代謝組與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合解析赤皮青岡葉片黃化變異機制

摘要： 為揭示赤皮青岡葉色黃化變異機制，該研究以赤皮青岡葉色變異植株和正常植株的葉片為試驗材料，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和高通量RNA測序技術(shù)分別進(jìn)行代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果表明：（1）代謝組在正離子（POS）、負(fù)離子（NEG）模式下分別檢測出正常植株和突變體之間存在257個和357個顯著差異代謝物（SCMs），其中槲皮素、白矢車菊素、楊梅素等多種黃酮類化合物及其糖苷衍生物（吡喃酮啡肽A、異鼠李素3-葡糖苷酸等）在突變體中顯著上調(diào)，而葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素等色素含量則顯著下降。（2）轉(zhuǎn)錄組測序檢測出4 146個差異表達(dá)基因（DEGs），其中1 711個基因上調(diào)表達(dá)，2 435個基因下調(diào)表達(dá)。（3）KEGG富集分析表明，SCMs和DEGs顯著富集到光合作用、卟啉與葉綠素代謝、類黃酮生物合成等途徑。綜上表明，突變體葉色黃化可能是受到葉綠素合成受阻、葉綠體發(fā)育異常及黃酮物質(zhì)合成增加等因素的綜合影響。此外，MYB和bHLH家族基因在突變體中顯著上調(diào)，證實該兩類轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控類黃酮生物合成。該研究結(jié)果為植物黃化突變的分子機制研究提供了新的見解，也為葉色功能基因挖掘與園林植物育種工作提供了參考。

關(guān)鍵詞： 赤皮青岡， 葉色突變體， 黃化， 代謝組， 轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號： Q943文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A文章編號： 1000-3142（2024）07-1319-18

Combined metabolome and transcriptome analysesreveal the mechanism of etiolated mutantleaves of Quercus gilva

LIN Li1， HE Yueqiu1， WANG Hao2， LU Yunfeng2， WANG Jianjun2， HUANG Huahong3

（ 1. School of Landscape Ecology， Ningbo City College of Vocational Technology， Ningbo 315199， Zhejiang， China; 2. Ningbo Agricultural TechnologyPromotion Station， Ningbo 315100， Zhejiang， China; 3. Zhejiang Agriculture and Forestry University， Hangzhou 311300， China ）

Abstract： In order to reveal the etiolation mechanism of gold-coloured mutant leaves of Quercus gilva， a naturally-occurring leaf-color mutant was used as experimental materials， and the metabolome and transcriptome of mutant leaves and normal green leaves were analyzed by ultra-high performance liquid chromatography-Q （UHPLC-Q） Exactive HF-X and high-throughput RNA sequencing， respectively. The results were as follows： （1） A total of 257 and 357 significantly changed metabolites （SCMs） were respectively identified under the positive ion （POS） mode and the negative ion （NEG） mode. Compared with green leaves， the content of some flavonoids such as quercetin， leucocyanidin， myricetin and their glucoside derivatives （pyranodelphinin A， isorhamnetin 3-glucuronide， etc. ） increased significantly in mutant leaves， but the content of chlorophyll a， chlorophyll b， and carotenoids decreased significantly. （ 2 ） A total of 4 146 differentially expressed genes （DEGs） were detected， of which 1 711 were up-regulated and 2 435 were down-regulated. （ 3 ） KEGG enrichment analysis showed that SCMs and DEGs were mainly enriched in photosynthesis， porphyrin and chlorophyll metabolism， and flavonoid biosynthesis. In conclusion， the inhibition of chlorophyll synthesis， chloroplast developmental abnormalities and promotion of flavonoid synthesis were the main factors driving the leaf etiolation in the mutant Q. gilva. In addition， the genes of the MYB and bHLH families were significantly up-regulated in mutant leaves， confirming these two types of transcription factors were involved in regulating flavonoid biosynthesis. This study provides new molecular insights for the phenomenon of leaf etiolation， and also provides the reference for exploring leaf color-related functional genes and breeding of landscape plant.

Key words： Quercus gilva， leaf-color mutant， etiolation， metabolome， transcriptome

葉色突變是指植物在生長發(fā)育過程中發(fā)生的葉色變化現(xiàn)象（劉新亮等，2017）。葉色突變易于鑒別，Gustafsson最早將其分為條紋、斑點、淺綠、黃化和白化5類（Gustafsson，1942），此后Manjaya 和 Nandanwar（2007）又進(jìn)一步細(xì)分出黃綠、紫葉、類病斑等類型。黃化是其中一種重要的突變類型，黃化突變體常被用于植物光合生理（張晨禹等，2019）、葉綠體超微結(jié)構(gòu)（李淑培等，2023）、葉綠素生物合成（Zhu et al.，2014）等研究。此外，黃化突變在育種領(lǐng)域也有重要應(yīng)用，許多“金葉”類園林植物品種都來自黃化突變，如‘金葉國槐’（Sophora japonica ‘Aurea’），‘中華金葉榆’（Ulmus pumila ‘Jinye’），‘金葉雞爪槭’（Acer palmatum ‘Aurea’）等。目前，有關(guān)植物葉色黃化的研究集中于少數(shù)模式植物和一些重要的農(nóng)作物，比如擬南芥（Arabidopsis thaliana），水稻（Oryza sativa），黃瓜（Cucumis sativus）等（Li et al.，2012；Maekawa et al.，2015；熊興偉等，2023）。在園林植物中，僅在黃山欒樹（Koelreuteria bipinnata var. integrifoliola）（Lyu et al.， 2017），銀杏（Ginkgo biloba）（Li et al.， 2019），雜交構(gòu)樹（Broussonetia kazinoki × B. papyrifera）（Wang et al.， 2022）等少數(shù)植物中有過報道。

近年來，高通量測序技術(shù)被廣泛用于生物組學(xué)研究，能夠從分子層面揭示生物現(xiàn)象和生物過程的發(fā)生機制（熊興偉等，2023）。并且，通過多組學(xué)的聯(lián)合應(yīng)用，可以更加直觀地反映機體的變化水平，為生物體靜態(tài)和動態(tài)的變化提供更為深入和廣闊的研究視野（陸小雨等，2020）。Lyu等（2017）通過高通量測序技術(shù)，從黃山欒樹品種‘金焰彩欒’（Koelreuteria bipinnata var. integrifoliola ‘Jinyan’）中檢測出9個葉綠素代謝和14個類胡蘿卜素生物合成的關(guān)鍵基因。Wang等（2022）采用多組學(xué)方法對雜交構(gòu)樹的黃葉突變體進(jìn)行研究，揭示了金黃葉色表型的形成與光合色素的含量與比例變化以及葉綠體結(jié)構(gòu)和功能缺陷有關(guān)。Yamashita等（2021）對茶樹黃化品種（Camellia sinensis ‘Koganemidori’）的葉綠素代謝和氨基酸積累機制進(jìn)行了探究，表明供試品種的黃化表型是由于葉綠體發(fā)育和葉綠素合成相關(guān)基因缺乏所致，高氨基酸則源于代謝相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)所引起的廣泛蛋白質(zhì)降解。Luo等（2022）采用轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)用技術(shù)，揭示了甘蔗葉色黃化現(xiàn)象與葉綠素合成途徑減少、光合基因表達(dá)下降、金屬離子調(diào)控功能障礙以及次生代謝物質(zhì)改變等因素有關(guān)?？偠灾?，植物葉色黃化與葉綠素代謝相關(guān)基因的突變或表達(dá)受阻有重要關(guān)系。此外，葉色黃化也會受到花青素、類胡蘿卜素等其他色素代謝變化的綜合作用（林馨穎等，2022）。

