羅漢果品質(zhì)受氣候因子影響及其分子調(diào)控機制

摘要： 為了探討氣候因子對不同季節(jié)授粉羅漢果品質(zhì)影響及其分子作用機制，該文以主栽“青皮果”品種夏季與秋季授粉果實為研究對象，采用不同發(fā)育時間氣候因子監(jiān)測、形態(tài)大小測量、羅漢果苷代謝檢測和基因表達qRT-PCR分析方法，統(tǒng)計分析二者生境氣候因子、品質(zhì)性狀和基因表達差異。結果表明：（1）秋季授粉果實與夏季授粉果實相比，生境平均溫度和有效積溫35 d以后明顯降低，晝夜溫差65 d以前明顯增加，并且平均溫度、有效積溫差異大于晝夜溫差，光照強度和空氣濕度則相近。（2）橫徑、縱徑和單果重均增加，但是差異不顯著。（3）羅漢果苷Ⅴ和11-O-羅漢果苷Ⅴ合成積累速度滯后10 d左右，含量從55 d開始均顯著降低并且成熟時分別降低了40.66%和46.07%。（4）羅漢果苷Ⅴ合成酶基因55 d協(xié)同表達的一致性差，上調(diào)數(shù)目和幅度少，而且負責最后一步合成反應的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因SgUGT94-289-3均下調(diào)表達。綜上所述，夏季與秋季授粉羅漢果形態(tài)大小未受氣候因子影響，而羅漢果苷Ⅴ品質(zhì)則受溫度影響顯著，溫度可能通過調(diào)控羅漢果苷Ⅴ合成酶基因協(xié)同表達的一致性和水平致使春季和秋季的羅漢果苷Ⅴ品質(zhì)具有差異性。該研究結果為羅漢果優(yōu)質(zhì)栽培和遺傳育種提供了理論依據(jù)。

關鍵詞： 不同季節(jié)， 羅漢果品質(zhì)， 氣候因子， 果實大小， 羅漢果苷Ⅴ含量， 基因表達

中圖分類號： Q943文獻標識碼： A文章編號： 1000-3142（2024）07-1352-12

Effects of climatic factors on fruit quality of Siraitiagrosvenorii and its molecular regulation mechanism

PENG Huan1， MO Changming2， XIE Lei3， LUO Zuliang3，GUO Wenfeng2， TANG Qi4， XIAO Dong1*

（ 1. College of Agriculture， Guangxi University， Nanning 530004， China； 2. Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Laboratory， GuangxiAcademy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， China； 3. Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences， PekingUnion Medical College， Beijing 100193， China; 4. College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China ）

Abstract： In order to investigate the impact of climatic factors on the quality of Siraitia grosvenorii fruits pollinated in different seasons and the underlying molecular mechanism involved， the differences in climate factors， quality traits， and gene expression between fruits of the main cultivar S. grosvenorii “Qingpiguo” pollinated in summer and autumn were statistically analyzed by monitoring climate factors at different developmental stages， measuring morphological changes， detecting mogroside metabolism， and analyzing gene expression using qRT-PCR. The results were as follows： （1） Compared to summer-pollinated fruits， the average temperature and effective accumulated temperature of autumn-pollinated fruits decreased significantly after 35 d. Additionally， the temperature difference between day and night increased significantly before 65 d. However， this difference was still less than that of the average temperature and effective accumulated temperature. The light intensity and air humidity remained similar. （2） The transverse diameters， longitudinal diameters， and single fruit weights of autumn-pollinated fruits increased compared to those of summer-pollinated fruits， however， these differences were not statistically significant. （3） Mogroside V and 11-O-mogroside V in autumn-pollinated fruits accumulated slowly from 55 d with a delay of about 10 d， moreover， the content of both compounds in ripe fruits decreased by 40.66% and 46.07%， respectively. （4） In autumn， the number and extent of up-regulated mogroside V synthetase genes were relatively lower， and their co-expression consistency was poorer than in summer. Furthermore， the glucosyltransferase gene SgUGT94-289-3 which was responsible for the final step in mogroside V biosynthesis， exhibited down-regulation at all time points of 55 d. In summary， the shape and size of S. grosvenorii fruits pollinated in different seasons were not significantly affected by climatic factors; however， the content of mogroside V was significantly influenced by the temperature， which potentially influences these variations in mogroside V by regulating both the co-expression consistency and expression level of mogroside V synthetase genes. The results of this study provide the theoretical reference for high-quality cultivation and genetic breeding of S. grosvenorii.

