大豆膨脹素基因GmEXPB5和GmEXPB7生物信息學及表達分析

摘要： 膨脹素（expansin，EXP）通過調控細胞壁的松弛在植物應對環(huán)境脅迫過程中起著重要作用。為研究EXP基因在大豆應對非生物脅迫過程中的作用，該文對大豆中的兩個EXP基因（GmEXPB5和GmEXPB7）及其蛋白序列進行生物信息學分析，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測基因表達量。結果表明：（1） GmEXPB5和GmEXPB7分別位于大豆第10號和第12號染色體上，編碼的蛋白序列長度分別為272和267個氨基酸。GmEXPB5蛋白分子量為29.07 kD，理論等電點為7.51；GmEXPB7蛋白分子量為29.09 kD，理論等電點為8.66。GmEXPB5和GmEXPB7均為穩(wěn)定的親水蛋白且定位于細胞壁中。GmEXPB5和GmEXPB7蛋白均含有一段信號肽序列和一個保守的DPBB_1結構域。（2） GmEXPB5蛋白與鷹嘴豆CaEXPB15蛋白親緣關系最近，GmEXPB7蛋白與密花豆、赤豆和豇豆的EXPB3蛋白有著較近的親緣關系。（3） GmEXPB5和GmEXPB7在大豆根、莖和葉中均有表達且它們在根和葉中的表達量均顯著高于莖中的表達量。（4） GmEXPB5和GmEXPB7在大豆幼苗中可以響應鹽、干旱和低溫脅迫。（5） GmEXPB5啟動子區(qū)域含有2種與逆境相關的順式作用元件（ABRE和ARE）；GmEXPB7啟動子區(qū)域含有5種與逆境相關的順式作用元件（ABRE、ARE、CGTCA-motif、TC-rich repeats和MBS）。綜上所述，GmEXPB5和GmEXPB7能夠參與大豆對非生物脅迫的應答。

關鍵詞： 大豆， 膨脹素， 生物信息學分析， 非生物脅迫， 表達分析

中圖分類號： Q943文獻標識碼： A文章編號： 1000-3142（2024）07-1289-10

Bioinformatics and expression analysis of expansingenes GmEXPB5 and GmEXPB7 in soybean

MA Hongyu1， ZHAI Ying1*， ZHANG Jun2， CHEN Jiongxin1，ZHANG Yong3， MA Tianyi1， LI Shanshan1

（ 1. College of Life Science and Agro-Forestry of Qiqihar University， Qiqihar 161006， Heilongjiang， China; 2. Branch of Animal Husbandryand Veterinary of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Qiqihar 161005， Heilongjiang， China; 3. KeshanBranch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Qiqihar 161606， Heilongjiang， China ）

Abstract： Expansin （EXP） plays an important role in plant response to environmental stress by regulating cell wall relaxation. To explore the role of EXP genes in soybean response to abiotic stress， two soybean EXP genes （GmEXPB5 and GmEXPB7） and their protein sequences were analyzed by bioinformatics， and their expression levels were detected by real-time fluorescent quantitative PCR （qRT-PCR）. The results were as follows： （1） The GmEXPB5 and GmEXPB7 were located on chromosomes 10 and 12 of soybean， and encoded proteins containing 272 and 267 amino acids， respectively. The molecular weight of GmEXPB5 protein was 29.07 kD and the theoretical isoelectric point was 7.51. The molecular weight of GmEXPB7 protein was 29.09 kD and the theoretical isoelectric point was 8.66. Both GmEXPB5 and GmEXPB7 were stable hydrophilic proteins， and localized in the cell wall. Both GmEXPB5 and GmEXPB7 proteins contained a signal peptide sequence and a conserved DPBB_1 structural domain. （2） GmEXPB5 protein had the closest affinity with CaEXPB15 protein of Cicer arietinum， and GmEXPB7 protein was closely related to EXPB3 proteins of Spatholobus suberectus， Vigna angularis and V. unguiculata. （3） GmEXPB5 and GmEXPB7 were expressed in root， stem and leaf of soybean， and their expression levels in root and leaf were significantly higher than those in stem. （4） GmEXPB5 and GmEXPB7 could respond to salt， drought and cold stresses in soybean seedlings. （5） The promoter region of GmEXPB5 contained two types of stress-related cis-elements （ABRE and ARE）. The promoter region of GmEXPB7 contained five types of stress-related cis-elements （ABRE， ARE， CGTCA-motif， TC-rich repeats and MBS）. In conclusion， these results indicate that GmEXPB5 and GmEXPB7 can participate in the response of soybean to abiotic stress.

