菊花腦WRKY基因家族生物信息學(xué)分析及其對低溫脅迫的響應(yīng)特征

摘要：WRKY作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與植株生長過程中的各個環(huán)節(jié)，響應(yīng)各種脅迫。為了探究菊花腦WRKY基因家族的進化和功能，基于已發(fā)表的RNA-Seq數(shù)據(jù)庫分析了CnWRKY在低溫脅迫響應(yīng)中的表達(dá)情況，用Hmmer、NCBI-CDD軟件和Pfam數(shù)據(jù)庫得到目標(biāo)基因，再用TBtools軟件分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，繪制進化樹，用MEME、PlantCARE分析該轉(zhuǎn)錄因子的保守基序、順式作用元件。用Hisat2、featureCounts、Trinity軟件進行菊花腦WRKY基因的組織表達(dá)分析，再用DESeq2、edgeR包進行相對基因表達(dá)量的比較。結(jié)果顯示：CnWRKY家族有72個成員，菊花腦WRKY家族基因的外顯子、內(nèi)含子數(shù)量較多，CnWRKY基因上游啟動子區(qū)域存在豐富的順式作用元件，如節(jié)律控制、低溫響應(yīng)以及和植物生長發(fā)育有關(guān)的調(diào)控元件，部分菊花腦WRKYs基因在葉、莖、花蕾、管狀花、舌狀花中的表達(dá)具有組織特異性，多數(shù)在莖、葉中的表達(dá)程度較明顯。 CnWRKYs在不同低溫處理下的表達(dá)量也有明顯特異性。與-5 ℃ 1 h、-5 ℃ 2 h短期低溫處理相比，CnWRKYs在4 ℃ 1 周，再于-5 ℃ 1 h、-5 ℃ 2 h的長期低溫處理下有顯著表達(dá)（Plt;0.05），其中CnWRKY55、CnWRKY63、CnWRKY38、CnWRKY31呈現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)，推測這些基因在菊花腦抵御冷處理的過程中有關(guān)鍵作用。

關(guān)鍵詞：菊花腦；WRKY；RNA-Seq；低溫脅迫；表達(dá)分析

中圖分類號：S636.901 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）21-0047-10

收稿日期：2023-10-20

基金項目：湖北省自然科學(xué)基金一般面上項目（編號：2020CFB640）；湖北省重點研發(fā)計劃（編號：2021BBA097、2022BBA0064）。

作者簡介：何思曉（1999—），女，湖北應(yīng)城人，碩士研究生，主要從事特色植物資源保護與利用方面的研究。E-mail：2583484211@qq.com。

通信作者：戴希剛，博士，副教授，主要從事園藝植物種質(zhì)資源及遺傳改良與觀賞植物應(yīng)用方面的研究。E-mail：xg_dai@163.com。

植物界中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子包含豐富多樣的功能，并參與植株生長過程中的多個環(huán)節(jié)，其中包括但不限于植物的生長發(fā)育控制、對抗病原體的防御以及面對各種脅迫的適應(yīng)性調(diào)控^［1］。WRKY結(jié)構(gòu)域由60個左右的氨基酸殘基組成，并有1個高度維持的區(qū)域——WRKYGQK，該區(qū)域使WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有與DNA的特殊結(jié)合能力，根據(jù)它們各自的構(gòu)造特點及功能性差異，可將WRKY家族分為多個子類別，如Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe和Ⅲ等子類別。每個不同的子類別都有獨特的結(jié)構(gòu)屬性和功能特質(zhì)，比如針對DNA的結(jié)合特性、調(diào)控機制、生理過程等^［2］。