Key words： different seasons， Siraitia grosvenorii quality， climatic factors， fruit size， mogroside V content， gene expression

羅漢果（Siraitia grosvenorii）是葫蘆科（Cucurbitaceae）羅漢果屬（Siraitia）藥用、甜料植物，其干燥果實為知名傳統(tǒng)中藥材，具有清熱止咳、抗炎平喘、祛痰潤肺、潤腸通便、降糖降脂、抗氧化、抗癌、抗纖維化等功效（唐昀彤等，2021；戴勝和汪惠麗，2023），富含三萜皂苷活性成分羅漢果苷Ⅴ等多種高強度甜味物質(zhì)，其中羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷Ⅵ、羅漢果賽門苷Ⅰ、羅漢果苷Ⅴ、11-O-羅漢果苷Ⅴ和異羅漢果苷Ⅴ的甜度分別為蔗糖的195、300、465、378、68和500倍（Murata et al.， 2006; Jia & Yang， 2009）。羅漢果甜苷因其熱量低、安全無毒等特點，糖尿病、高血壓、肥胖人群均可食用，已被大規(guī)模提取用作甜味劑。近年來，羅漢果需求越來越大，效益也逐漸增加，該產(chǎn)業(yè)已成為鄉(xiāng)村振興的支柱產(chǎn)業(yè)，種植區(qū)域也由道地產(chǎn)區(qū)向周邊地區(qū)快速蔓延。但是，果實甜苷含量較低導致甜味劑提取原料成本高，成為羅漢果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展限制瓶頸。這不僅與當前羅漢果栽培品種有關，還與果實成熟批次有一定的相關性。羅漢果種植需人工授粉才能結果，授粉期集中在7月初到8月底，7月夏季和8月秋季授粉果實通常分兩批成熟。不同產(chǎn)區(qū)和生長季氣候因子變化會直接影響果實成熟和內(nèi)外品質(zhì)?？Х雀邷貢r果實成熟早而品質(zhì)差（Aparecido et al.， 2018）。葡萄高溫時成熟度和酸度高，低溫時主要活性成分維生素C、多酚和花青素含量高（Rafique et al.， 2023），平均溫度和濕度高有利于糖分積累（喬振羽等，2023）。黑加侖高溫時果實萜類揮發(fā)物質(zhì)積累增加，低溫時果實的有機酸積累增加（Pott et al.， 2023）。黃瓜香氣物質(zhì)C6醛類含量與平均光照強度呈正相關，C9醛類含量與平均相對濕度呈負相關（Li et al.， 2019）。黑莓前期成熟果實比后期的單果重和有機酸含量高，但是花青素和可溶性固形物含量低（Mikulic-Petkovsek et al.， 2023）。加工企業(yè)認為羅漢果前期成熟果實因生境溫度高而品質(zhì)差會增加原料成本，后期成熟果實因生境溫度低、晝夜溫差大而品質(zhì)高可降低原料成本，因而偏好采購后期成熟果實。由于高甜苷新品種選育周期長，因此目前通過研究不同季節(jié)授粉果實品質(zhì)具體差異及其受生境氣候因子影響情況指導羅漢果適宜種植區(qū)域選擇以及高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種植技術優(yōu)化，減少成熟果實品質(zhì)的差異，從而降低甜味劑提取原料成本，有利于緩解羅漢果產(chǎn)業(yè)的瓶頸問題。

