大白菜根系分泌物對(duì)幼苗自毒作用的研究

摘要：［目的］目前連作障礙已經(jīng)成為限制十字花科蔬菜生產(chǎn)最主要的原因之一，探究大白菜根系分泌物對(duì)自身幼苗生長(zhǎng)產(chǎn)生的影響，可為解決大白菜栽培過(guò)程中的連作問(wèn)題以及大白菜自毒作用的研究提供理論依據(jù)。［方法］本研究以大白菜品種‘金麒麟’為試驗(yàn)材料，在室內(nèi)進(jìn)行水培，共設(shè)置8 組處理：CK1（1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液）、CK2（1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+活性炭）、T1（根系分泌物收集液）、T2（根系分泌物+活性炭）、T3（根系分泌物稀釋2 倍）、T4（根系分泌物稀釋3 倍）、T5（根系分泌物稀釋4 倍）、T6（根系分泌物稀釋5 倍），分析不同稀釋倍數(shù)的根系分泌物對(duì)大白菜幼苗生長(zhǎng)性狀、生理生化指標(biāo)和葉片質(zhì)膜完整性的影響，探討大白菜根系分泌物的自毒作用機(jī)理。［結(jié)果］與稀釋后的各處理相比，T1 處理導(dǎo)致大白菜幼苗的生物量顯著減少，較CK1 處理地上部鮮重顯著降低了84. 82%，根系活力較CK1 處理顯著減少了40. 16%，損傷了根系結(jié)構(gòu)；葉綠素含量減少32% 以上，MDA 含量增加，過(guò)氧化氫和超氧陰離子的積累增加，并對(duì)葉片質(zhì)膜完整性造成破壞；與T1 處理相比，T2 添加活性炭與根系分泌物稀釋各處理對(duì)幼苗的傷害均有所減輕，同時(shí)，大白菜幼苗自身可以通過(guò)提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量以及抗氧化酶活力來(lái)降低自毒作用所造成的傷害。［結(jié)論］大白菜根系分泌物對(duì)幼苗存在自毒作用，影響幼苗生長(zhǎng)，而添加生物活性炭和稀釋培養(yǎng)液在一定程度上可以減輕大白菜根系分泌物對(duì)幼苗的自毒作用造成的影響。

關(guān)鍵詞：大白菜； 根系分泌物； 自毒作用； 生理生化

中圖分類號(hào)：S634.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-8151（2024）06-0078-09

大白菜（Brassica rapa ssp. pekinensis）屬十字花科蕓薹屬植物，是我國(guó)種植規(guī)模第二大蔬菜作物［1］，種植面積與市場(chǎng)銷量大，由于連茬種植以及區(qū)域化的種植習(xí)慣，導(dǎo)致連作障礙問(wèn)題凸顯，病蟲害加劇，植株生長(zhǎng)緩慢、長(zhǎng)勢(shì)弱［2］，且長(zhǎng)期種植單一蔬菜作物，會(huì)導(dǎo)致品種退化問(wèn)題加重，這可能與土壤養(yǎng)分流失、微生物種群特征改變和植物根系分泌有毒物質(zhì)等原因有關(guān)［3］。研究認(rèn)為，自毒作用是造成十字花科蔬菜連作障礙的重要原因之一。自毒作用（Autotoxicity）是指植物根系分泌或植株殘茬降解后向環(huán)境中釋放化學(xué)物質(zhì)，危害自身或者種內(nèi)植物，使其受到毒害的現(xiàn)象，同時(shí)也是植物適應(yīng)種內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)的表現(xiàn)［4-5］。土壤中過(guò)多的根系分泌物和植株殘茬等自毒物質(zhì)（如醌類、苯甲酸及其衍生物、肉桂酸及其衍生物、香豆素類等）的累積，加劇了連作障礙的發(fā)生，降低葉菜類農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量與品質(zhì)［6］。研究表明，根系分泌物會(huì)刺激土壤中有害微生物的生長(zhǎng)和繁殖，且經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期積累，降低了花生的單葉光合速率、群體光合速率、葉片中可溶糖含量、氨基酸含量等，從而抑制花生的生長(zhǎng)發(fā)育［7］；高濃度的化感物質(zhì)，如高濃度酚酸使玉米幼苗的株高、根長(zhǎng)及鮮重降低，使丙二醛及脯氨酸含量增高，導(dǎo)致玉米細(xì)胞膜過(guò)氧化程度增高及細(xì)胞水分缺乏［8］。針對(duì)大蒜、小麥、花生和玉米等多種作物的根系分泌物自毒作用已有較多研究，而在蕓薹屬蔬菜中大白菜根系分泌物自毒作用的研究并不十分明確。本試驗(yàn)通過(guò)設(shè)置大白菜根系分泌物添加活性炭及稀釋不同倍數(shù)處理，研究自毒作用脅迫對(duì)大白菜幼苗葉長(zhǎng)、葉寬、鮮重、干重等生長(zhǎng)發(fā)育特征，以及過(guò)氧化氫和超氧陰離子的積累與質(zhì)膜完整性等生理特性的影響，旨在為揭示大白菜自毒作用的機(jī)理與大白菜連作障礙的克服及改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料與試劑