赤皮青岡（Quercus gilva）為殼斗科（Fagaceae）櫟屬（Quercus）常綠喬木，主要分布于我國南方海拔300～1 500 m的山林地帶（中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會，1998）。其木材質(zhì)地堅硬，紋理細(xì)膩，是優(yōu)良的硬木用材樹種，也可用于低山丘陵混交造林、林下補植和園林綠化（歐陽澤怡等，2021；秦之曠等，2023）。本研究團隊于2016年在寧波海曙溪下育苗基地發(fā)現(xiàn)一株赤皮青岡播種變異株，其成熟葉片為黃色，新葉金黃色，枝干明黃色，并于2018年底通過嫁接繁殖多株材料，其特異性狀已連續(xù)4年表現(xiàn)穩(wěn)定。本研究以赤皮青岡黃化突變植株和正常植株的葉片為研究材料，采用代謝組和轉(zhuǎn)錄學(xué)聯(lián)用技術(shù)同時結(jié)合生理生化測定，擬探討：（1）赤皮青岡變異植株金黃葉色表型形成的生理機制；（2）變異植株葉色黃化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。本研究可為金葉系園林植物的選育和遺傳改良提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗材料

以赤皮青岡黃化（突變體）植株（yellow leaf，YL）和正常植株（no yellow leaf，NYL）為研究材料，兩種材料均種植于寧波市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站林特基地（121°42′24″ E、29°48′46″ N）。2021年8月采集兩種植株葉片樣品（圖1），置于液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 代謝組分析

1.2.1 代謝物提取稱取50 mg樣品至離心管，加入400 μL的甲醇∶乙腈（V/V=1∶1，含內(nèi)標(biāo)）提取液。用冷凍組織研磨儀（Wonbio-96c，上海萬柏生物科技有限公司）進(jìn)行研磨，提取液靜置后在4 ℃條件下13 000 g離心15 min，之后取上清液進(jìn)行上機分析。YL組和NYL組各設(shè)置6個生物學(xué)重復(fù)。每個樣品取20 μL上清液，混合后用于質(zhì)控分析。

1.2.2 代謝物檢測利用Thermo Fisher Scientific超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UHPLC）串聯(lián)傅里葉變換質(zhì)譜（Q Exactive HF-X）進(jìn)行LC-MS分析。色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm；Waters，USA）。液相條件：流動相A為95%水 + 5%乙腈（含0.1%甲酸），流動相B為47.5%乙腈 + 47.5%異丙醇 + 5%水（含0.1%甲酸）。洗脫梯度如下。正離子模式：0 min，A/B（V/V）為100∶0；3.0 min，為80∶20；4.5 min，為65∶35；5.0 min，為0∶100；6.3 min，為0∶100；6.4 min，為100∶0；8.0 min，為100∶0。負(fù)離子模式：0 min，A/B（V/V）為100∶0；1.5 min，為95∶5；2.0 min，為90∶10；4.5 min，為70∶30；5.0 min，為0∶100；6.3 min，為100∶0；6.4 min，為100∶0；8.0 min，為100∶0。柱溫40 ℃；進(jìn)樣量3 μL；流速0.4 mL·min-1。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），噴霧電壓3 500 Ｖ（正模式）和-3 500 Ｖ（負(fù)模式）；加熱溫度425 ℃；毛細(xì)管溫度325 ℃；鞘氣流速50 Arb；輔助氣流速13 Arb；掃描范圍70 ～ 1 050 m/z；一級分辨率60 000；二級分辨率7 500；碰撞能分別為20、40、60 eV；采用質(zhì)譜連續(xù)掃描采集數(shù)據(jù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis v2.2軟件（Waters，USA），通過與HMDB、METLIN等代謝數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對鑒定代謝物。利用R軟件包進(jìn)行代謝組數(shù)據(jù)分析和熱圖制作，對兩組樣品進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），得到模型的變量權(quán)重值（variable important in projection，VIP），以VIP > 1，P<0.05且FC（fold change）>1.10或FC < 0.91為標(biāo)準(zhǔn)篩選組間的顯著差異代謝物（significantly changed metabolites，SCMs），通過與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝途徑富集。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序與數(shù)據(jù)處理

1.3.1 轉(zhuǎn)錄組測序及文庫構(gòu)建采集YL和NYL的新鮮葉片，參考陸小雨等（2020）方法進(jìn)行RNA提取和質(zhì)控處理。采用TruseqTM RNA sample prep Kit（Illumina）的方法構(gòu)建文庫。用帶Oligo（dT）的磁珠分離mRNA；將mRNA隨機打斷，在SMART逆轉(zhuǎn)錄酶（SMARTScribeTM Reverse Transcriptase）作用下合成cDNA第1條鏈，利用RNaseH將RNA鏈降解，合成cDNA第2條鏈；通過End-Repair Mix將雙鏈cDNA補齊，其3′末端加A處理后連接測序接頭；將cDNA進(jìn)行PCR富集，利用AMPure XP beads純化產(chǎn)物；經(jīng)過TBS-380（Picogreen）定量，按數(shù)據(jù)比例混合上機；測序時通過cBot平臺完成橋式PCR擴增，生成簇（clusters），利用IIlumina Noveseq 6000平臺完成轉(zhuǎn)錄組測序，構(gòu)建Illumina PE文庫（讀長2 bp × 150 bp）。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理將測序得到的圖像信號經(jīng)CASAVA堿基識別轉(zhuǎn)換為原始數(shù)據(jù)（raw data），經(jīng)過質(zhì)控獲得高質(zhì)量的干凈數(shù)據(jù)（clean data）。采用無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析，通過Trinity v2.8.5軟件（Grabherr et al.， 2011）將Clean reads拼接成重疊群（contig）和單一序列（singleton）。此后，利用TransRate v1.0.3（Smith-unna et al.， 2016）和CD-hit v4.5.7（Li & Godzik，2006）對初始組裝序列進(jìn)行優(yōu)化過濾，并利用BUSCO v3.0.2軟件（Simo et al.， 2015）再次評估，得到后續(xù)分析的最終轉(zhuǎn)錄本。

