神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉對局灶性腦缺血再灌注大鼠PI3K、Akt蛋白表達的影響研究

張樂，李曉艷，李震，李彬，王婭，姜丹，尹世杰

·臨床研究·

神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉對局灶性腦缺血再灌注大鼠PI3K、Akt蛋白表達的影響研究

張樂，李曉艷，李震，李彬，王婭，姜丹，尹世杰

目的觀察神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉對大鼠局灶性腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶PI3K、Akt蛋白表達的影響，探討其可能的作用機制。方法線栓法阻塞大鼠左側(cè)大腦中動脈，制作局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，腦缺血2 h，再灌注3、7、14 d。隨機分為假手術(shù)組、模型組、神經(jīng)節(jié)苷脂組、依達拉奉組、神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉組。分別連續(xù)給藥3、7、14 d，采用免疫組化兩步法檢測缺血半暗帶PI3K、Akt蛋白表達的陽性細胞平均吸收光密度和陽性單位面積。結(jié)果在缺血半暗帶，再灌注各時間點，模型組PI3K、Akt蛋白表達的平均吸收光密度和陽性單位面積均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01);再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂組、依達拉奉組PI3K、Akt蛋白表達平均吸收光密度和陽性單位面積均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01);再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉組PI3K、Akt蛋白表達平均吸收光密度和陽性單位面積均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01);再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂組、依達拉奉組PI3K蛋白表達平均吸收光密度和陽性單位面積(14 d陽性單位面積除外)均低于神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)。再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂組、依達拉奉組Akt蛋白表達平均吸收光密度和陽性單位面積(14 d平均吸收光密度值，7 d依達拉奉組陽性單位面積除外)均低于神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)。結(jié)論神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉能增強缺血半暗帶PI3K、Akt蛋白表達，調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路，抗腦缺血神經(jīng)元凋亡。

神經(jīng)節(jié)苷脂;依達拉奉;腦缺血再灌注;PI3K/Akt信號通路;細胞凋亡

張樂，李曉艷，李震，等．神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉對局灶性腦缺血再灌注大鼠PI3K、Akt蛋白表達的影響研究［J］．實用心腦肺血管病雜志，2015，23(4):142-145．［www．syxnf．net］

Zhang L，Li XY，Li Z，et al．Effect of monosialoganglioside combined with edaravone on expressions of PI3K，Akt protein in ischemic penumbra after focal cerebral ischemia/reperfusion in MCAO rats［J］．Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(4):142-145．

腦血管疾病是中老年人的常見病，以高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高死亡率為特點，已成為當前疾病三大死亡原因之一。依達拉奉是一種自由基清除劑，可以抑制腦細胞神經(jīng)元的過氧化損傷，減輕腦缺血引起的腦水腫和組織損害，是一種有效的顱神經(jīng)保護劑。單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(monosialoganglioside，GM1)具有抗興奮性氨基酸神經(jīng)毒性、抗氧自由基反應(yīng)及抗神經(jīng)元凋亡等作用［1］。腦缺血后，缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)元死亡主要以凋亡為主。近年來，PI3K/Akt信號通路在腦缺血神經(jīng)元凋亡中的調(diào)節(jié)作用備受關(guān)注［2］。本實驗采用線栓法阻塞大腦中動脈制作局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，觀察神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉對模型大鼠缺血半暗帶PI3K、Akt蛋白表達的影響，探討其對腦缺血神經(jīng)元凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1．1 動物分組健康SD大鼠105只(南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SCXK(蘇)2002-0031)，雌雄各半，月齡4個月，體質(zhì)量280～320 g，隨機分為假手術(shù)組、模型組、依達拉奉組、神經(jīng)節(jié)苷脂組、神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉組，每組21只。分別再分為再灌注3、7、14 d 3個亞組。實驗時間為2014-04-16—2014-07-23。

1．2 局灶性腦缺血再灌注模型制備用10%水合氯醛(5．6 ml/kg體質(zhì)量)腹膜腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，頸部正中切口分離出左側(cè)頸總動脈及其分頸外、頸內(nèi)動脈，動脈夾夾閉頸總動脈和頸內(nèi)動脈。結(jié)扎頸外動脈的遠端，其主干上剪一小口，將尼龍線栓沿切口內(nèi)推進18～22 mm，微遇阻力時即到了大腦中動脈起始部，實現(xiàn)左側(cè)大腦中動脈的完全阻塞，此時可移去頸總動脈的動脈夾。剪斷血管外長約10 mm的線栓，留殘端1～2 cm。再灌注時緩慢拉出線栓至頸內(nèi)動脈，大腦中動脈即可恢復(fù)血流。