大白菜品種‘ 金麒麟’（河北慕蘭多種子有限公司），Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液（上海麥克林有限公司）。

1. 2 大白菜根系分泌物的收集

大白菜種子用蒸餾水進(jìn)行催芽，并置于25 ℃組培室中。催芽1 d 后，將幼苗用漂浮板固定并漂浮于1/4 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)。7 d后，將幼苗移到加入1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液的組培瓶中，每瓶容量為200 mL 營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)4 株幼苗，共設(shè)置100 個(gè)組培瓶。組培瓶包錫箔紙避光，組培室培養(yǎng)環(huán)境為光照強(qiáng)度6000 lx、14 h、25 ℃，黑暗10 h、19 ℃。幼苗生長(zhǎng)期間，調(diào)節(jié)pH 保持在5. 8～6. 5，并監(jiān)測(cè)營(yíng)養(yǎng)液EC 值及體積維持在200 mL 并攪拌通氣。培養(yǎng)20 d 后，過(guò)濾收集水培液（根系分泌物）備用。

1. 3 試驗(yàn)處理

將收集的根系分泌物分別按體積比用1/2Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液稀釋2 倍、3 倍、4 倍、5 倍，之后設(shè)置8 個(gè)處理，分別為CK1（1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液）、CK2（1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液+活性炭）、T1（根系分泌物）、T2（根系分泌物+活性炭）、T3（根系分泌物稀釋2 倍）、T4（根系分泌物稀釋3 倍）、T5（根系分泌物稀釋4 倍）、T6（根系分泌物稀釋5 倍）。其中，CK2 與T2 處理的每個(gè)組培瓶中添加0. 05 g 活性炭。每個(gè)處理設(shè)置4 個(gè)組培瓶，每瓶4 株幼苗，3次重復(fù)，每處理共48 株。每周調(diào)節(jié)pH 保持在5. 8～6. 5，并監(jiān)測(cè)其EC 值。期間每間隔4 d 用量筒向每個(gè)組培瓶中添加1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液并進(jìn)行攪拌通氣，添加溶液體積至200 mL。

1. 4 測(cè)定性狀與方法

1. 4. 1 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

每處理隨機(jī)取5 株長(zhǎng)勢(shì)基本一致的幼苗進(jìn)行形態(tài)指標(biāo)測(cè)定，重復(fù)3 次。用直尺測(cè)量最大葉長(zhǎng)、最大葉寬、株幅；用天平稱量植株地上部鮮（干）重和地下部鮮（干）重。

1. 4. 2 根系指標(biāo)及生理指標(biāo)的測(cè)定

各處理隨機(jī)選取5 株長(zhǎng)勢(shì)基本一致的幼苗葉片混樣，進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定；取根部進(jìn)行根系活力與根部掃描測(cè)定，重復(fù)3 次。采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法測(cè)定根系活力［9］；植株根系用清水洗凈后進(jìn)行根系掃描（根系掃描儀，WinRhizo Ba?sic03040415），分析根系形態(tài)指標(biāo)。參考高俊鳳［8］的方法測(cè)定生理指標(biāo)：利用96% 乙醇研磨提取比色的方法測(cè)定葉綠素含量（mg·g-1）；采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定葉片可溶性蛋白含量（mg·g-1）；采用酸性茚三酮比色法測(cè)定脯氨酸含量（μg·g-1 FW）；蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量（mg·g-1）；采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（MDA）含量（μmol·g-1）；采用氯化硝基四氮唑（NBT）光化還原法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性（單位U·g-1 FW·min-1）；采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性（單位U·μg-1 FW·min-1）；采用紫外吸收比色法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）活性（單位U·g-1 FW·min-1）。酶活性以1 分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1 μmol 底物的酶量（即1 U=1 μmol·min-1）來(lái)表示，酶U 縮寫代表酶的活性單位。