植物的自然分布與溫度緊密相關(guān)，此外溫度也會控制著季節(jié)長度并左右植物的生長和花期，太低的溫度會擾亂植物細(xì)胞的新陳代謝過程，嚴(yán)重時會降低作物產(chǎn)量甚至造成歉收^［3］。研究發(fā)現(xiàn)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以直接調(diào)控與低溫適應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)，如冷信號傳導(dǎo)途徑中的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白基因、抗寒蛋白基因的表達(dá)等，從而增強植物的耐寒性^［4］。此外，一些WRKY轉(zhuǎn)錄因子還可以與其他轉(zhuǎn)錄因子或信號傳導(dǎo)途徑中的組分相互作用，參與低溫信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。擬南芥中的WRKY46在低溫脅迫下被激活，并通過與其他轉(zhuǎn)錄因子（ICE1、CBFs）間的相互作用，調(diào)節(jié)抗冷性相關(guān)基因的表達(dá)，從而增強植物的耐寒性^［5］。在玉米（Zea mays）中，ZmWRKY4的相對表達(dá)量在低溫脅迫條件下顯著上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，ZmWRKY4通過調(diào)控幾個抗冷相關(guān)基因（如ZmCOBL9、ZmDREB1A）的表達(dá)，提高了玉米植株的耐寒性^［6］。對大豆（Glycine max）的研究發(fā)現(xiàn)，GmWRKY27通過調(diào)控一系列與抗冷相關(guān)的基因（如GmCbf1b、GmDREB1B、GmLEA4、GmCor413IM1等）的表達(dá)，增強了大豆植株的耐寒性^［7］，此外，在蘿卜（Raphanus sativus）、甜橙（Citrus sinensis）、紅薯（Ipomoea batatas）中，WRKY家族參與了對低溫脅迫的應(yīng)答^［8-10］。

菊花腦（Chrysanthemum nankingense）為菊科菊屬植物，也被叫作菊花葉、菊花菜，經(jīng)常作為一種常見蔬菜出現(xiàn)在人們的餐桌上，具有清涼降火的作用^［11］。菊花腦適宜在溫暖的環(huán)境中生長，氣溫過低會導(dǎo)致其生長停滯或減緩，還會增加細(xì)菌、真菌侵染的風(fēng)險，使植株遭受凍傷，影響品質(zhì)，降低產(chǎn)量^［12］。本研究擬使用生物信息學(xué)手段確認(rèn)菊花腦WRKY基因家族成員，了解其結(jié)構(gòu)、保守序列及表達(dá)模式，此外，本研究擬對CnWRKY在低溫環(huán)境下的表達(dá)模式進行分析，篩選出可能在低溫響應(yīng)中發(fā)揮作用的CnWRKYs基因，從而為后續(xù)研究菊花腦如何響應(yīng)低溫脅迫提供基礎(chǔ)，并為相關(guān)抗寒育種工作提供關(guān)鍵性理論支持。

1 材料與方法

1.1 菊花腦WRKY家族成員的鑒定及序列分析

本研究所用目標(biāo)基因組來源自http：//210.22.121.250：8880/asteraceae/download/downloadPage^［13］。用HMMER軟件構(gòu)建WRKY蛋白（PF03106）的隱馬爾可夫模型（HMM）來檢索目標(biāo)物種的全基因組蛋白數(shù)據(jù)庫，再用Pfam數(shù)據(jù)庫、NCBI CDD-Search數(shù)據(jù)庫，從上述篩選出的潛在WRKY蛋白中去除不含有WRKY結(jié)構(gòu)區(qū)域的蛋白，最終得到CnWRKY家族基因^［14］。用TBtools工具估測CnWRKY家族成員蛋白質(zhì)的等電點、相對分子量等理化性質(zhì)^［15］。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

擬南芥的全基因組序列源自NCBI，具體參考已發(fā)表的文章^［16］，共獲得53個擬南芥WRKY序列，用MEGA 7.0軟件將鑒定的菊花腦CnWRKY與擬南芥WRKY蛋白進行雙向比對，用鄰接法構(gòu)建菊花腦與擬南芥的進化樹。