市售羅漢果為圓形或長圓形，按果實橫徑劃分不同等級定價銷售，并以羅漢果苷Ⅴ含量作為主要內(nèi)在品質(zhì)指標。羅漢果外在品質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，果實橫徑、縱徑和單果重在授粉后25 d內(nèi)快速增加，30 d后基本不變（閆海鋒，2011）。羅漢果內(nèi)在品質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，高甜度羅漢果苷由無味或苦味的低糖苷逐步轉(zhuǎn)化而來，通常果實30 d以前主要含羅漢果苷Ⅰ和羅漢果苷ⅡE，30～50 d羅漢果苷ⅡE逐漸減少相繼轉(zhuǎn)化為羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷Ⅳ和羅漢果苷Ⅴ，50～70 d羅漢果苷Ⅴ快速積累接近最高含量、羅漢果苷ⅡE與羅漢果苷Ⅲ則減少消失，70～85 d成熟時主要含具甜味的羅漢果苷V（李典鵬等，2004；盧鳳來等，2010；莫長明等，2014）。低糖苷合成積累由SgSQE、SgCDS、SgEPH1-3、SgCYP102801和SgUGT85-269-1、4基因在幼果表達控制，其轉(zhuǎn)化為羅漢果苷V則由SgUGT94-289-1、2、3基因在果實發(fā)育中后期表達控制（Itkin et al.， 2016），然而這些基因調(diào)控羅漢果苷V合成的晝夜表達規(guī)律仍不清楚。白先達等（2009a、b）利用歷史氣象數(shù)據(jù)和生長調(diào)查資料分析不同產(chǎn)區(qū)氣候因子對羅漢果生長影響顯示，山區(qū)大中果率（78%）高于溫度偏高、光照偏強、濕度偏低的水田（73%），年均氣溫17～18 ℃、7月和8月平均溫度26.8～27.1 ℃、日照時數(shù)1 400 h、空氣濕度80%的主產(chǎn)區(qū)果實總糖含量高于平均溫度和日照時數(shù)偏高、空氣濕度偏低的推廣區(qū)，并以氣候因子對開花坐果和果實大小的影響為標準劃分羅漢果最適宜、適宜和不適宜種植區(qū)。羅漢果引種到產(chǎn)區(qū)外的印度，其羅漢果苷V含量低并且其快速積累期推遲到70～80 d（Shivani et al.， 2021）。但是，這些調(diào)查分析結果仍需實驗印證，溫度、光照和濕度各自對羅漢果形態(tài)大小、總糖含量和羅漢果苷V含量的影響效應仍不清楚，并且未采用羅漢果苷V含量作為評判標準劃分的羅漢果適宜種植區(qū)（白先達等，2009b；謝曉燕等，2020）也有待完善。此外，不同生長季節(jié)氣候因子對羅漢果內(nèi)外品質(zhì)的影響尚未見報道，亟須探明不同生長季節(jié)氣候因子如何通過誘導基因表達而影響羅漢果的內(nèi)外品質(zhì)。

鑒于此，本文開展不同季節(jié)授粉羅漢果內(nèi)外品質(zhì)受溫度、光照、濕度影響及其分子調(diào)控機制研究，依托夏季和秋季授粉果實，采用生境氣候因子、果實形態(tài)大小、羅漢果苷V合成積累、基因表達變化動態(tài)監(jiān)測方法，通過統(tǒng)計分析二者不同發(fā)育時間平均溫度、晝夜溫差、有效積溫、光照強度、空氣濕度、果實橫徑、果實縱徑、單果重、羅漢果苷含量、品質(zhì)性狀基因表達水平差異，擬探討以下問題：（1）夏季和秋季授粉果實品質(zhì)存在什么差異；（2）二者品質(zhì)差異受何氣候因子影響；（3）氣候影響因子如何調(diào)控基因表達引發(fā)二者品質(zhì)差異。以指導選擇羅漢果適宜種植區(qū)，制定高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種植技術，提高羅漢果品質(zhì)，解決羅漢果甜味劑提取原料成本高的問題，也為今后高甜苷品種選育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

以主栽“青皮果”品種為試驗材料，2022年3月20日移栽，按常規(guī)方法種植于廣西壯族自治區(qū)桂林市龍勝縣龍勝鎮(zhèn)雙洞村（110°02′57″ E、25°46′06″ N）。試驗基地處于海拔251 m的亞熱帶季風氣候區(qū)，年平均溫度18.1 ℃，極端最高溫39.5 ℃，極端最低溫-4.8 ℃，年降雨量1 500～2 400 mm，無霜期314 d。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器HPLC 1260（美國安捷倫科技有限公司）、4000 QTRAP LC-MS/MS （加拿大 AB Sciex公司）、Poroshell 120 SB-C18色譜柱（美國安捷倫科技有限公司）、99立式-86超低溫冰箱（美國 Thermo公司）、Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR儀（美國 Thermo公司）、Light Cycler 480 Ⅱ熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）、220R高速冷凍離心機（德國mikro公司）、MX2301A溫濕度計（美國ONSET公司）、MX2202溫度光照計（美國ONSET公司）、四用數(shù)顯電子游標卡尺（桂林量具刃具有限責任公司）、JJ500電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）。