將轉(zhuǎn)錄本與6大數(shù)據(jù)庫（NR、Swiss-Prot、Pfam、eggNOG、GO和KEGG）比對以獲取注釋信息。通過RSEM v1.3.1軟件（Li & Pewey， 2011）計算基因的TPM值（transcripts per million reads，每百萬讀段中來自于某轉(zhuǎn)錄本的讀段數(shù)），利用DESeq2 v1.24.0軟件（Michael et al.， 2014）篩選2個組的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），將閾值差異倍數(shù)FC ≥ 2且修正P值（P adjust）< 0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。以P adjust < 0.05為標(biāo)準(zhǔn)，采用Goatools v0.6.5軟件（Klopfenstein et al.， 2018）進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，篩選參與葉色變化的關(guān)鍵基因。

1.3.3 代謝物與基因相關(guān)性分析采用Prism 8.0（GraphPad，USA）軟件進(jìn)行SCMs與DEGs的皮爾森（Pearson）相關(guān)性分析。以相關(guān)性系數(shù)|r| ≥ 0.8且P < 0.05為閾值，得到SCMs與DEGs的分子間相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)。

1.3.4 RT-qPCR驗證選用8個DEGs進(jìn)行RT-qPCR來檢驗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計PCR引物（表1）。以CACs（Accession number：ID6728500）為內(nèi)參基因（Marum et al.， 2012）。設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。將熒光定量表達(dá)水平進(jìn)行Log2轉(zhuǎn)換，與對應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)豐度進(jìn)行比較。

1.4 葉綠素含量測定

取YL和NYL的新鮮葉片，經(jīng)過稱量、研磨和過濾后，參照張麗霞等（2021）的方法來測定兩組葉片中的葉綠素含量。設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.5 光合參數(shù)測定

采用CI-340便攜式光合作用測定儀（CID，USA）對YL突變體和NYL植株葉片的凈光合作用、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率等光合參數(shù)進(jìn)行測定。設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

2結(jié)果與分析

2.1 代謝組測序結(jié)果與分析

2.1.1 代謝組的多元統(tǒng)計分析對YL和NYL兩組樣本在正、負(fù)離子模式下的UHPLC-Q Exactive HF-X數(shù)據(jù)進(jìn)行代謝物組成的多元統(tǒng)計分析。PCA分析結(jié)果顯示，正離子模式下第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）分別占總變量的40.60%和19.10%，負(fù)離子模式下第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）分別占總變量的37.30%和24.10%（圖2：A，B）。OPLS-DA分析結(jié)果（圖2：C，D）顯示，兩種離子模式下差異代謝物R2值均高于Q2值，并且Q2與Y軸截距小于0，說明樣本數(shù)據(jù)描述良好。

在正、負(fù)離子模式下共鑒定出614個SCMs，其中，正離子模式下257個，上調(diào)的有148個，下調(diào)的有109個，負(fù)離子模式下357個，上調(diào)的有147個，下調(diào)的有210個（圖2：E，F(xiàn)）。

2.1.2 主要的SCMs分析從614個SCMs中篩選出相對含量前30的差異代謝物。由表2可知，黃酮類化合物有9種，均在YL組表達(dá)上調(diào)，以吡喃酮啡肽A上調(diào)最為顯著，上調(diào)了2.28倍，槲皮素3-O-（6″-乙酰葡萄糖苷）也上調(diào)了1.55倍；5種核苷及其衍生物在YL中有差異積累，其中2種嘧啶核苷顯著上調(diào)，3種嘌呤核苷顯著下調(diào)；9種脂類代謝物中，有5種在YL中上調(diào)，主要為異戊烯醇脂類；2種有機酸中，1種顯著上調(diào)，另1種顯著下調(diào)。

2.1.3 SCMs的KEGG通路分析將YL和NYL的SCMs進(jìn)行KEGG富集分析，共富集到66條通路，主要包含甘油磷脂代謝、輔助因子生物合成、類黃酮生物合成、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、異黃酮生物合成、氨基糖和核苷酸糖代謝等13條代謝通路（圖3）。其中，黃酮類生物合成富集的SCMs最多，包括類黃酮生物合成富集12個、異黃酮生物合成富集7個、黃酮和黃酮醇生物合成富集4個，說明黃酮類物質(zhì)可能與YL葉色黃化有關(guān)。此外，甘油磷脂代謝、輔酶合成代謝、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、氨基糖和核苷酸糖代謝、苯丙烷生物合成分別富集了17、12、7、6、4個代謝物。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與分析

2.2.1測序質(zhì)量分析對NYL和YL材料的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，質(zhì)控后共獲得44.26 Gb干凈數(shù)據(jù)（clean data）（表3）。各樣品的干凈序列（clean read）條數(shù)在43 864 122和56 594 944之間，Q20值在97.61%和97.79%之間，Q30值在93.03%和93.49%之間，GC堿基占比在44.49%～44.99%之間，滿足于后續(xù)分析要求。

2.2.2 差異表達(dá)基因統(tǒng)計從YL和NYL的樣品中分別鑒定了46 391個和48 018個表達(dá)基因，其中16 699個和15 072個基因分別在YL和NYL中特異表達(dá)（圖4：A）。以NYL為對照組，在YL中共檢測到4 146個DEGs，其中1 711個上調(diào)，2 435個下調(diào)（圖4：B）。

2.2.3 DEGs的GO功能分析GO分析表明，YL和NYL的3 612個DEGs（P < 0.05）顯著富集到12個生物學(xué)過程、14個細(xì)胞組分和2個分子功能條目（圖5）。在生物學(xué)過程中，富集基因最多的是前體代謝產(chǎn)物和能量產(chǎn)生，其次為光合作用、色素生物合成過程、色素代謝過程、卟啉化合物生物合成過程等，涉及過程多與光合作用或葉綠素合成有關(guān)，以下調(diào)基因為主，也有少數(shù)與磷酸脫氫酶、質(zhì)體丙酮酸激酶、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶及二氫黃酮醇還原酶相關(guān)的代謝途徑發(fā)生了不同程度上調(diào)。在細(xì)胞組分中，富集最多的GO條目是質(zhì)體和葉綠體，其次為類囊體膜、光合膜、葉綠體類囊體膜等，均以下調(diào)基因的數(shù)目較多。在分子功能中，存在顯著差異的代謝途徑最少，僅有四吡咯結(jié)合和葉綠素結(jié)合，均以下調(diào)基因居多，其中葉綠素結(jié)合途徑當(dāng)中的下調(diào)基因占總數(shù)的90%以上。GO功能富集分析表明，YL的葉色黃化突變與光合作用、葉綠素代謝等過程有密切關(guān)系。