1.3 基因結(jié)構(gòu)和序列分析

從上述數(shù)據(jù)中獲得菊花腦CnWRKY的相關(guān)數(shù)據(jù)，并將其導(dǎo)入TBtools中，對其進行結(jié)構(gòu)分析。提取CnWRKY上端2 000 bp堿基片段，導(dǎo)入PlantCARE中進行分析^［17］。將CnWRKY家族導(dǎo)入在線分析工具MEME中，設(shè)置結(jié)構(gòu)域數(shù)量為5，將結(jié)果文件導(dǎo)入Tbtools中進行繪制^［18］。

1.4 菊花腦WRKY基因的組織表達(dá)分析

從菊花腦基因組數(shù)據(jù)庫中獲得不同組織或器官（莖、葉、花蕾、盤狀花和舌狀花）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)^［19］，用Hisat2軟件將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對到參考基因組上以構(gòu)建index，用featureCounts軟件對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行表達(dá)定量，再用Trinity軟件合并表達(dá)矩陣，得到經(jīng)TPM、TMM標(biāo)準(zhǔn)化的值^［20］，然后用TBtools軟件進行基因組織表達(dá)的可視化。

1.5 菊花腦WRKY基因響應(yīng)低溫脅迫的表達(dá)分析

在NCBI中下載菊花腦在低溫脅迫下的原始 RNA-Seq 數(shù)據(jù)（編號：SRR1237217、SRR1237587、SRR1237609、SRR1237610和SRR1237611）^［19］。利用featureCounts軟件進行計算。對照組（CK）為 22 ℃；處理組RA為4 ℃ 1周；處理組RB1為 -5 ℃ 1 h；處理組RB2為-5 ℃ 2 h；處理組RC1為4 ℃ 1周，再于-5 ℃ 1 h；處理組RC2為4 ℃ 1周，再于-5 ℃ 2 h。進行上述處理后，進行基因表達(dá)的可視化。

用featureCounts軟件得到reads count矩陣，用DESeq2、edgeR軟件進行不同樣本間的差異表達(dá)基因比較。根據(jù)不同低溫相對于對照的4種處理，分析不同組織間WRKYs的表達(dá)差異，分別為RA對CK、RB1對CK、RB2對CK、RC1對CK、RC2對CK^［21］。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊花腦WRKY家族成員

從蛋白數(shù)據(jù)庫中共鑒定到86個潛在的CnWRKY蛋白，去除不含有WRKY結(jié)構(gòu)域的蛋白，剩余的72個蛋白即為WRKY蛋白，根據(jù)位置將其命名為CnWRKY1～CnWRKY72（表1）。CnWRKY編碼蛋白質(zhì)的長度為 81～678 aa，相對分子量為9.46～74.49 ku，等電點預(yù)測值為4.84～10.16，其中35個蛋白為酸性蛋白，37個蛋白為堿性蛋白，脂溶系數(shù)為26.66～72.43，不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，親水系數(shù)都小于0，說明72個CnWRKY蛋白均為不穩(wěn)定的親水性蛋白。

為了研究CnWRKY和擬南芥WRKY（AtWRKY）蛋白的進化關(guān)系，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。結(jié)果表明，72個CnWRKY蛋白被聚為3個亞家族，與AtWRKY蛋白的樹形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和分類結(jié)果一致。同時，CnWRKY蛋白可分為Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe和Ⅲ類別。20個CnWRKY蛋白被歸類為Ⅰ類，共31個CnWRKY蛋白是Ⅱ類，21個CnWRKY被歸類為Ⅲ類。根據(jù)擬南芥WRKY亞族的分類結(jié)果，Ⅱ類中的CnWRKY進一步可被細(xì)分為5個亞族，包括組Ⅱa（4）、Ⅱb（8）、Ⅱc（7）、Ⅱd（6）和Ⅱe（6）。