1.2.2 試劑標準物質(zhì)羅漢果苷IA（MIA）、羅漢果苷IE（MIE）、羅漢果苷ⅡE（MⅡE）、羅漢果苷ⅢE（MⅢE）、羅漢果苷Ⅲ（MⅢ）、羅漢果苷ⅣA（MⅣA）、羅漢果賽門苷I（MSI）、羅漢果苷V（MV）、11-O-羅漢果苷V（11-O-MV）購于成都曼思特生物科技有限公司。色譜級甲酸、甲醇、乙腈、己烷購于美國Emerson Fisher公司。CW0581M超純RNA提取試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司。DL2000 Marker、10×Glycerol DNA Loading Buffer、R232反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Q711熒光定量試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。分析純?nèi)燃淄楹蜔o水乙醇、瓊脂糖購于廣西福蘭德生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗設計盛花期隨機選取發(fā)育一致雌花300朵授粉并掛牌標記日期，2022年7月16日授粉并掛牌標記的為夏季授粉果實，8月19日授粉并掛牌標記的為秋季授粉果實。于授粉當天（0 d）及授粉后5、15、25、35、45、55、65、75、85、95 d隨機采樣測定果實的橫徑、縱徑及單果重，每個時期重復測定10個果實。同時，于授粉后5、35、55、75、85、95 d，分別隨機采集發(fā)育良好的夏季和秋季授粉果實3個剝?nèi)」猓脴擞浐玫腻a箔紙收集后液氮中冷凍30 min，放入-80 ℃冰箱保存，用于羅漢果苷含量測定，每個樣品3個生物學重復。此外，于授粉后55 d這一羅漢果苷V快速積累期，分別隨機采集當天14：00、18：00、2：00、6：00和9：00發(fā)育良好的夏季和秋季授粉果實3個，同羅漢果苷含量測定采樣方法采集保存果肉樣品，用于羅漢果苷V合成酶基因表達水平qRT-PCR分析。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 環(huán)境因子監(jiān)測授粉掛牌前，于試驗田中部，在羅漢果種植棚上方20 cm處放置溫濕度計和溫度光照計，設置每隔30 min記錄1次溫度、空氣濕度和光照強度數(shù)據(jù)。

1.3.2.2 果實大小測量橫徑用數(shù)顯電子游標卡尺測量果實中部最大處，縱徑用數(shù)顯電子游標卡尺測量果柄到果臍間的距離，單果重采用精度為0.01 g的電子天平稱量單個果實重量，并進行數(shù)據(jù)記錄。

1.3.2.3 羅漢果苷含量測定于-80 ℃超低溫冰箱中取出果肉樣品保存于液氮中后，放入到液氮預冷研缽，在液氮中迅速研磨成均勻粉末，按照Qiao等（2019）的HPLC MS/MS方法提取并測定羅漢果苷IA、羅漢果苷IE、羅漢果苷ⅡE、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷ⅢE、羅漢果苷ⅣA、羅漢果賽門苷I、羅漢果苷Ⅴ、11-O-羅漢果苷V的含量。

1.3.2.4 羅漢果苷合成酶基因表達分析首先，采用CW0581M超純RNA提取試劑盒提取55 d夏季和秋季授粉果實總RNA；其次，利用R232試劑盒通過兩步法將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，20 μL反應體系逆轉(zhuǎn)錄程序（于PE管中先加入4 × gDNA wiper Mix 4 μL，再加入1 μg模板RNA）；然后，加RNase-free ddH2O至16 μL，用移液槍吹打混勻后置于PCR儀中42 ℃反應2 min；接著，向反應液中加入5 × Hi Script Ⅲ qRT Super Mix 4 μL使體積達到20 μL，用移液槍吹打混勻后繼續(xù)于PCR儀中37 ℃反應15 min、85 ℃反應5 s；最后，以逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，SgUBQ為內(nèi)參基因，利用表1 所列各基因特異性引物，采用qRT-PCR法測定55 d夏季和秋季授粉果實羅漢果苷合成酶基因表達水平。反應體系：SYBR GreenⅠ 10 μL，正反向引物各1 μL，模板2 μL，加RNase-free ddH2O至10 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s、60 ℃退火及延伸30 s共40循環(huán)。熔解曲線程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，37 ℃ 30 s。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗所得數(shù)據(jù)采用Excel 2016進行整理和統(tǒng)計分析。按0～5 d、5～15 d、15～25 d、25～35 d、35～45 d、45～55 d、55～65 d、65～75 d、75～85 d時間段，平均溫度、光照強度、空氣濕度為所有記錄溫度的平均值，有效積溫為15 ℃以上平均溫度減去15 ℃差的總和，晝夜溫差為白天平均溫度與夜晚平均溫度之差。各個時間點羅果苷V合成酶基因的相對表達量用2-ΔΔCt法計算。夏季和秋季授粉果實橫徑、縱徑、單果重、羅漢果苷V及其前體與衍生物質(zhì)含量差異，以及14：00與其余時間點間各羅漢果苷V合成酶基因表達量差異顯著性分析采用t-檢驗。