1. 4. 3 過(guò)氧化氫和超氧陰離子積累及質(zhì)膜完整性的染色觀察

各處理隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的幼苗葉片，將葉片置于50 mL 離心管，每個(gè)離心管可放入2～3 個(gè)葉片，向離心管中加入染液。超氧陰離子、過(guò)氧化氫以及質(zhì)膜完整性的組織化學(xué)染色分別參考Baker 等［10］、Xu 等［11］和Fryer 等［12］方法。NBT 溶液配置：稱取0. 5 g NBT，用50 mmol·L-1磷酸緩沖液（pH 7. 8）定容到1 L，得到0. 5 mg·mL-1 NBT 染液。DAB溶液配置：稱取0. 5 g DAB，先用30 μL鹽酸預(yù)溶，再分次加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓挥名}酸將pH 調(diào)至3. 8，之后用蒸餾水定容至1 L，得到0. 5 mg·mL-1DAB 染液。Evans blue 染液配置：取2. 5 g Evansblue 溶于100 mmol·L-1 CaCl2 中，并將pH 調(diào)整至5. 6，得到0. 25% Evans blue 染液。

1. 5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及圖表繪制，使用IBM-SPSS 24. 0 軟件，運(yùn)用單因素方差分析（ANOVA）中的最小顯著性差異（LSD）法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，差異顯著性水平α=0. 05。

2 結(jié)果與分析

2. 1 自毒作用對(duì)大白菜幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)影響

如表1 所示，與CK1 處理相比，添加活性炭的CK2 對(duì)大白菜幼苗的地上部鮮重?zé)o明顯影響。T1處理的地上部鮮重比CK1 處理顯著降低了84. 82%；添加活性炭的T2 處理及T3～T5 各稀釋處理的地上部鮮重較T1 處理均顯著增加，并且T5和T6 處理的地上部鮮重與CK1、CK2 處理無(wú)顯著差異，即根系分泌物稀釋到一定倍數(shù)后則可減弱自毒物質(zhì)的抑制作用。同樣，地上部干重也表現(xiàn)出相似的規(guī)律。

從地下部鮮重可以看出，T1 處理的地下部鮮重比CK1 處理降低了28. 30%，差異顯著；添加活性炭的T2 處理相比T1 處理的地下部鮮重提高了9. 43%；T4、T5、T6 處理的地下部鮮重分別比CK1 處理顯著增加了18. 63%、23. 04% 和40. 20%；T1 處理的地下部干重顯著低于CK1 處理；T4、T5、T6 處理的地下部干重也顯著高于CK1 處理。

此外，T1 處理的株幅、最大葉寬和葉長(zhǎng)也受到明顯影響，分別較CK1 處理顯著降低了53. 18%、24. 65% 和28. 30%；添加活性炭的T2 處理的株幅、最大葉寬和葉長(zhǎng)分別較T1 處理增加了25. 40%、8. 89%、8. 24%；根系分泌物培養(yǎng)液稀釋后各處理的株幅、最大葉寬和葉長(zhǎng)較T1 處理有明顯改善，尤其是稀釋5 倍后，幼苗的最大葉寬和葉長(zhǎng)與CK1 處理無(wú)顯著差異。

2. 2 自毒作用對(duì)大白菜幼苗根系影響

如圖1 所示，T1 處理的根系活力較CK1 處理顯著減少了40. 16%。除根直徑外，T1 處理總根長(zhǎng)和根表面積等根系指標(biāo)較CK1 處理顯著減少了41. 18%～57. 75%；而T2 處理與稀釋后T3～T6各處理根系指標(biāo)均顯著高于T1 處理，并隨稀釋倍數(shù)增加而升高，T4、T5 和T6 處理植株根系體積、根系分支數(shù)和根系交叉數(shù)均顯著高于CK1 處理。T6 處理根長(zhǎng)、表面積、分枝數(shù)、交叉數(shù)顯著高于其它處理。

2. 3 自毒作用對(duì)大白菜幼苗葉綠素含量影響

表2 表明，T1 處理的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素以及葉綠素a+b 含量分別較CK1 處理顯著降低了52. 87%、42. 13%、32. 99% 和49. 89%；T2根系分泌物添加活性炭處理的幼苗葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素以及葉綠素a+b 含量較T1 處理有所升高，但無(wú)顯著影響；隨根系分泌物稀釋倍數(shù)增加，葉綠素含量也在不斷增加，當(dāng)根系分泌物稀釋5 倍后，T6 處理的葉綠素b 以及葉綠素a+b 含量與CK1 處理無(wú)顯著差異。

2. 4 自毒作用對(duì)大白菜幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和MDA 含量影響