2.2 菊花腦WRKY基因的結(jié)構(gòu)和啟動子

本研究分析了CnWRKY編碼的mRNA的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它們包含2～9個CDS（編碼序列）區(qū)域（圖2），其中CnWRKY21編碼的mRNA最特殊，包含3個UTR（非翻譯區(qū)），CnWRKY的長度、內(nèi)含子數(shù)量不同，其中內(nèi)含子數(shù)量為2～9個；內(nèi)含子最多的是CnWRKY23，有9個；有8個基因（CnWRKY54、CnWRKY25、CnWRKY71、CnWRKY49、CnWRKY62、CnWRKY37、CnWRKY13、CnWRKY48）只有1個內(nèi)含子，可能與進化過程中內(nèi)含子數(shù)量的變化有關(guān)。同一亞家族的大多數(shù)CnWRKY含有的內(nèi)含子數(shù)量相同，例如groupⅡ-b亞家族的CnWRKY7、CnWRKY8、CnWRKY52、CnWRKY51、CnWRKY55都含有4個內(nèi)含子，group Ⅲ亞家族的CnWRKY57、CnWRKY35、CnWRKY63、CnWRKY67和CnWRKY11都含有2個內(nèi)含子，說明CnWRKY家族具有相似的進化和擴張進程。

通過分析CnWRKY上游的2 000 bp片段，本研究共篩選出15種順式作用元件，順式作用元件種類豐富，50個含有厭氧誘導(dǎo)元件，47個含有節(jié)律控制元件，32個含有MYB結(jié)合位元件，23個含有脅迫響應(yīng)元件，18個有生長激素響應(yīng)元件，17個有低溫響應(yīng)元件等，說明CnWRKY基因在菊花腦響應(yīng)和適應(yīng)各種環(huán)境壓力中扮演著重要角色。

2.3 菊花腦WRKY蛋白的保守基序

如圖4所示，在CnWRKY蛋白上發(fā)現(xiàn)了5個更為保守的基序，每個蛋白保守基序的數(shù)量為1～6個，其中Motif 1、Motif 2、Motif 3出現(xiàn)的次數(shù)較多，基本出現(xiàn)在所有CnWRKY蛋白中，說明它們在CnWRKY蛋白的結(jié)構(gòu)域中具有重要功能。Motif 1、Motif 5基本都在N端，Motif 2、Motif 3基本都在C端，Motif 4在N端、C端都有分布。此外，位于1個亞簇的CnWRKY蛋白具有相似的基序組成，例如groupⅠ亞家族包含全部Motif，group Ⅲ亞家族包含Motif 1、Motif 2、Motif 3，groupⅡ a與groupⅠ均包含Motif 1、Motif4、Motif 5，group Ⅲ與groupⅡb均包含Motif 2。

2.4 菊花腦WRKY的組織表達(dá)分析

用菊花腦數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的RNA-Seq數(shù)據(jù)分析菊花腦不同部位CnWRKY的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，有66個CnWRKY至少在1個檢測組織中表達(dá)，CnWRKY7、CnWRKY13、CnWRKY16、CnWRKY18、CnWRKY53、CnWRKY68基因在上述組織中均未檢測到，其中8個CnWRKY基因未在花蕾中發(fā)現(xiàn)，6個CnWRKY基因未在管狀花中找到，9個CnWRKY基因未在莖中檢測到，9個CnWRKY基因未在舌狀花中觀察到，9個CnWRKY基因未在葉中發(fā)現(xiàn)（圖5）。出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能是存在偽基因或這類基因僅在特定發(fā)育階段或環(huán)境下才會被激活。有32個CnWRKY在莖中有較明顯的表達(dá)，29個CnWRKY在葉中具有高的表達(dá)水平，23個CnWRKY在花蕾中明顯表達(dá)，16個CnWRKY在舌狀花中有高表達(dá)，17個CnWRKY在管狀花中具有較高的表達(dá)［lg（TPM+TMM+1）gt;1］。CnWRKY基因在莖、葉中的相對表達(dá)量較高（圖5）。