2結果與分析

2.1 果實生境氣候因子比較

由圖1和圖2可知，夏季授粉果實平均溫度基本穩(wěn)定不變，為27.79 ℃左右，有效積溫除0～5 d較低外也基本穩(wěn)定不變，約為118.50 ℃，秋季授粉果實平均溫度和有效積溫則變化較大，分別在15～28 ℃之間和18～130 ℃之間，都基本低于夏季授粉果實。但是，兩者果實生境平均溫度和有效積溫35 d以前相近，35 d以后秋季授粉果實明顯低于夏季授粉果實，分別下降為20 ℃和60 ℃左右，76～85 d進一步下降至16.80 ℃和18.03 ℃。

由圖1可知，夏季授粉果實0～5 d較低，為3.75 ℃；6～45 d較穩(wěn)定，約為9.43 ℃；46～75 d則升高，保持在約13.01 ℃；76～85 d又明顯地縮小至7.41 ℃。秋季授粉果實0～45 d較穩(wěn)定，約為11.97 ℃，46～55 d則上升至16.97 ℃，65 d以后開始縮小為11.95 ℃，76～85 d明顯縮小至2.13 ℃。秋季授粉果實生境晝夜溫差65 d以前均在10 ℃以上，大于夏季授粉果實（基本在10 ℃以下），65 d以后才小于夏季授粉果實。綜上結果表明，夏季與秋季授粉果實生境溫度存在明顯差異。

由圖3可知，夏季授粉果實由0～5 d的13 480.40 lx上升至6～15 d的22 582.37 lx后呈下降趨勢，76～85 d下降至最低的12 843.09 lx。秋季授粉果實0～85 d一直呈下降趨勢，除0～5 d的20 162.95 lx明顯高于夏季授粉果實49.57%外，其他均低于夏季授粉果實，其中66～75 d、76～85 d分別降低了28.71%、26.53%，其余時期相差不大，降幅在7.52%～19.88%之間。這表明夏季與秋季授粉果實生境平均光照強度總體相差不大。

由圖4可知，夏季授粉果實0～5 d為88%，6～15 d下降為74.91%，16～85 d變化不明顯。秋季授粉果實46～55 d和76～85 d明顯下降和上升，分別比夏季授粉果實下降了24.32%和上升了21.11%，其余各時期兩者間相差不大，降幅在3.88%～16.45%之間。這表明夏季與秋季授粉果實生境空氣濕度也總體相差不大。

2.2 果實大小比較

由圖5-圖7可知，秋季授粉果實的橫徑、縱徑和單果重均高于夏季授粉果實且兩者果實均在0～35 d逐漸增加，其中0～25 d為快速生長期，35 d以后則基本保持不變。此外，僅15 d的縱徑和單果重差異顯著，其余各時期兩者果實大小指標均無顯著差異。這表明夏季與秋季授粉果實大小差異不顯著。

2.3 果實羅漢果苷含量比較

由圖8和圖9可知，兩者果實35 d以前含羅漢果苷IA、羅漢果苷IE、羅漢果苷ⅡE、羅漢果苷Ⅲ且含量無顯著差異，與生境溫度無明顯差異一致；55 d時也含羅漢果苷IA、羅漢果苷IE、羅漢果苷ⅡE，還與75 d以后一樣含羅漢果苷ⅢE、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷ⅣA、羅漢果賽門苷I、羅漢果苷V、11-O-羅漢果苷V；但55 d開始，除羅漢果苷ⅡE外，兩者果實其余羅漢果苷含量均存在顯著差異，與夏秋和秋季授粉果實生境平均溫度和有效積溫出現(xiàn)明顯差異時間一致。其中，羅漢果苷ⅢE、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷ⅣA和羅漢果賽門苷I含量55 d時夏季授粉果實均顯著高于秋季授粉果實，此后則相反；羅漢果苷V、11-O-羅漢果苷V含量，從55 d開始夏季授粉果實均顯著高于秋季授粉果實。