圖2 顯示，T1 處理的可溶性蛋白含量、可溶性糖含量與脯氨酸含量均顯著高于CK1 和CK2，T2添加活性炭處理與各稀釋處理較T1 處理均有下降；其中，T6 處理稀釋5 倍與CK1 處理無(wú)顯著差異。T1～T6 各處理的MDA 含量比CK1 和CK2處理顯著升高，以T1 處理的MDA 含量最高，為CK1 處理的1. 6 倍；T2 添加活性炭處理較T1 處理顯著降低了18. 80%；培養(yǎng)液稀釋不同倍數(shù)間MDA 含量差異不顯著，但均顯著低于T1 重茬液處理。

2. 5 自毒作用對(duì)大白菜幼苗抗氧化酶活性影響

圖3 顯示，T1～T6 各處理酶活性均高于CK1和CK2 處理，以T1 處理最高，其中T1 處理的SOD 酶活性、POD 酶活性、CAT 酶活性較CK1 處理分別顯著升高了50. 15%、50%、53. 96%，T2 添加活性炭處理較T1 處理分別降低了5. 90%、8. 13%、9. 11%；之后隨著稀釋倍數(shù)的增加而下降，均顯著低于T1 處理。其中T6 根系分泌物稀釋5 倍后處理的各酶活性與CK1 處理無(wú)顯著差異。說(shuō)明根系分泌物稀釋后對(duì)植物的脅迫減小。

2. 6 自毒作用對(duì)大白菜幼苗活性氧積累及質(zhì)膜完整性影響

由圖4 可見，T1 處理的大白菜幼苗葉片DAB染色程度較CK1 和CK2 處理棕褐色加深，NBT 染色藍(lán)紫色沉淀面積增大且葉片Evans blue 染色的藍(lán)色明顯；而添加活性炭的T2 處理會(huì)使葉片的染色程度減輕，隨著稀釋處理倍數(shù)的增加，葉片的染色程度也依次減輕。這說(shuō)明T1 處理使大白菜幼苗葉片的過(guò)氧化氫含量和超氧陰離子含量顯著升高，并破壞了大白菜幼苗葉片的質(zhì)膜完整性。

3 討論

3. 1 自毒作用對(duì)植株生長(zhǎng)及根系影響

根系分泌物的自毒作用會(huì)阻礙種子萌發(fā)，減少植株的生物量。吳曉婷等［13］試驗(yàn)表明，100～1000 mg·L-1 2，6-二叔丁基對(duì)甲酚與鄰苯二甲酸二丁酯降低了煙草種子的發(fā)芽率以及幼苗鮮重，抑制苗高以及根的伸長(zhǎng)。王璐等［14］報(bào)道稱2 mL·株-1大豆根系分泌物促進(jìn)了小麥種子的萌發(fā)以及幼苗生長(zhǎng)，而20 mL·株-1的大豆根系分泌物則抑制了小麥種子萌發(fā)，這體現(xiàn)了根系分泌物的濃度效應(yīng)。本研究表明，T1 處理抑制了大白菜幼苗的生長(zhǎng)，在添加活性炭后，緩解了自毒物質(zhì)對(duì)幼苗的毒害作用，這與已報(bào)道的活性炭可緩解自毒作用的結(jié)果一致［15］。將根系分泌物稀釋之后，大白菜根系分泌物的毒害作用也有所減弱，當(dāng)稀釋4 倍以上，幼苗地下部鮮重顯著高于CK1 處理，這可能是由于較低濃度的根系分泌物對(duì)根系的發(fā)育有促進(jìn)作用。陳君良［16］認(rèn)為，較高濃度的蘭州百合根系分泌物使得根系活力、總根長(zhǎng)、根系表面積和根尖數(shù)等根系形態(tài)指標(biāo)都有不同程度的下降。馬文月［17］用龍牙百合根系分泌物中的N，N-二乙基-二甲基苯甲酰胺處理百合幼苗觀察根尖細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)根尖細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重變形，細(xì)胞壁降解，最終使細(xì)胞變成空腔。此外，也有學(xué)者認(rèn)為自毒物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致根尖細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離［18-19］。本研究結(jié)果表明，T1 處理的根系活力顯著低于T2 添加活性炭和CK1 對(duì)照處理，這進(jìn)一步證明了大白菜根系分泌物自毒效應(yīng)；將培養(yǎng)液稀釋后，抑制作用減輕，尤其當(dāng)稀釋5 倍后，T6 處理的幼苗根系活力顯著高于CK1 處理。T2 添加活性炭和稀釋后各個(gè)處理根系形態(tài)指標(biāo)均高于T1 處理，說(shuō)明根系分泌物培養(yǎng)液稀釋到一定倍數(shù)后可避免自毒物質(zhì)抑制作用，較低濃度的根系分泌物對(duì)根系傷害較小，并且具有一定的生長(zhǎng)刺激作用，也有可能是引起植株自身抗性的提高使得植物根系更能適應(yīng)環(huán)境。