2.5 低溫脅迫下菊花腦WRKY基因的表達(dá)

利用菊花腦數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的RNA-Seq數(shù)據(jù)分析菊花腦在不同冷脅迫處理中CnWRKY的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，有63個CnWRKY至少在1個檢測樣品中表達(dá)（TPM+TMMgt;0），其中CnWRKY9、CnWRKY14、CnWRKY16、CnWRKY18、CnWRKY25、CnWRKY35、CnWRKY42、CnWRKY67、CnWRKY6 9個基因在冷脅迫中均未檢測到，CnWRKY6、CnWRKY18、CnWRKY68在菊花腦不同部位的組織中也未檢測到， 可能由于存在假基因或者這些基因只在特定環(huán)境下表達(dá)。在4 ℃、1周冷脅迫處理組RA中，有23個CnWRKY基因具有較高的相對表達(dá)量，在-5 ℃ 1 h處理組的RB1中，有30個CnWRKY基因具有較高的相對表達(dá)量，在處理組RB2中，有31個CnWRKY基因具有較高的相對表達(dá)量。在處理組RC1中，有25個CnWRKY基因具有較高的相對表達(dá)量，處理組RC2檢測到25個CnWRKY基因具有較高的相對表達(dá)量?？傮w上看，一些CnWRKY可能在菊花腦應(yīng)對低溫脅迫中起著顯著作用。

當(dāng)基因豐度的差值倍數(shù)達(dá)2倍或以上，且Plt;0.05時，該基因為候選差值基因。對處理組與對照組進行組間兩兩比較，并繪制火山圖（圖7），共檢測到4個WRKY基因有顯著下調(diào)，在CK vs RA中，CnWRKY38、CnWRKY55、CnWRKY63下調(diào)表達(dá)，相對表達(dá)量受到顯著抑制；在CK vs RC1中，CnWRKY63、CnWRKY31顯著下調(diào)表達(dá)；在CK vs RC2中，CnWRKY38、CnWRKY63、CnWRKY31顯著下調(diào)表達(dá)；在CK vs RB-1、RB-2中，并未發(fā)現(xiàn)CnWRKY表現(xiàn)出顯著差異表達(dá)，表明CnWRKY家族參與了冷馴化后對零下低溫的響應(yīng)，該結(jié)果與任麗萍對菊花腦低溫響應(yīng)基因的研究結(jié)果^［22］一致，即CnWRKY38、CnWRKY63、CnWRKY31、CnWRKY55在葉、花蕾中的相對表達(dá)量較高，可能與葉、花蕾對低溫脅迫更敏感有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，對WRKY的研究已經(jīng)深入到許多作物中，包括擬南芥、綠豆、香樟和菊芋等^［23-25］，然而目前尚未見關(guān)于菊花腦CnWRKY基因的報道。為了系統(tǒng)地闡述菊花腦WRKY基因家族，鑒定出72個包含完整結(jié)構(gòu)域的菊花腦WRKY家族基因，在這些CnWRKY基因家族編碼的蛋白質(zhì)中，所有蛋白均為不穩(wěn)定蛋白、親水蛋白，并且有35個為酸性蛋白， 37個為堿性蛋白，這些性質(zhì)與蛋白的功能有密切關(guān)系。