2.2.4 差異代謝途徑的KEGG富集分析KEGG富集分析結(jié)果顯示，共有744條DEGs被注釋到KEGG通路，其中192條基因顯著富集到植物-病原體相互作用、光合作用、乙醛酸及二羧酸代謝等

12個過程（表4）。與光合作用相關(guān)的途徑有5種，具體如下：光合作用-天線蛋白質(zhì)富集因子最高，為0.666 7，該通路注釋到10個基因，全部為捕光葉綠素蛋白復(fù)合體（light-harvesting chlorophyll protein complex，LHC）編碼基因；富集到光合作用的基因有23個，主要涉及光系統(tǒng)的反應(yīng)中心復(fù)合物（reaction-center complex，RCC）；富集到光合生物碳固定途徑的有16個，包括磷酸丙糖異構(gòu)酶（triosephosphate isomerase，TIM）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPA）等關(guān)鍵酶的編碼基因；富集到卟啉和葉綠素代謝的有12個；富集到乙醛酸及二羧酸代謝的有22個基因。此外，一些DEGs也參與了類黃酮生物合成、花青素生物合成、氨基酸代謝、苯丙烷生物合成等途徑。

2.2.5 差異轉(zhuǎn)錄因子鑒定與分析轉(zhuǎn)錄因子因與功能基因調(diào)控區(qū)域結(jié)合而影響基因表達(dá)，進(jìn)而會對許多生物學(xué)過程產(chǎn)生影響（劉玉飛等，2022）。

對4 146個DEGs中的轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行鑒定，共篩得39個轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因，屬于15個家族（圖6）。其中，差異基因數(shù)目最多的是MYB家族（8個DEGs），AP2/ERF和bHLH次之，分別有5個和4個，WRKY、bZIP和SBP則都有3個。15個轉(zhuǎn)錄因子家族中， WRKY、GRAS、AP2/ERF和C2H2以下調(diào)基因居多，其他則以上調(diào)為主。

2.2.6 DEGs的RT-qPCR驗證分析選取8個DEGs進(jìn)行qPCR驗證，結(jié)果（圖7）表明，熒光定量表達(dá)與轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)的變化趨勢一致，證實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。

2.3 YL的DEGs和SCMs關(guān)聯(lián)分析

2.3.1 色素代謝相關(guān)DEGs和SCMs的關(guān)聯(lián)分析植物葉片顏色主要由葉綠素、類胡蘿卜素、花青素等植物色素決定（林馨穎等，2022）。通過測定赤皮青岡YL和NYL的葉綠素和類胡蘿卜素含量，發(fā)現(xiàn)YL中葉綠素a（0.35 mg·g-1）、葉綠素b（0.31 mg·g-1）、總?cè)~綠素（0.66 mg·g-1）以及類胡蘿卜素（0.05 mg·g-1）的含量都較NYL（分別為2.38、1.49、3.87、0.44 mg·g-1）顯著下降。此外，葉綠素a/b的比值也顯著降低（圖8），表明YL可能受到環(huán)境脅迫（Sun et al.， 2022）。該比值的變化會造成葉綠素a對不同波長吸收的改變，進(jìn)而對葉色產(chǎn)生影響（李麗菁等，2022）。

在葉綠素合成途徑中，谷氨酸-tRNA還原酶（glutamyl-tRNA reductase，HemA）、尿卟啉原脫羧酶（uroporphyrinogen decarboxylase，HemE）、原卟啉原氧化酶（protoporphyrinogen oxidase，HemF）、原葉綠素酸酯氧化還原酶（protochlorophyllide oxidoreductase，POR）等9種酶的相關(guān)DEGs都出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，其中編碼HemE的基因下降80%（4/5），編碼POR的2個基因表達(dá)量下調(diào)超過66.7%（2/3），編碼HemA、HemB（δ-aminolevulinic acid dehydratase）、DVR（divinyl protochlorophyllide a 8-vinyl-reductase）和ChlI（Mg-chelatase subunit ChlI-1）的基因表達(dá)下調(diào)都均約50%（圖9：A）。

類胡蘿卜素也是參與植物光合作用的主要色素之一。YL中類胡蘿卜素含量［（0.056 1±0.008 9）mg·g-1］較NYL（0.441 5±0.083 0 mg·g-1）顯著減少。在類胡蘿卜素生物合成途徑中（圖9：B），八氫番茄紅素合酶（phytoene synthase，PSY）是該途徑的第1個合成酶，編碼該酶基因的表達(dá)量下降了80%（4/5），其顯著下調(diào)會對后續(xù)通路產(chǎn)生重要影響。番茄紅素ε環(huán)化酶（lycopene ε-cyclase，LCYE）是葉黃素代謝途徑中的關(guān)鍵酶，催化線性的番茄紅素環(huán)化形成胡蘿卜素，再進(jìn)一步合成葉黃素。LCYE基因的表達(dá)量也出現(xiàn)顯著下降，下調(diào)約80%（4/5），會對葉黃素生物合成產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響突變體的葉色表現(xiàn)。

類黃酮合成的起始代謝物為對香豆酰輔酶A（p-coumaroyl-CoA），通過苯丙烷生物合成途徑產(chǎn)生。在YL組中，編碼4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumarate-CoA ligase）的基因 4CL表達(dá)上調(diào)（圖9：C），但并未對香豆酰輔酶A的含量形成顯著影響。在類黃酮生物合成初期階段，編碼查爾酮合酶（chalcone synthase，CHS）和查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）的基因表達(dá)顯著上調(diào)，導(dǎo)致柚皮素查爾酮（naringenin chalcone）和柚皮素（naringenin）在YL中積累增多（FC = 1.05）。在此后的步驟中，許多關(guān)鍵酶的基因表達(dá)水平也顯著上調(diào)，其中黃酮醇合酶（flavonol synthase，F(xiàn)LS）的基因表達(dá)量上調(diào)了6.98倍，類黃酮3′-單加氧酶（flavonoid 3′-monooxygenase，F(xiàn)3′H）的基因表達(dá)上調(diào)了5.77倍，二氫黃酮醇-4-還原酶（dihydrofla-vonol-4-reductase，DFR）的基因表達(dá)水平也顯著上調(diào)了4.44倍。這些基因的表達(dá)上調(diào)，與YL中槲皮素（quercetin）、白矢車菊素（leucocyanidin）、楊梅素 （myricetin） 在內(nèi)的多種黃酮類化合物的積累具有較強的相關(guān)性（|r| ≥ 0.8）（圖9：D；圖10）。