Key words： soybean （Glycine max）， expansin， bioinformatics analysis， abiotic stress， expression analysis

膨脹素（expansin，EXP）是一種參與改變植物細胞壁發(fā)育過程的非水解活性松弛蛋白，又稱擴展蛋白。EXP于1992年在酸誘導黃瓜下胚軸細胞壁伸長的研究中首次被發(fā)現（McQueen-Mason et al.， 1992）。后續(xù)從植物細胞壁中純化并鑒定出多種EXP，如擬南芥、番茄、煙草和水稻等（張安等，2013）。EXP廣泛存在與植物中，主要包括EXPA（α-expansin）、EXPB（β-expansin）、EXLA（expansin-like A）和EXLB（expansin-like B）4個亞家族（Sampedro & Cosgrove， 2005）。其中，EXPA和EXPB兩個亞家族蛋白數量在植物中占多數，EXPA主要存在于雙子葉植物和非禾本科單子葉植物中，而EXPB則多存在于禾本科單子葉植物中。對于EXLA和EXLB數量的相關研究較少，最初是在水稻和擬南芥中被發(fā)現（徐筱等，2010）。

研究表明，EXP基因在調節(jié)細胞大?。╕in et al.， 2023）、種子萌發(fā)（Yan et al.， 2014）、根伸長（Noh et al.， 2013）、葉生長（Zhou et al.， 2015）、莖節(jié)間伸長（Kuluev et al.， 2014）、氣孔開合（Wei et al.， 2011）、花發(fā)育（Kuluev et al.， 2012）、果實軟化成熟（Brummell et al.， 1999; Jiang et al.， 2019）、營養(yǎng)吸收（Zhou et al.， 2014）和種子產量（Calderini et al.， 2021）等植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。此外，EXP基因參與調控植物非生物脅迫的研究也在逐漸開展。例如：干旱和缺磷條件能夠誘導水稻OsEXPB2基因的表達（文文乙豪，2013）；遭遇鹽脅迫時，玉米抗鹽品種中ZmExpB2、ZmExpB6和ZmExpB8的表達量上調（Geilfus et al.， 2010）；谷子SiEXPB5在干旱脅迫下表達量增加，其異源表達能夠增強轉基因擬南芥的抗旱性（王金榮，2020）；野生大豆GsEXPB1對促進大豆根系生長及耐鹽性的提高起到積極作用（Feng et al.， 2022）；野生大麥HvEXPB7通過促進根毛伸長來增強抗旱性（He et al.， 2015）；過表達小麥TaEXPB23使轉基因煙草抗旱性得到提高（Li et al.， 2011），而TaEXPB7-B則參與轉基因擬南芥對低溫脅迫的耐受性（Feng et al.， 2019）；擬南芥AtEXP3和AtEXP-β1的過表達則提高了轉基因植株對鹽脅迫的敏感性（Kwon et al.， 2008）。

大豆是植物油和蛋白質的主要來源之一，其特殊的固氮能力使其成為輪作系統(tǒng)和間作栽培模式中的高利潤作物（Liu et al.， 2020）。大豆在生長過程中易受高鹽、干旱和低溫等非生物脅迫的危害，它們不僅影響大豆的生長發(fā)育，還影響其產量和品質（蓋鈞鎰，2003; Wang et al.， 2003）。因此，大豆抗逆基因的挖掘對于大豆抗性品種的選育具有十分重要的意義。目前，EXPB基因與植物抗逆性的相關研究大多集中于禾本科作物。大豆中僅發(fā)現GmEXPB2在非生物脅迫環(huán)境下與根系統(tǒng)的形態(tài)建成密切相關（Guo et al.， 2011）。鑒于EXPB基因的研究可能對大豆抗逆性的改良及產量的提高發(fā)揮積極作用，而轉錄因子家族基因的功能又存在冗余性，因此有必要對大豆EXPB家族中的關鍵抗逆基因進行進一步的篩選和鑒定。本研究從大豆EXPB基因家族中選取GmEXPB5和GmEXPB7進行生物信息學分析，并對其在大豆根、莖、葉及非生物脅迫處理下的表達量進行檢測，為大豆EXPB基因抗逆機制的研究及應用提供理論依據。