利用擬南芥中AtWRKY蛋白序列和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將72個菊花腦CnWRKY成員分為：Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe和Ⅲ亞家族，各組分別有20、4、8、7、6、6、21個CnWRKY基因，保守基序分析表明，絕大多數(shù)CnWRKY蛋白含有的特征基序構(gòu)成不同，如Ⅰ類成員特征序列為Motif 5。Ⅱa特征基序是 Motif 4，Ⅱb和Ⅲ類成員大多包含 Motif 1、Motif 2、Motif3，保守基序種類不同說明這些成員在進化歷程中產(chǎn)生了不同程度的變異，這可能與WRKY家族分類及功能調(diào)控有關(guān)。在基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守域分析分類中，各個亞簇成員間都有類似的保守域結(jié)構(gòu)，這與前人研究的另外作物中WRKY結(jié)構(gòu)類似^［26］。本研究對CnWRKY啟動子區(qū)域進行深入分析，發(fā)現(xiàn)一系列參與脅迫相關(guān)的作用元件。如：厭氧誘導(dǎo)元件、節(jié)律控制元件、MYB結(jié)合元件、茉莉酸響應(yīng)元件、 參與防衛(wèi)和脅迫響應(yīng)元件等。這些發(fā)現(xiàn)進一步揭示了CnWRKY基因的表達(dá)可能受到多種因素的調(diào)控，包括光、激素和逆境等。同時這些順式作用元件的存在也暗示了CnWRKY基因可能在植物的生長、 發(fā)育及抗逆等方面發(fā)揮重要作用。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育中有著特別的調(diào)控機制，為了探究菊花腦WRKY基因在生長發(fā)育期間的應(yīng)答機制，本研究對72個菊花腦WRKY基因在5個組織（花蕾、舌狀花、葉、莖和管狀花）中的表達(dá)情況進行系統(tǒng)分析，結(jié)果顯示有44個菊花腦WRKY基因在各組織中均有表達(dá)，因此推測這 44個基因可調(diào)控菊花腦的整個生長發(fā)育過程，其中CnWRKY32、CnWRKY38、CnWRKY55、CnWRKY56、CnWRKY57、CnWRKY63、CnWRKY70在菊花腦葉中的表達(dá)量較高；CnWRKY1、CnWRKY10、CnWRKY27、CnWRKY33在菊花腦莖中的表達(dá)量較高，CnWRKY29、CnWRKY31在花蕾中有較高的表達(dá)量，CnWRKY67僅在花蕾組織細(xì)胞中表達(dá)，在其他組織中未見表達(dá)，說明CnWRKY67主要調(diào)控花蕾的形態(tài)建成，在擬南芥研究中發(fā)現(xiàn)AtWRKY1基因僅在根和花組織中表達(dá)，在其他中未見表達(dá)，枸杞（Lyciumbarbarum）中的LbWRKY3在根部表達(dá)量遠(yuǎn)高于花部，并且隨著植株生長，它的表達(dá)會逐漸增高^［27］。

在遭受生物及非生物脅迫抗性中WRKY在不同組織細(xì)胞中承擔(dān)的生理功能不同，其表達(dá)量也存在差異。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33在低溫環(huán)境下能被快速誘導(dǎo)激活，4 ℃低溫下24 h，AtWRKY25 與AtWRKY26的表達(dá)量逐漸增高，AtWRKY33的表達(dá)為先增加后降低直至消失^［28］。AtWRKY25的同源基因CnWRKY38（基于系統(tǒng)進化分析）在4 ℃ 1周和-5 ℃ 1 h的冷處理中顯著下調(diào)。在對油棕的研究發(fā)現(xiàn)，WRKY1和WRKY7在長期的低溫馴化過程中比短時間冷脅迫表達(dá)量高，說明WRKY1、WRKY7對油棕抗寒性構(gòu)成發(fā)揮調(diào)控作用^［29］。吳玲利等研究發(fā)現(xiàn)大部分CoWRKY基因參與油茶抗逆脅迫響應(yīng)，其中CoWRKY11、CoWRKY14、CoWRKY20、CoWRKY29 和 CoWRKY56在不同逆境下快速誘導(dǎo)表達(dá)^［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，有63個CnWRKY參與菊花腦低溫脅迫響應(yīng)，其中CnWRKY38、CnWRKY63、CnWRKY55、CnWRKY31在長期低溫（4 ℃ 1周）處理中顯著表達(dá)，對菊花腦耐低溫起著調(diào)控作用。

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