從5～85 d羅漢果苷積累規(guī)律上看，夏季授粉果實5～35 d時，羅漢果苷ⅡE、羅漢果苷ⅢE、羅漢果苷Ⅲ含量增加，羅漢果苷ⅣA、羅漢果賽門苷I、羅漢果苷V、11-O-羅漢果苷V檢測不到；35～55 d時，羅漢果苷ⅡE含量降低，羅漢果苷ⅢE、羅漢果苷Ⅲ含量繼續(xù)增加，羅漢果苷ⅣA、羅漢果賽門苷I、羅漢果苷V、11-O-羅漢果苷V開始出現(xiàn)；55～75 d時，羅漢果苷ⅡE、羅漢果苷ⅢE、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷ⅣA含量快速降低，羅漢果賽門苷I、羅漢果苷V、羅漢果11-O-苷V含量快速增加；75～85 d時，羅漢果苷ⅡE、羅漢果苷ⅢE、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷ⅣA基本消失，羅漢果賽門苷I、羅漢果苷V、11-O-羅漢果苷V含量無顯著差異。與夏季授粉果實羅漢果苷積累規(guī)律不同的是：秋季授粉果實55～75 d時，羅漢果苷ⅣA含量仍繼續(xù)增加；75～85 d時開始降低且降幅遠遠小于夏季授粉果實；85 d時仍含有一定量的羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷ⅣA；95 d時羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷ⅣA基本消失，羅漢果苷V含量不再顯著增加，但羅漢果賽門苷I和11-O-羅漢果苷V含量仍顯著增加。

綜上表明，夏季與秋季授粉果實55 d開始羅漢果苷V等皂苷含量存在顯著差異，其中羅漢果苷V和11-O-羅漢果苷V積累速度秋季授粉果實比夏季授粉果實慢10 d左右，成熟時含量秋季授粉果實顯著低于夏季授粉果實，分別降低了40.66%和46.07%。

2.4 果實羅漢果苷V合成酶基因表達比較

由圖10可知，與一天中最高溫度（48.15 ℃）的14：00相比，18：00至次日早上9：00溫度為19.51～28.30 ℃時，SgSQS、SgEPH3、SgCYP102801、SgUGT85-269-1、SgUGT85-269-4、SgUGT94-289-1、SgUGT94-289-2、SgUGT94-289-3基因均上調(diào)表達，其中SgEPH3、SgCYP102801、SgUGT85-269-1、SgUGT85-269-4、SgUGT94-289-1、SgUGT94-289-2、SgUGT94-289-3基因從凌晨2：00開始均顯著或極顯著上調(diào)了1～463 倍；SgHMGR、SgSQE和SgEPH2基因除18：00下調(diào)表達外，從凌晨2：00開始也均上調(diào)表達；SgCAS和SgEPH1基因則在所有時間點均下調(diào)表達；僅SgCDS基因表達無明顯規(guī)律。SgCAS為與羅漢果苷V合成途徑競爭上游前體物質(zhì)環(huán)氧鯊烯合成甾體皂苷的酶基因。SgCDS、SgEPH1則為在幼果中催化合成羅漢果苷V上游前體物質(zhì)葫蘆二烯醇的酶基因。這表明除SgCAS和SgCDS、SgEPH1外，從18：00至次日早上9：00，夏季授粉果實羅漢果苷V合成酶基因均出現(xiàn)大幅上調(diào)表達，并且具有很好的協(xié)同表達一致性，尤其是催化羅漢果苷ⅡE、羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷ⅣA轉(zhuǎn)化合成羅漢果苷V等高糖苷的下游葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因SgUGT85-269-1、SgUGT85-269-4、SgUGT94-289-1、SgUGT94-289-2、SgUGT94-289-3，下午至次日早上涼爽溫度環(huán)境比中午高溫環(huán)境更利于合成酶基因表達積累羅漢果苷V，此時可能是夏季授粉果實羅漢果苷V一日當中最佳積累時期，與羅漢果喜涼爽習性一致。

