jié)BCa與免疫系統(tǒng)之間的復(fù)雜相互作用中發(fā)揮重要作用，這可能影響B(tài)Ca的治療和預(yù)后。先前的研究表明，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族不僅影響抗腫瘤藥物的外排，也參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖、遷移、侵襲等途徑，并在細(xì)胞間相互通信中發(fā)揮重要作用^[7，24]。例如，TAP1與TAP2共同形成TAP跨膜蛋白質(zhì)復(fù)合體，其主要功能是將胞內(nèi)產(chǎn)生的多肽片段從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)中，這一過程對(duì)于主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ（major histocompatibility complex-Ⅰ，MHC-Ⅰ）的抗原呈遞功能至關(guān)重要^[25]。TAP復(fù)合體功能異常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性CD8⁺ T細(xì)胞識(shí)別惡性腫瘤細(xì)胞的功能發(fā)生障礙，促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，從而影響免疫治療的有效性^[26]。

本研究也存在局限性，數(shù)據(jù)分析僅限于公開數(shù)據(jù)集IMvigor210以及UNC-108，未能收集臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，也未對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族在BCa中的具體生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行深入探討。綜上所述，目前ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族與BCa相關(guān)的研究仍相對(duì)不足，本項(xiàng)研究確立了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族在預(yù)測BCa患者免疫治療反應(yīng)方面的潛在價(jià)值，這可能有助于在臨床應(yīng)用中制定適合BCa患者的最佳治療方案。

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（編輯 鐘嬌嬌）