2.3.2 光合作用相關(guān)DEGs和SCMs的關(guān)聯(lián)分析在光合作用途徑中，共有28個編碼PS I、PS Ⅱ和LHC核心蛋白的DEGs表達(dá)水平發(fā)生變化（圖11）。其中，與PS I反應(yīng)中心相關(guān)的8個DEGs，都在YL中表現(xiàn)下調(diào)。與PS Ⅱ反應(yīng)中心相關(guān)的10個DEGs，只有編碼PS Ⅱ反應(yīng)中心D1蛋白（photosystem Ⅱ P680 reaction center D1 protein）的psbA基因上調(diào)，5個PS Ⅱ放氧增強蛋白（photosystem Ⅱ oxygen-evolving enhancer protein）和4個不同分子量蛋白的DEGs都表現(xiàn)為下調(diào)。此外，編碼葉綠素a/b結(jié)合蛋白的10個基因（LHCA 1、LHCA 2-1、LHCA 2-2、LHCA 4、LHCB 1-1、LHCB 1-2、LHCB 2、LHCB 4、LHCB 6、LHCB 7）在YL葉片中下調(diào)表達(dá)。綜上結(jié)果表明，下調(diào)的與光合作用有關(guān)的編碼基因?qū)L葉片中葉綠體的發(fā)育有影響，這與YL組葉片葉綠素含量降低的情況相符。葉綠素含量減少，引起YL組光合速率下降（表5）。

3討論

3.1 葉綠素合成受阻和葉綠體發(fā)育異常導(dǎo)致YL葉色黃化

葉色是植物的一個重要性狀，其形成涉及較多復(fù)雜的生物學(xué)過程（Wang et al.， 2022）。在高等植物中，葉色表現(xiàn)主要決定于葉綠素代謝過程（吳硯農(nóng)等，2021），通常是因基因突變引起的葉綠素合成受阻或降解加速，導(dǎo)致植株葉色黃化（朱美玉，2020）。在YL突變體的葉綠素合成過程中，共有HemA、HemB、HemE、ChlI、POR等9種酶的基因下調(diào)表達(dá)，涉及從L-谷氨酰-tRNA到葉綠素酸酯合成的大多數(shù)過程。其中， HemA催化L-谷氨酰-TRNA（L-glutamate-TRNA）還原，是調(diào)控葉綠素合成的第一個限速反應(yīng)（Zhao et al.， 2014）。HemB則參與δ-氨基乙酰丙酸（δ-aminolevulinate）向膽色素原轉(zhuǎn)化，也是葉綠素合成的關(guān)鍵步驟（Yang et al.， 2015）。HemA和HemB基因在YL中的表達(dá)量均下調(diào)約50%，推測是由于該兩個前端基因的顯著下調(diào)導(dǎo)致葉綠素合成的前體物質(zhì)減少，引起后續(xù)反應(yīng)受阻，進(jìn)而使葉片整體變色。若突變發(fā)生于葉綠素合成的后期基因，則突變體通常形成條紋或斑點狀（Sakuraba et al.， 2015）。例如，HemE基因突變會導(dǎo)致玉米（Zea mays）葉片出現(xiàn)病斑（Hu et al.， 1998），HemF基因突變則會引起玉米葉片黃化壞死（Williams et al.， 2006）。此外，ChlI基因表達(dá)下調(diào)也可能引起YL葉色黃化。ChlI是鎂離子螯合酶（Mgch）的三個亞基之一，Mgch則是葉綠素合成途徑（鎂分支）中的第一種酶，也是一種關(guān)鍵的限速酶（羅莎等，2015）。已有研究表明，Mgch亞基編碼基因ChlI、ChlD的表達(dá)會受該酶底物濃度的影響（Zhang et al.， 2006）。在YL黃化突變體中，ChlI基因表達(dá)量下調(diào)約50%，推測可能是由于其前體—原卟啉IX（protoporphyrin IX）含量降低所致。并且，該過程也可能進(jìn)一步抑制后續(xù)反應(yīng)，最終導(dǎo)致YL組葉綠素含量顯著減少。此外，YL中類胡蘿卜素含量的顯著下降，對突變體黃化現(xiàn)象的形成也有一定影響。但是，突變體中葉綠素與類胡蘿卜素的比值（Chl/Car）未發(fā)生顯著改變，兩組比值分別為8.21和8.31，說明Chl/Car比值對YL的黃葉表型影響不大。

葉綠體結(jié)構(gòu)異常也可能導(dǎo)致植株葉色黃化（江新鳳，2021）。在YL突變體中，有33條與光合作用相關(guān)的DEGs表達(dá)水平發(fā)生變化，其中28條為PS I、PS Ⅱ的RCC和LHC的編碼基因。Psa和Psb家族中許多基因的下調(diào)表達(dá)，可能導(dǎo)致PS Ⅰ和PS Ⅱ中相關(guān)蛋白的功能受阻。已有研究證實，PS Ⅱ蛋白復(fù)合物的顯著下調(diào)會引起不良基粒的堆疊（熊興偉等，2023）。LHC與色素結(jié)合起到吸收和傳遞光能的作用，并能實現(xiàn)光保護(hù)，其表達(dá)下降會導(dǎo)致葉綠體中基粒堆積異常，引起黃葉表型（Kim et al.， 2009）。在對水稻黃葉突變體的研究中，Wu等（2007）發(fā)現(xiàn)葉綠體發(fā)育相關(guān)基因以及PS Ⅱ蛋白復(fù)合體基因的表達(dá)都會受葉綠素合成中間產(chǎn)物的調(diào)控。在擬南芥研究中，LHCB基因的表達(dá)受到葉綠素合成相關(guān)酶（如Mgch）的反饋調(diào)節(jié)（Mochizuki et al.， 2001）。由此推測，葉綠素合成途徑受阻，其中間產(chǎn)物和相關(guān)酶的含量發(fā)生變化，從而抑制葉綠體光系統(tǒng)中RCC和LHC的基因表達(dá)，影響類囊體膜結(jié)構(gòu)的形成，進(jìn)而導(dǎo)致葉綠體發(fā)育異常、葉色黃化。此外，葉綠素缺乏與葉綠體發(fā)育異常，也導(dǎo)致YL突變體捕光能力下降，對光合作用產(chǎn)生不良影響。

3.2 類黃酮物質(zhì)合成是YL葉色黃化的物質(zhì)基礎(chǔ)