1．3 藥物與試劑依達拉奉注射液由吉林博大制藥有限責(zé)任公司提供(規(guī)格:30 mg/20 ml，批號:01-140112)，單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂由山東齊魯制藥有限公司提供(規(guī)格:20 mg/2 ml，批號:4010081)。PI3K、Akt抗體、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Envision兩步法試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1．4 給藥劑量與方法依達拉奉注射液，劑量3 mg/kg，應(yīng)用0．9%氯化鈉溶液稀釋成濃度1 mg/ml，腹腔注射，2次/d;單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，劑量20 mg/kg，用0．9%氯化鈉溶液稀釋成濃度1 mg/ml，腹腔注射，1次/d。假手術(shù)組、模型組用等量0．9%氯化鈉溶液腹腔注射。

1．5 取材分別于腦缺血2 h，再灌注3、7、14 d，采用10%水合氯醛麻醉(3．6 ml/kg體質(zhì)量，腹腔注射)大鼠，打開胸腔，于右心耳部剪一小口，從左心室插入導(dǎo)管至主動脈，向內(nèi)快速注入37℃肝素化0．9%氯化鈉溶液250 ml，至右心耳流出液變清亮，然后注入40 g/L多聚甲醛磷酸鹽緩沖液250 ml，灌流固定30 min后斷頭取腦，除去小腦和腦干，取大腦，放入40 g/L多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定1周，脫水、透明、浸蠟，在視交叉前后連續(xù)制作腦部冠狀切片。

1．6 免疫組化兩步法檢測采用Envision兩步法進行免疫組化染色，DAB顯色液顯色，PI3K、Akt抗體稀釋濃度為1∶150，采用正常山羊血清替代一抗作為陰性對照，蘇木素輕度復(fù)染。1．7統(tǒng)計學(xué)方法根據(jù)大鼠腦缺血半暗帶的定位方法［3-4］，

大腦中動脈阻塞的同側(cè)額頂葉皮質(zhì)上部界定為半暗帶的等值觀察區(qū)，采用南京捷達JD-801圖像分析系統(tǒng)，在相同視野下，分別對相鄰切片的PI3K、Akt蛋白免疫反應(yīng)陽性細胞的平均吸收光密度和陽性單位面積進行分析。所得數(shù)據(jù)采用SPSS 16．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(±s)表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉對局灶性腦缺血再灌注大鼠PI3K蛋白表達的影響腦缺血2 h，再灌注各時間點，模型組PI3K蛋白表達陽性單位面積和平均吸收光密度均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01);再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉組PI3K蛋白陽性單位面積和平均吸收光密度均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01);再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂組、依達拉奉組PI3K蛋白表達平均吸收光密度和陽性單位面積均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01);再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂組、依達拉奉組PI3K蛋白表達平均吸收光密度和陽性單位面積(14 d陽性單位面積除外)均低于神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01，見表1)。

假手術(shù)組缺血半暗帶PI3K蛋白見少量表達。腦缺血2 h，再灌注各時間點，模型組PI3K蛋白表達明顯增強，主要表達于半暗帶神經(jīng)元胞漿。再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉組PI3K蛋白表達明顯增強，多在神經(jīng)元胞漿中有著色;再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂組、依達拉奉組PI3K蛋白表達高于模型組，在神經(jīng)元胞漿中表達明顯。再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂組、依達拉奉組PI3K蛋白表達顯著低于神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉組，神經(jīng)元胞漿表達減少(見圖1)。

表1 各組缺血2 h再灌注不同時間缺血半暗帶PI3K蛋白表達陽性細胞的平均吸收光密度值和陽性單位面積比較(±s)Table 1 Comparison of average absorption optical density and positive area of ischemic penumbra PI3K protein-positive cells in the different times after local cerebral ischemia for 2 h in all groups

表1 各組缺血2 h再灌注不同時間缺血半暗帶PI3K蛋白表達陽性細胞的平均吸收光密度值和陽性單位面積比較(±s)Table 1 Comparison of average absorption optical density and positive area of ischemic penumbra PI3K protein-positive cells in the different times after local cerebral ischemia for 2 h in all groups

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0．01;與模型組比較，#P＜0．01;與依達拉奉組比較，▲P＜0．01;與神經(jīng)節(jié)苷脂組比較，△P＜0．01

組別只數(shù)陽性單位面積(×102)平均吸收光密度0．820 0．120±0．008 0．122±0．009模型組21 18．99±0．86*20．24±1．11*18．58±0．72*0．172±0．004*0．188±0．009*0．178±0．009*依達拉奉組21 21．93±1．07#25．90±0．90#24．96±1．75#0．217±0．016#0．252±0．007#0．245±0．006#神經(jīng)節(jié)苷脂組21 22．07±1．04#26．04±0．61#25．02±1．55#0．217±0．011#0．259±0．007#0．249±0．004#依達拉奉+神經(jīng)節(jié)苷脂組21 24．46±0．73#▲△27．63±0．71#▲△26．66±1．28#0．267±0．007#▲△0．276±0．011#▲△0．265±0．006#▲△3 d 7 d 14 d假手術(shù)組21 14．25±0．63 14．09±1．07 14．09±1．07 14．450± 3 d 7 d 14 d

圖1 Envsion兩步法檢測缺血半暗帶PI3K蛋白的表達情況(DAB染色，×400)Figure 1 The expression of ischemic penumbra PI3K protein by Envsion two-step method