3. 2 自毒作用對(duì)幼苗葉綠素含量及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)影響

研究認(rèn)為，自毒作用會(huì)影響蒸騰效率和導(dǎo)致氣孔關(guān)閉，降低葉綠素含量［20-21］。齊永志等［22］和Wang 等［23］認(rèn)為自毒物質(zhì)主要通過(guò)抑制PSII 中的電子傳遞效率來(lái)影響碳同化和有機(jī)物積累。本研究發(fā)現(xiàn)T1 處理的大白菜幼苗葉綠素含量顯著低于CK1 處理，這說(shuō)明大白菜的根系分泌物會(huì)抑制葉綠素合成，從而影響植株光合同化能力，活性炭可吸附前茬大白菜根系分泌物中的部分自毒物質(zhì)，使得葉綠素含量較T1 處理有所升高。隨著稀釋倍數(shù)的增加，葉綠素含量也在不斷增加。張磊等［24］報(bào)道稱，低濃度的大蒜根系分泌物可增加當(dāng)歸葉片糖分積累，增強(qiáng)幼苗抗逆性，高濃度則抑制幼苗生長(zhǎng)。郭偉等［25］認(rèn)為，玉米、小麥、大豆以及蕓豆的根系分泌物提高了蕓豆幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，可緩解根系分泌物對(duì)蕓豆幼苗細(xì)胞膜的損傷。本研究中T1 處理的MDA 含量顯著高于其它處理，同時(shí)，T1 處理的3 種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量達(dá)到峰值，而添加活性炭后滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量有所減少，說(shuō)明活性炭吸附了一些阻礙植物生長(zhǎng)發(fā)育的有機(jī)物質(zhì)，從而減輕了根系分泌物的自毒作用，這與李忠等［26］的研究結(jié)果一致，3 種化感物質(zhì)苯甲醛、對(duì)乙基苯甲酸及阿魏酸不同濃度處理均增加了SOD 和POD 活力及MDA 含量，且都隨著處理濃度的增加而增加。

3. 3 自毒作用對(duì)幼苗抗氧化酶系統(tǒng)影響

許多研究表明，自毒作用存在著氧化脅迫［27］，從而阻礙植物生長(zhǎng)。Zhang 等［28］研究認(rèn)為，自毒作用使甜瓜幼苗根系積累了過(guò)量的活性氧，激活了大部分抗氧化酶。以上結(jié)果均表明抗氧化酶（SOD、POD 和CAT）系統(tǒng)是一種有效的保護(hù)機(jī)制［29］。本研究的染色觀察表明，T1 處理破壞了大白菜幼苗的質(zhì)膜完整性，增加了葉片的過(guò)氧化氫以及超氧陰離子積累，迫使大白菜幼苗產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活防御系統(tǒng)。T1 處理對(duì)大白菜幼苗的傷害最大，致使幼苗體內(nèi)保護(hù)酶活性提高以清除過(guò)多的超氧陰離子和抑制過(guò)氧化氫積累。根系分泌物添加活性炭以及稀釋之后的葉片過(guò)氧化氫含量與超氧陰離子含量也有明顯降低，根系分泌物對(duì)葉片質(zhì)膜完整性的破壞減輕。

4 結(jié)論

綜上所述，大白菜根系分泌物降低幼苗的根系活力，損傷了根系結(jié)構(gòu)；葉綠素含量減少，MDA含量增加，過(guò)氧化氫和超氧陰離子的積累增加，并對(duì)葉片質(zhì)膜完整性造成破壞，從而影響大白菜幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)幼苗存在自毒作用，而添加生物活性炭和稀釋后的重茬液在一定程度上可以緩解大白菜根系分泌物對(duì)幼苗的自毒作用產(chǎn)生的影響。本研究從生理水平揭示了大白菜根系分泌物影響幼苗生長(zhǎng)的作用機(jī)制，為解決生產(chǎn)實(shí)踐中根系分泌物導(dǎo)致的自毒作用問(wèn)題提供理論依據(jù)。

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（編輯：郭玥微）

基金項(xiàng)目：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-23-G22）；太白縣農(nóng)業(yè)科技園區(qū)重點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目（2022TBNYKJ-2）