由圖11可知，與一天中最高溫度（43.26 ℃）時的14：00相比，18：00至次日早上9：00溫度為16.36～31.37 ℃，高低溫間轉(zhuǎn)換快，SgCAS、SgEPH2、SgEPH3、SgUGT85-269-1、SgUGT94-289-2基因均上調(diào)表達。其中，僅SgCAS、SgEPH3基因從2：00開始均顯著或極顯著上調(diào)；SgCDS基因18：00至6：00上調(diào)表達，9：00下調(diào)表達；SgHMGR、SgSQE、SgEPH1、SgCYP102801基因18：00至凌晨2：00上調(diào)表達，凌晨6：00至9：00下調(diào)表達；SgUGT94-289-1基因18：00下調(diào)表達，凌晨2：00至9：00上調(diào)表達；SgUGT94-289-3基因在所有時間點均下調(diào)表達且凌晨2：00開始下調(diào)均為100%以上；SgSQS與SgUGT85-269-4基因表達無明顯規(guī)律。除SgCAS基因凌晨2：00上調(diào)4倍和SgUGT94-289-2基因9：00上調(diào)8倍外，上調(diào)表達基因均僅在少數(shù)時間點上調(diào)達到1～2 倍。綜上表明，從18：00至次日早上9：00，秋季授粉果實羅漢果苷V合成酶基因上調(diào)表達數(shù)目少且幅度小，協(xié)同表達一致性不佳。其中，18：00至凌晨2：00溫度19.32～26.47 ℃，與夏季授粉果實一樣處于適宜溫度時，上調(diào)表達基因相對較多，此時可能是秋季授粉果實羅漢果苷V主要積累期，凌晨2：00至次日早上8：00 17 ℃左右低溫驟然升高到9：00 31.37 ℃高溫時，不僅上調(diào)表達基因少且許多基因大幅下調(diào)表達，葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因SgUGT94-289-3出現(xiàn)大幅下調(diào)，低溫和高溫環(huán)境均不利于合成酶基因表達積累羅漢果苷V。

3討論

葡萄、桃、枸杞、番茄果實橫徑、縱徑、單果重和人參皂苷含量等內(nèi)外品質(zhì)性狀受溫度、 光照和空氣濕度氣候因子影響較大（張宇等，2012；張濤，2019；孫蕾等，2022；喬振羽等，2023；吳楊煥等，2023）。由于羅漢果夏季與秋季授粉果實生境平均光照強度和空氣濕度總體相差不大，因此可能對兩者品質(zhì)影響不大。55 d以前，秋季授粉果實生境晝夜溫差高于夏季授粉果實，兩者橫徑、縱徑、單果重和羅漢果苷含量無顯著差異；55 d以后，秋季授粉果實與夏季授粉果實相近，但兩者羅漢果苷含量反而出現(xiàn)顯著差異，因此，晝夜溫差可能對兩者品質(zhì)影響也不大。夏季與秋季授粉果實生境平均溫度和有效積溫差異比其他氣候因子更大，并且與兩者羅漢果苷含量出現(xiàn)差異的時間變化規(guī)律一致，可見溫度可能是影響兩者內(nèi)在品質(zhì)的主要氣候因子，其中平均溫度和有效積溫的相關性可能更大。夏季與秋季授粉果實生長曲線均與萬凌云等（2011）研究結果一致，并且果實橫徑、縱徑和單果重差異不顯著，表明兩者形態(tài)大小外在品質(zhì)未受生境氣候因子顯著影響。這可能是由于35 d以前這一果實膨大關鍵期生境平均溫度和有效積溫也相近所致。