1材料與方法

1.1 試驗材料

所用試驗材料為黑龍江省西部地區(qū)廣泛種植的耐旱大豆品種‘克山1號’，由黑龍江省農業(yè)科學院克山分院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學分析從NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載大豆GmEXPB5和GmEXPB7的基因編碼序列及蛋白質氨基酸序列；使用在線網站ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）進行蛋白質的基本理化性質分析；利用在線網站PSORT（https：//www.genscript.com/tools/psort）預測蛋白質的亞細胞定位；利用在線網站SMART（https：//smart.embl-heidelberg.de/）分析預測蛋白質序列的保守結構域及所在位置；使用DNAMAN 8軟件進行蛋白質序列比對；利用在線網站MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）預測蛋白質保守基序（Motif）；使用在線數據庫Phytozome（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/blast-search）搜索并下載GmEXPB5和GmEXPB7的啟動子序列，并利用在線軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測GmEXPB5和GmEXPB7啟動子中的順式作用元件；利用MEGA 7軟件構建EXPB蛋白系統(tǒng)進化樹。

1.2.2 大豆幼苗非生物脅迫處理選擇大小一致、飽滿的大豆種子，于2022年10月均勻播撒在盛滿無菌土的介質中，覆膜管理。待種子萌發(fā)，根長至6～8 cm時移入Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)，期間2～3 d更換一次營養(yǎng)液。待幼苗長至第1片三出復葉完全展開時對其分別進行鹽、干旱和低溫脅迫處理。鹽脅迫處理時將幼苗放入NaCl終濃度為 250 mmoL·L-1的營養(yǎng)液中；將幼苗放置在終濃度為20% PEG8000的營養(yǎng)液中模擬干旱脅迫處理；低溫處理時將幼苗放置于4 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。將未經處理的0 h以及脅迫處理后的1、2、5、10、24 h設置為取樣時間點，在每個時間點分別取稱0.1 g第1片三出復葉并于液氮中速凍。此外，分別稱取0.1 g未處理的根和莖于液氮中速凍。所取樣品材料均保存在-80 ℃超低溫冰箱中。

1.2.3 RNA的提取及cDNA合成利用TaKaRa公司的RNAiso Plus試劑分別提取上述各樣本的總RNA；使用Innovagene公司的反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈，-20 ℃凍存。

1.2.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）利用Primer Premier 5.0軟件，根據GmEXPB5和GmEXPB7的cDNA序列設計qRT-PCR引物。qRT-PCR內參基因選取大豆Gmβ-Tubulin基因（Qiu et al.， 2020）。3對qRT-PCR引物序列如表1所示，引物由長春生工生物公司合成。以各樣品的cDNA為模版，使用Innovagene公司的2×Taq SYBR Green qPCR Mix試劑盒，在BIO-RAD CFX96 Real-Time PCR儀上，對GmEXPB5和GmEXPB7在根、莖、葉及非生物脅迫下的表達量進行qRT-PCR檢測。qRT-PCR的程序設置和體系參照Qiu等（2020），所有處理均采用3次重復，以2-ΔΔCt法計算GmEXPB5和GmEXPB7的基因相對表達量。

2結果與分析

2.1 GmEXPB5和GmEXPB7基因及蛋白序列分析

2.1.1 GmEXPB5和GmEXPB7基本理化性質分析從NCBI數據庫中獲取兩個功能未被鑒定的大豆EXPB基因，即GmEXPB5（GenBank登錄號：NM001261433）和GmEXPB7（GenBank登錄號：NM001267069）。如表2所示，GmEXPB5和GmEXPB7基因分別位于大豆第10號和第12號染色體上， 編碼的蛋白序列長度分別為272和267個氨基酸。GmEXPB5蛋白分子量為29.07 kD，理論等電點為7.51；GmEXPB7蛋白分子量為29.09 kD，理論等電點為8.66。GmEXPB5和GmEXPB7蛋白的不穩(wěn)定系數均小于40，親水性指數均為負值，表明它們均為穩(wěn)定的親水蛋白。亞細胞定位預測結果顯示，GmEXPB5和GmEXPB7蛋白均定位于細胞壁中。

2.1.2 GmEXPB5和GmEXPB7蛋白保守結構域及保守基序（Motif）分析GmEXPB5和GmEXPB7蛋白的氨基酸序列如圖1所示，它們的同源性為45.79%。在GmEXPB5和GmEXPB7蛋白序列的N端均含有一段信號肽序列［GmEXPB5（第1到第29 位氨基酸）；GmEXPB7（第1到第31位氨基酸）］，它們能夠引導EXPB蛋白定位于細胞壁。此外，GmEXPB5和GmEXPB7蛋白均含有一個保守的由81個氨基酸殘基組成的DPBB_1結構域［GmEXPB5（第83到第163位氨基酸）；GmEXPB7（第78到第158位氨基酸）］，此結構域是EXP家族蛋白的共有結構域。