采用非靶向代謝組（LC-MS）分析，在YL組中共檢測到614個SCMs，主要涉及黃酮類、氨基酸、氨基糖或核苷酸糖等。黃酮類物質(zhì)中的SCMs數(shù)量最多，有23個，包括白矢車菊素、楊梅素、槲皮素等類黃酮化合物及其糖苷衍生物。其中，吡喃酮啡肽A在YL突變體中上調(diào)倍數(shù)最大，達(dá)2.28倍。該物質(zhì)最早發(fā)現(xiàn)于黑加侖種子提取物中（Lu et al.， 2000），目前關(guān)于其合成途徑和形成機制尚不清楚。黃酮類等含氮化合物中形成SCMs的積累，表明YL突變體中與碳和氮相關(guān)的通路發(fā)生了代謝重編。在YL中，參與葉綠素合成、碳固定以及光合作用的DEGs主要表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)（HEMA、TIM、GAPA、LHC等），會造成光合作用受阻，進(jìn)而導(dǎo)致下游的糖酵解、TCA循環(huán)等碳代謝過程受到抑制（宋建民等，1998）。糖酵解和TCA循環(huán)的中間體是黃酮類物質(zhì)碳骨架的主要來源（劉健偉，2016），代謝速率下降會影響類黃酮的生物合成。然而，代謝組數(shù)據(jù)分析表明，兩個代謝通路的中間產(chǎn)物及相關(guān)酶的含量在YL中無顯著變化。并且，YL組中糖酵解途徑的丙酮酸激酶（pyruvate kinase）編碼基因表達(dá)上調(diào)了3.14倍，TCA循環(huán)中蘋果酸合酶（malate synthase）編碼基因表達(dá)上調(diào)達(dá)20.42倍，說明黃化突變促進(jìn)了葉片中糖酵解和TCA循環(huán)的代謝。相同現(xiàn)象也在赤霞珠葡萄的黃化突變體中被發(fā)現(xiàn)，原因可能是黃化葉片對碳源和氮源的征調(diào)能力更強（陳迎春，2011），使得黃酮類物質(zhì)合成的碳骨架供應(yīng)充足。此外，由于葉綠素合成受阻，減少了對氮的消耗，因此氮積累也可能在一定程度上促進(jìn)了黃酮類物質(zhì)的合成與積累，并為YL葉色黃化表現(xiàn)的形成提供了物質(zhì)基礎(chǔ)（江新鳳，2021）。

3.3 轉(zhuǎn)錄因子參與YL葉色黃化過程

轉(zhuǎn)錄因子對生物的生長發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用，許多種類還參與對非生物脅迫的應(yīng)答（Sun et al.， 2022）。在YL中，轉(zhuǎn)錄因子富集最多的DEGs為MYB、AP2/ERF和bHLH。An等（2017）研究表明，MYB家族轉(zhuǎn)錄因子能夠介導(dǎo)類黃酮合成途徑中很多關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)黃酮類物質(zhì)產(chǎn)生。bHLH轉(zhuǎn)錄因子則被證實參與對環(huán)境脅迫的應(yīng)答，并能協(xié)同MYB調(diào)控類黃酮生物合成（Liu et al.， 2018；Wang et al.， 2018）。在YL組中，CHS、CHI、F3H、FLS等類黃酮合成關(guān)鍵酶的基因表達(dá)上調(diào)，可能是受MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。此外，AP2/ERF家族4個DEGs表達(dá)發(fā)生顯著改變，該基因家族主要參與強光照、高溫、強光等非生物脅迫的應(yīng)激反應(yīng)（Wu et al.， 2015）。WRKY、HSF等與逆境脅迫相關(guān)的DEGs也出現(xiàn)富集，表明YL黃化突變體可能受到環(huán)境脅迫。進(jìn)一步分析脅迫條件發(fā)現(xiàn)，其可能源于強光或水分缺失。黃化突變體因缺少葉綠素而更容易遭受強光脅迫。江新鳳（2021）研究證實強光脅迫能誘導(dǎo)MYhak9i78fPCCEIEzw70uxjUAHF31MmJRCDd85UBGqsUA=B基因上調(diào)并參與植株黃化過程。此外，更快的蒸騰速率可能使YL遭受水分脅迫。YL的蒸騰速率是NYL的1.42倍，蒸騰速率過快易導(dǎo)致植株缺水（張麗霞等，2021）。因此推測，YL受到強光或缺水脅迫，誘導(dǎo)MYB、bHLH等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)并參與類黃酮的生物合成，促進(jìn)黃酮類化合物的產(chǎn)生。

4結(jié)論

本研究通過代謝組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)用技術(shù)探索赤皮青岡葉色黃化的形成機制。結(jié)果表明，YL金黃葉色可能是受到葉綠素合成受阻、葉綠體發(fā)育異常以及黃酮類物質(zhì)合成加強等因素的綜合作用。此外，在YL組還發(fā)現(xiàn)MYB和bHLH家族的基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，證實了該兩類轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控類黃酮的生物合成。本研究拓展了對赤皮青岡黃葉表型形成機制的認(rèn)識，為更多“金葉”類型園林植物資源的選育工作提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

AN JP， LIU X， LI HH， et al.， 2017. Apple RING E3 ligase MdMIEL1 inhibits anthocyanin accumulation by ubiquitinating and degrading MdMYB1 protein ［J］. Plant Cell Physiol， 58（11）： 1953-1962.

CHEN YC，2011. The physiological characteristics and related genes of a albino mutant in cabernet sauvignon grapevine ［D］. Taian： Shandong Agricultural University： 31-56. ［陳迎春， 2011. 赤霞珠葡萄黃化突變體生理特性及相關(guān)基因分析 ［D］. 泰安： 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)： 33-40.］

Editorial Committee of China Flora of Chinese Academy of Sciences，1998. Flora Republicae Popularis Sinicae： Vol. 22 ［M］. Beijing： Science Press： 326. ［中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會， 1998. 中國植物志： 第二十二卷 ［M］. 北京： 科學(xué)出版社： 326.］

GRABHERR MG， HAAS BJ， YASSOUR M， et al.， 2011. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome ［J］. Nat Biotechnol， 29（7）： 644-652.

GUSTAFSSON A， 1942. The plastid development in various type of chlorophyll mutations ［J］. Hereditas， 28（3/4）： 483-492.

HU GS，YALPANI N，BRIGGS SP，et al.，1998. A porphyrin pathway impairment is responsible for the phenotype of a dominant disease lesion mimic mutant of maize ［J］. Plant Cell， 10（7）： 1095-1105.

JIANG XF，2021. Identification and evaluation of specific tea germplasm resources in Jiangxi Province and multiomics analysis of shoot etiolation in Camellia sinensis var. Huangjinju ［D］. Wuhan： Huazhong Agricultural University： 44-82. ［江新鳳， 2021. 江西特異茶樹資源評價、鑒定及“黃金菊”新梢黃化的多組學(xué)分析 ［D］. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)： 44-82.］

KIM EH， LI XP， RAZEGHIFARD R， et al.， 2009. The multiple roles of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complexes define structure and optimize function of Arabidopsis chloroplasts： A study using two chlorophyll b-less mutants ［J］. BBA-Bioenergetics， 1787（8）： 973-984.