授粉后30～70 d羅漢果生境溫度由29.54 ℃降為25 ℃左右時羅漢果苷V合成積累增加（王海英等，2016）；離體儲藏溫度由25 ℃下降時，羅漢果苷V合成積累則被抑制；降至15 ℃以下時，羅漢果苷V合成積累將幾乎停滯（王磊等，2014；莫長明等，2014）。與夏季授粉果實相比，秋季授粉果實生境平均溫度和有效積溫35 d以后分別降低至20 ℃和60 ℃以下時，羅漢果苷Ⅲ、羅漢果苷Ⅳ、羅漢果賽門苷I糖基化為羅漢果苷V、羅漢果11-O-苷V的反應速度滯后10 d左右，其含量也出現(xiàn)顯著差異。這說明秋季授粉果實生境溫度降低影響了糖基化反應，從而抑制了羅漢果苷V合成積累，與王磊等（2014）和莫長明等（2014）離體果實研究影響效應一致。低溫通常促進黃瓜葫蘆素和人參皂苷（Liu et al.， 2019）等三萜皂苷合成積累，但其卻抑制羅漢果苷V合成積累，與人們認為低溫利于羅漢果苷V合成積累觀念相反，表明其合成積累的調(diào)控機制不同，有待進一步深入研究。MYB、bHLH、AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子互作參與植物溫度脅迫響應（Ritonga et al.， 2021）和次生代謝產(chǎn)物合成積累。例如，MYB、bHLH與WD40蛋白形成三元復合物激活花青素合成積累，但是高溫誘導HY5蛋白降解使MYBL表達則抑制花青素合成積累（Kim et al.， 2017）。bHLH轉(zhuǎn)錄因子CsBi和CsBt響應高溫（> 30 ℃）或低溫（<13 ℃）脅迫合成三萜葫蘆素C使黃瓜變苦（Liu et al.， 2019）。TcERF15和TcERF12分別正負調(diào)控二萜生物堿紫杉醇合成積累（Zhang et al.， 2015）。這些轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控合成酶基因表達促使植物次生代謝產(chǎn)物合成積累。蘋果MdMYB88直接調(diào)控葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶MdUGT83L3合成積累花青素和黃酮適應低溫脅迫（Li et al.， 2022）。低溫下調(diào)木瓜萜類香氣物質(zhì)芳樟醇合成酶基因LIS表達抑制其合成積累（Gomes et al.， 2016）。植物次生代謝產(chǎn)物合成積累通常需要其合成酶基因協(xié)同表達。低溫誘導人參皂苷合成酶基因協(xié)同表達促使其合成積累（張濤，2019）。羅漢果同科其他植物則因攜帶的羅漢果苷V合成酶同源基因不能協(xié)同表達而無法合成積累羅漢果苷V（Itkin et al.， 2016）。MYB、bHLH92a和ERF轉(zhuǎn)錄因子可與羅漢果苷V合成酶基因啟動子結合調(diào)控其表達（石宏武，2020）。與夏季授粉果實相比，秋季授粉果實55 d時羅漢果苷V合成酶基因上調(diào)數(shù)目少和水平低，協(xié)同表達一致性差，尤其是負責糖基化反應的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，其中SgUGT94-289-3還出現(xiàn)了大幅下調(diào)。這表明生境溫度可能通過MYB、bHLH、AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控羅漢果苷V合成酶（尤其是葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶）基因協(xié)同表達一致性和水平致使夏季與秋季授粉果實羅漢果苷V品質(zhì)出現(xiàn)差異。

雖然17～25 ℃被認為是維持植物細胞和生產(chǎn)效率的最佳溫度，但是每個物種次生代謝產(chǎn)物合成積累的適宜溫度不同。高溫、低溫均可促進或抑制植物次生代謝產(chǎn)物合成積累（Verma & Shukla， 2015; Alhaithloul et al.， 2019; Zhang et al.， 2021）。夏季授粉果實生境溫度為19.51～28.30 ℃時，羅漢果苷V合成酶基因協(xié)同表達一致性和水平較高，羅漢果苷V含量高；然而秋季授粉果實生境溫度先維持17 ℃左右低溫再驟然升至31.37 ℃高溫時，羅漢果苷V合成酶基因協(xié)同表達一致性和水平較低，導致羅漢果苷V品質(zhì)差。這說明羅漢果苷V合成積累有適宜溫度范圍（20～28 ℃），高溫31 ℃以上或低溫17 ℃以下可能均不利于羅漢果苷V合成積累。

因此，羅漢果對生境要求較高，不同季節(jié)授粉果實羅漢果苷V品質(zhì)受生境溫度的影響較嚴重，栽培集中分布于廣西北部及鄰近省份狹窄區(qū)域，湖南北部和廣西南部均不宜種植，并且僅有廣西北部為道地產(chǎn)區(qū)，生境溫度可能是其道地性形成的重要影響因子。近年來，由于市場供不應求，羅漢果種植不斷向日照少、溫度低的湖南和四川等高緯度、高海拔區(qū)域擴張（Guo et al.， 2013; Solanki et al.， 2019）。為了獲得優(yōu)質(zhì)果實及解決羅漢果苷V甜味劑提取原料成本高的問題，羅漢果種植區(qū)域和園地選址需要重視溫度對果實品質(zhì)的影響，可通過培育大苗和使用短生育期品種措施調(diào)節(jié)授粉坐果時間，保證羅漢果苷V合成積累處于適宜溫度環(huán)境，以防止不同種植區(qū)域和授粉批次果實品質(zhì)降低，從而最大限度提高羅漢果品質(zhì)。

4結論

羅漢果夏季與秋季授粉果實形態(tài)大小未受氣候因子顯著影響，但是羅漢果苷V品質(zhì)受溫度顯著影響。主要氣候影響因子溫度通過調(diào)控羅漢果苷V合成酶基因協(xié)同表達的一致性和水平致使春季和秋季的羅漢果苷V品質(zhì)具有差異性。

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（責任編輯李莉王登惠）