蛋白保守基序（Motif）分析結果如圖2所示，GmEXPB5和GmEXPB7蛋白共含有10個Motif。其中，Motif 3、Motif 1、Motif 5、Motif 2、Motif 7和Motif 4為GmEXPB5和GmEXPB7蛋白共有，并且它們在兩個蛋白序列中的分布位置和順序基本相同；Motif 10和Motif 9為GmEXPB5蛋白所特有，它們位于GmEXPB5蛋白序列N端；Motif 8和Motif 6為GmEXPB7蛋白所特有，它們同樣也位于GmEXPB7蛋白序列N端。

2.1.3 植物EXPB蛋白系統(tǒng)進化分析將16種植物中的36個EXPB蛋白構建系統(tǒng)進化樹。由圖3可知，GmEXPB5蛋白與鷹嘴豆CaEXPB15蛋白親緣關系最近，GmEXPB7蛋白則與密花豆、赤豆和豇豆的EXPB3蛋白有著較高的親緣關系。此外，除擬南芥外其他雙子葉植物EXPB1蛋白均處于同一分支，說明同一基因在不同物種中仍具有較高同源性，但相同植物中的EXPB蛋白則存在較大差異，如GmEXPB5蛋白和GmEXPB7蛋白親緣關系較遠。

2.2 GmEXPB5和GmEXPB7在大豆根、莖和葉中的表達分析

qRT-PCR結果（圖4）顯示，GmEXPB5和GmEXPB7在大豆根、莖和葉中均有表達，但它們在根和葉中的表達量顯著高于莖中的表達量。

2.3 GmEXPB5和GmEXPB7非生物脅迫表達分析

對大豆幼苗分別進行鹽、干旱和低溫脅迫處理。qRT-PCR檢測結果如圖5所示，鹽脅迫處理后，GmEXPB5的表達量先升高，處理1 h時達到最大值，為對照0 h表達量的6.9倍，之后下降，處理24 h時與對照0 h時的表達量已無明顯差異；GmEXPB7的表達量在處理后的1、5、24 h時均顯著高于對照0 h時的表達量且24 h時的表達量達到最大值，為對照0 h表達量的14.2倍。干旱脅迫處理后，GmEXPB5和GmEXPB7的表達量均存在先降低后升高的趨勢，處理24 h時GmEXPB5和GmEXPB7的表達量均達到最大值，分別為對照0 h表達量的3.9倍和5.6倍。低溫脅迫處理后，GmEXPB5和GmEXPB7的表達量均下降，顯著低于對照0 h時的表達量。由以上結果推測，GmEXPB5和GmEXPB7均可以參與大豆幼苗對非生物脅迫的應答。

2.4 GmEXPB5和GmEXPB7啟動子順式作用元件預測分析

對GmEXPB5和GmEXPB7基因起始密碼子ATG上游2 000 bp的啟動子序列中潛在的逆境相關順式作用元件進行預測分析。結果如表3所示，GmEXPB5的啟動子區(qū)域含有2種與逆境有關的順式作用元件，分別是2個脫落酸響應元件（ABRE）和3個厭氧誘導元件（ARE）；GmEXPB7的啟動子區(qū)域含有5種與逆境有關的順式作用元件，分別是4個脫落酸響應元件（ABRE）、3個厭氧誘導元件（ARE）、1個茉莉酸甲酯響應元件（CGTCA-motif）、1個防御和脅迫響應元件（TC-rich repeats）以及1個干旱誘導的MYB轉錄因子結合位點（MBS）。

3討論與結論

細胞壁是植物響應和防御外界環(huán)境脅迫的首道屏障，細胞壁結構和組成的改變是植物適應外界環(huán)境脅迫的重要機制之一。EXP作為一種酶蛋白能夠以非水解的方式作用于細胞壁，在不改變細胞壁共價結構的同時打斷多糖間交聯(lián)的氫鍵，從而增加細胞壁的柔韌性，促進細胞的生長和伸長（Feng et al.， 2019）。因此，EXP可以通過重塑細胞壁的結構來協(xié)助植物抵御外界的不利環(huán)境條件（Lü et al.， 2013; Li et al.， 2015）。Zhu等（2014）發(fā)現大豆中存在9個EXPB基因， 本研究對其中的GmEXPB5和GmEXPB7進行了生物信息學分析。在GmEXPB5和GmEXPB7蛋白序列N端均預測到信號肽序列，同樣亞細胞定位預測結果也顯示它們定位在細胞壁中，這與大多數已報道的EXPB蛋白屬于細胞壁蛋白這一結論相吻合（Choi et al.， 2008）。但是，本研究中的亞細胞定位結果僅為軟件預測，在后續(xù)的基因功能研究中應選擇合適的表達系統(tǒng)進行實驗驗證。蛋白系統(tǒng)進化分析結果顯示，盡管GmEXPB5蛋白和GmEXPB7蛋白的親緣關系并不近，但與它們各自親緣關系較近的EXPB蛋白仍來自豆科植物。