KLOPFENSTEIN DV，ZHANG LS，PEDERSEN BS，et al.，2018. GOATOOLS： a python library for gene ontology analyses ［J］. Sci Rep， 8（1）： 10872.

LI B，DEWEY CN，2011. RSEM： accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome ［J］. BMC Bioinform， 12（1）： 323.

LI LJ，ZHANG ZW，XUE Y，et al.，2022. Effects of low temperature stress on chlorophyll metabolism of Zoysia japonica ［J］. J Beijing For Univ， 44（2）： 91-99 ［李麗菁， 張智韋， 薛云， 等， 2022. 低溫脅迫對日本結(jié)縷草葉綠素代謝的影響 ［J］. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報， 44（2）： 91-99.］

LI SP， ZHANG Y， SHE JS， et al.， 2023. The characteristics and chloroplast ultrastructure of yellow leaf mutant CHL234 in eggplant ［J］. Acta Hortic Sin， 50（5）： 1000-1008. ［李淑培， 張映， 舒金帥， 等， 2023. 茄子葉色黃化突變體CHL234的特性及其葉綠體超微結(jié)構(gòu) ［J］. 園藝學(xué)報， 50（5）： 1000-1008.］

LI WX， HE ZC， YANG SB， et al.， 2019. Construction and analysis of a library of miRNA in gold-coloured mutant leaves of Ginkgo biloba L. ［J］. Folia Hortic， 31（1）： 81-92.

LI WZ， GODZIK A， 2006. Cd-hit： a fast program for clustering and comparing large sets of protein or nucleotide sequences ［J］. Bioinformatics， 22（13）： 1658-1659.

LI YH， WANG BH， DAI ZY， et al.， 2012. Morphological structure and genetic mapping of new leaf-color mutant gene in rice （Oryza sativa） ［J］. Rice Sci， 19（2）： 79-85.

LIN XY， SHAO SX， WANG PJ， et al.， 2022. The albino mechanism of a new theanine-rich tea cultivar ‘Fuhuang 2’ ［J］. Chin J Biotechnol， 38（10）： 3956-3972. ［林馨穎， 邵淑賢， 王鵬杰， 等， 2022. 高茶氨酸茶樹新品系‘福黃2號’黃化變異機理 ［J］. 生物工程學(xué)報， 38（10）： 3956-3972.］

LIU JW， 2016. Omics-based study on the metabolism of C/N and biosynthesis of main quality related components in tea plants affected by nitrogen ［D］. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences： 1-6. ［劉健偉， 2016. 基于組學(xué)技術(shù)研究氮素對于茶樹碳氮代謝及主要品質(zhì)成分生物合成的影響 ［D］. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院： 1-6.］

LIU LL， LI YY， SHE GB， et al.， 2018. Metabolite profiling and transcriptomic analyses reveal an essential role of UVR8-mediated signal transduction pathway in regulating flavonoid biosynthesis in tea plants （Camellia sinensis） in response to shading ［J］. BMC Plant Biol， 18（1）： 233.

LIU XL， LI XM， HE XS， et al.， 2017. A review： molecular mechanism of plant yellow leaf mutation ［J］. J S Agric， 48（8）： 1358-1366. ［劉新亮， 李先民， 何小三， 等， 2017. 植物葉色黃化突變分子機理的研究進(jìn)展 ［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報， 48（8）： 1358-1366.］

LIU YF， PANG DD， LI YY， et al.， 2022. The screening and identification of key transcription factor genes for theacrine metabolism ［J］. J Tea Sci， 42（1）： 41-50. ［劉玉飛， 龐丹丹， 李友勇， 等. 苦茶堿代謝關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因的篩選鑒定 ［J］. 茶葉科學(xué)， 42（1）： 41-50.］

LU XY， CHEN Z， TANG F， et al.， 2020. Combined transcriptomic and metabolomic analysis reveals mechanism of anthocyanin changes in Red Maple （Acer rubrum） leaves ［J］. Sci Silv Sin， 56（1）： 38-54. ［陸小雨， 陳竹， 唐菲， 等， 2020. 轉(zhuǎn)錄組與代謝組聯(lián)合解析紅花槭葉片中花青素苷變化機制 ［J］. 林業(yè)科學(xué)， 56（1）： 38-54.］

LU YR， SUN Y， FOO LY， 2000. Novel pyranoanthocyanins from black currant seed ［J］.Tetrahedron Lett， 41（31）： 5975-5978.

LUO S， LUO T， PENG P， et al.， 2015. Activity regulation and functions of Mg chelatase ［J］. Plant Physiol J， 51（6）： 806-812. ［羅莎， 羅韜， 彭鵬， 等， 2015. 鎂離子螯合酶活性調(diào)控及其功能 ［J］. 植物生理學(xué)報， 51（6）： 806-812.］

LUO T， ZHOU ZF， DENG YC， et al.， 2022. Transcriptome and metabolome analyses reveal new insights into chlorophyll，photosynthesis，metal ion and phenylpropanoids related pathways during sugarcane ratoon chlorosis ［J］. BMC Plant Biol， 22（1）： 1-15.

LYU YZ， DONG XY， HUANG LB， et al.，2017. De novo assembly of Koelreuteria transcriptome and analysis of major gene related to leaf etiolation ［J］. S Afr J Bot， 113（1）： 355-361.

MAEKAWA S， TAKABAYASHI A， REYES TH， et al.， 2015. Pale-green phenotype of atl31 atl6 double mutant leaves is caused by disruption of 5-aminolevulinic acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana ［J］. PLoS ONE， 10（2）： e0117662.

MANJAYA JG， NANDANWAR RS， 2007. Genetic improvement of soybean variety JS 80-21 through induced mutations ［J］. Plant Mutat Rep， 1（3）： 36-40.

MARUM L， MIGUEL A， RICARDO CP， et al.， 2012. Reference gene selection for quantitative real-time PCR normalization in Quercus suber ［J］. PLoS ONE， 7（4）： e35113.

MICHAEL IL， HUBER W， ANDERS S， 2014. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2 ［J］. Genome Biol， 15（12）： 550.

MOCHIZUKI N， BRUSSLAN JA， LARKIN R，et al.， 2001. Arabidopsis genomes uncoupled 5 （GUN5） mutant reveals the involvement of Mg-chelatase H subunit in plastid-to-nucleus signal transduction ［J］. Proc Natl Acad Sci， 98（4）： 2053-2058.

OUYANG ZY， OUYANG SL， WU JY， et al.， 2021. Research progress of precious commercial tree species Cyclobalanopsis gilva ［J］. Hunan For Sci Technol， 48（6）： 74-79. ［歐陽澤怡， 歐陽碩龍， 吳際友， 等， 2021. 珍貴用材樹種赤皮青岡研究進(jìn)展 ［J］. 湖南林業(yè)科技， 48（6）： 74-79.］

QIN ZK， LIU N， ZHOU X， et al.， 2023. Phenotypic diversity of Quercus gilva natural populations in middle subtropical China ［J］. Guihaia， 43（9）： 1622-1635. ［秦之曠， 劉娜， 周霞， 等， 2023. 中亞熱帶赤皮青岡天然種群表型多樣性分析 ［J］. 廣西植物， 43（9）： 1622-1635.］

SAKURABA Y， PARK SY， PAEK NC， et al.，2015. The divergent roles of STAYGREEN （SGR） homologs in chlorophyll degradation ［J］. Mol Cells， 38（5）： 390-395.

SMITH-UNNA R， BOURSNELL C， PATRO R， et al.， 2016. TransRate： reference-free quality assessment of de novo transcriptome assemblies ［J］. Genome Res， 26（8）： 1134-1144.

SIMO FA， WATERHOUSE RM， IOANNIDIS P， et al.，2015. BUSCO： assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs ［J］. Bioinformatics， 31（19）： 3210-3212.

SONG JM， TIAN JC，ZHAO SJ， 1998. Relationship between photosynthetic carbon and nitrogen metabolism in plants and its regulation ［J］. Plant Physiol J， 34（3）： 230-238. ［宋建民， 田紀(jì)春， 趙世杰， 1998. 植物光合碳和氮代謝之間的關(guān)系及其調(diào)節(jié) ［J］. 植物生理學(xué)通訊， 34（3）： 230-238.］

SUN Y， PAN BP， JIE GK， et al.， 2022. Dynamic transcriptome and network-based analysis of yellow leaf mutant Ginkgo biloba ［J］. BMC Plant Biol， 22（1）： 465-478.

WANG FF， CHEN NZ， SHEN SH， 2022. iTRAQ-based quantitative proteomics analysis reveals the mechanism of golden-yellow leaf mutant in hybrid paper mulberry ［J］. Int J Mol Sci， 23（1）： 127.

WANG WL， WANG YX， LI H， et al.， 2018. Two MYB transcription factors （CsMYB2 and CsMYB26） are involved in flavonoid biosynthesis in tea plant ［Camellia sinensis （L.） O. Kuntze］ ［J］. BMC Plant Biol， 18（1）： 288.

WILLIAMS P， HARDEMAN K， FOWLER J， et al.， 2006. Divergence of duplicated genes in maize： evolution of contrasting targeting informa tion for enzymes in the porphyrin pathway ［J］. Plant J， 45： 727-739.

WU YN， ZHENG WW， LU WJ， et al.， 2021. Research progress on the characteristics and molecular mechanism of yellowing mutation in Brassicaceae ［J］. J Zhejiang A & F Univ， 38（2）： 412-419. ［吳硯農(nóng)， 鄭偉尉， 陸偉杰， 等， 2021. 十字花科植物黃化突變特性及其分子機制研究進(jìn)展 ［J］. 浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報， 38（2）： 412-419.］

WU ZJ， LI XH， LIU ZW， et al.， 2015. Transcriptome-based discovery of AP2/ERF transcription factors related to temperature stress in tea plant （Camellia sinensis） ［J］. Funct Integr Genomic， 15（6）： 741-752.

WU ZM， ZHANG X， HE B， et al.， 2007. A chlorophyll-deficient rice mutant with impaired chlorophyllide esterification in chlorophyll biosynthesis ［J］. Plant Physiol， 145（1）： 29-40.

XIONG XW， WANG YQ， TIAN HZ， et al.， 2023. Molecular mechanisms of chlorophyll-reduced cotyledon based on transcriptome sequencing in pumpkin ［J］. Acta Agric Zhejiang， 35（1）： 90-102. ［熊興偉， 王藝琴， 田懷志， 等， 2023. 基于轉(zhuǎn)錄組測序解析南瓜子葉黃化的分子機理 ［J］. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報， 35（1）： 90-102.］

YAMASHITA H， KAMBE Y， OHSHIO M， et al.，2021. Integrated metabolome and transcriptome analyses reveal etiolation-induced metabolic changes leading to high amino acid contents in alight-sensitive Japanese albino tea cultivar ［J］. Front Plant Sci， 11（1）： 611140.

YANG YX， CHEN XX， XU B， et al.， 2015. Phenotype and transcriptome analysis reveals chloroplast development and pigment biosynthesis together influenced the leaf color formation in mutants of Anthurium andraeanum ‘Sonate’ ［J］. Front Plant Sci， 6（1）： 139.

ZHANG CY， WANG MH， GAO XZ， et al.， 2019. Photosynthetic physiological and histology in novel etiolated branch of the ‘Xiangfeicui’ tea plant （Camellia sinensis） ［J］. Mol Plant Breed， 17（23）： 7892-7900. ［張晨禹， 王銘涵， 高羲之， 等， 2019. 茶樹‘湘妃翠’黃化枝光合生理與組織學(xué) ［J］. 分子植物育種， 17（23）： 7892-7900.］

ZHANG H， LI JJ， YOO JH， et al.， 2006. Rice Chlorina-1 and Chlorina-9 encode ChlD and ChlI subunits of Mg-chelatase， a key enzyme for chlorophyll synthesis and chloroplast development ［J］. Plant Mol Biol， 62（3）： 325-337.

ZHANG LX， GUO XY， SHI PF， et al.， 2021. Effect of water stress on the chlorophyll content and carotenoid content of kenaf leaves during vigorous growing stage ［J］. Plant Fiber Sci Chin， 43（2）： 80-87. ［張麗霞， 郭曉彥， 史鵬飛， 等， 2021. 旺長期水分脅迫對紅麻葉片中葉綠素和胡蘿卜素含量的影響 ［J］. 中國麻業(yè)科學(xué)， 43（2）： 80-87.］

ZHAO AG， FANG Y， CHEN XM， et al.， 2014. Crystal structure of Arabidopsis glutamyl-tRNA reductase in complex with its stimulator protein ［J］. Proc Natl Acad Sci， 111（18）： 6630-6635.

ZHU LX， ZENG XH， CHEN YL， et al.， 2014. Genetic characterisation and fine mapping of a chlorophyll deficient mutant （BnaC.ygl） in Brassica napus ［J］. Mol Breed， 34（2）： 603-614.

ZHU MY， 2020. Analysis of photosynthetic characteristics and differentially expressed genes of a tomato yellow leaf mutant LA3734 ［D］. Shenyang： Shenyang Agricultural University： 31-56. ［朱美玉， 2020. 番茄黃葉突變體LA3734的光合特性及差異表達(dá)基因分析 ［D］. 沈陽： 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)： 31-56.］

（責(zé)任編輯李莉王登惠）