前人研究發(fā)現，部分EXP基因在植物中的表達具有一定的組織特異性。例如：水稻OsEXPB5和大麥HvEXPB1在根毛中特異性表達（Won et al.， 2010）；小麥EXP基因在不同組織器官中也存在差異表達且具有表達偏好性，在根中的表達量普遍較高（Han et al.， 2019）；煙草NtabEXPA12則主要在葉片中表達，可能參與煙葉生長發(fā)育的調控（丁安明等，2021）。在本研究中，盡管GmEXPB5和GmEXPB7的表達不具有組織特異性，但它們在根和葉中的表達量仍顯著高于莖中的表達量，推測GmEXPB5和GmEXPB7在大豆的根、葉以及莖中均能夠發(fā)揮轉錄調控作用。

GmEXPB5和GmEXPB7可以參與大豆幼苗對非生物脅迫的應答，但它們的轉錄對鹽、干旱和低溫脅迫的響應不同?？傮w而言，鹽和干旱脅迫可以誘導GmEXPB5和GmEXPB7的表達，但低溫脅迫則抑制了GmEXPB5和GmEXPB7的表達。馮珊珊等（2020）推測，TaEXPB12-A/B/D基因在低溫脅迫下表達量的下降可能是為了通過減少根的表面積來減少低溫脅迫所造成的傷害，而干旱脅迫下基因表達量的升高可能是植物為了增強吸水能力而促進根毛生長的緣故。Han等（2019）推測，小麥EXP基因在鹽脅迫下的上調表達還可能在維持細胞內Na+和K+的平衡起重要作用。由此可以預見，GmEXPB5和GmEXPB7可能在大豆抗鹽和抗旱基因工程育種中存在潛在的應用價值。Han等（2019）報道，不同EXP基因亞家族之間存在較大的結構差異，但同一亞家族內EXP基因具有較高的保守性，結構比較相似。盡管本研究中GmEXPB5蛋白和GmEXPB7蛋白的親緣關系較遠，但它們的組織表達模式和非生物脅迫表達模式總體來說仍比較類似，由此推測它們在功能上可能也存在一定的相似性。當然，同一基因在植物不同組織中執(zhí)行的功能也并不完全相同，其轉錄水平的差異也并不一定代表其發(fā)揮作用的大?。‵eng et al.， 2022）。

基因的表達調控與基因啟動子中的順式作用元件密切相關（Lu et al.， 2018）。GmEXPB5和GmEXPB7的基因表達均受非生物脅迫的調控，于是我們對它們啟動子中逆境相關的順式作用元件進行預測分析，所得結果與預期相符，GmEXPB5和GmEXPB7的啟動子區(qū)域均含有多個激素和逆境響應相關的順式作用元件。楊瑞瑞等（2022）研究表明，脫落酸和茉莉酸等植物激素及其信號轉導途徑在環(huán)境脅迫過程中均起重要作用。GmEXPB5和GmEXPB7啟動子中脫落酸和茉莉酸甲酯響應元件的存在表明它們可能通過響應一種或多種激素參與大豆對逆境脅迫的應答。鹽和干旱脅迫能夠顯著誘導小麥部分EXP基因的表達也與它們啟動子區(qū)含有數量不等的逆境相關順式元件有關（Han et al.， 2019）。預測分析結果顯示，GmEXPB7啟動子中逆境響應元件的種類及數量均大于GmEXPB5啟動子，推測這是導致GmEXPB7對鹽和干旱脅迫的響應程度強于GmEXPB5的原因。

綜上所述，GmEXPB5和GmEXPB7均能參與大豆對非生物脅迫的應答，本研究為GmEXPB5和GmEXPB7基因的后續(xù)功能研究提供了理論依據。此外，大豆EXP基因家族成員眾多，后續(xù)也有必要對其他基因的功能進行深入的挖掘和研究。

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（責任編輯周翠鳴）