2．2 神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉對局灶性腦缺血再灌注大鼠Akt蛋白表達的影響腦缺血2 h，再灌注各時間點，模型組Akt蛋白表達的陽性單位面積和平均吸收光密度均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01);再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉組Akt蛋白表達的陽性單位面積和平均吸收光密度均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01);再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂組、依達拉奉組Akt蛋白表達的平均吸收光密度和陽性單位面積(依達拉奉組3 d陽性單位面積除外)均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01);再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂組、依達拉奉組Akt蛋白表達的平均吸收光密度和陽性單位面積(14 d平均吸收光密度值，7 d依達拉奉組陽性單位面積除外)均低于神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01，見表2)。

假手術(shù)組缺血半暗帶Akt蛋白見少量表達;腦缺血2 h，再灌注各時間點，模型組Akt蛋白表達明顯增強，主要表達于半暗帶神經(jīng)元胞核，顯著高于假手術(shù)組。再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉組Akt蛋白表達明顯增強，高于模型組，多在神經(jīng)元胞核中著色;再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂組、依達拉奉組Akt蛋白表達顯著高于模型組，以神經(jīng)元胞核表達明顯;再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂組、依達拉奉組Akt蛋白表達顯著低于神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉組，神經(jīng)元胞核表達減少(見圖2)。

3 討論

局灶性腦缺血病灶由缺血中心區(qū)和周圍的半暗帶組成，細胞凋亡是腦缺血中最重要的發(fā)病環(huán)節(jié)，缺血再灌注時產(chǎn)生的氧自由基可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)從而改變其功能，細胞膜通透性

增強，線粒體腫脹破裂并誘發(fā)細胞凋亡，其主要發(fā)生在半暗帶。目前認為細胞凋亡是細胞在各種死亡信號刺激后發(fā)生的一系列級聯(lián)激活的主動性細胞死亡過程，表現(xiàn)為凋亡基因的表達和相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。如果能阻止凋亡的發(fā)展，就有可能減輕腦缺血時腦損傷程度，縮小梗死范圍，因此腦缺血后神經(jīng)元凋亡機制以及基于細胞凋亡為靶點的抗腦缺血研究成為研究的熱點［5］。

表2 各組缺血2 h再灌注不同時間缺血半暗帶Akt蛋白表達陽性細胞的平均吸收光密度值和陽性單位面積(±s)Table 2 Comparison of average absorption optical density and positive area of ischemic penumbra Akt protein-positive cells in the different times after local cerebral ischemia for 2 h in all groups

表2 各組缺血2 h再灌注不同時間缺血半暗帶Akt蛋白表達陽性細胞的平均吸收光密度值和陽性單位面積(±s)Table 2 Comparison of average absorption optical density and positive area of ischemic penumbra Akt protein-positive cells in the different times after local cerebral ischemia for 2 h in all groups

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0．01;與模型組比較，#P＜0．01;與依達拉奉組比較，▲P＜0．01;與神經(jīng)節(jié)苷脂組比較，△P＜0．01

組別只數(shù)陽性單位面積(×102)平均吸收光密度．008 0．107±0．011 0．107±0．011模型組21 16．30±0．71*16．78±0．50*15．99±0．55*0．160±0．010*0．166±0．006*0．160±0．004*依達拉奉組21 17．74±1．64 22．22±0．83#18．94±0．91#0．198±0．014#0．224±0．010#0．216±0．014#神經(jīng)節(jié)苷脂組21 18．39±0．68#21．82±0．68#21．56±0．78#0．198±0．012#0．225±0．010#0．213±0．009#依達拉奉+神經(jīng)節(jié)苷脂組21 22．02±0．93#▲△23．24±1．11#△22．52±0．85#▲△0．230±0．016#▲△0．241±0．011#▲△0．224±0．012 3 d 7 d 14 d假手術(shù)組21 10．85±0．74 10．78±0．72 10．74±1．04 0．110±0 3 d 7 d 14 d #

圖2 Envsion兩步法檢測缺血半暗帶Akt蛋白的表達情況(DAB染色，×400)Figure 2 The expression of ischemic penumbra Akt protein by Envsion two-step method

PI3K/Akt信號通路是近年來研究的一條重要的抗凋亡信號通路，PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，當受到來自G蛋白耦聯(lián)受體或酪氨酸激酶的信號后，PI3K的p110亞基與p85亞基結(jié)合而活化Akt，激活的Akt能夠向細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運，活化的Akt通過磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白，進而調(diào)節(jié)細胞的凋亡、增殖、分化、遷移等過程。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)在缺血半暗帶，再灌注各時間點，模型組PI3K、Akt蛋白平均吸收光密度和陽性面積高于假手術(shù)組，說明局灶性腦缺血再灌注存在PI3K/Akt信號通路變化。有學(xué)者研究大鼠腦缺血再灌注缺血半暗帶側(cè)神經(jīng)元凋亡及p-Akt (Ser473)表達情況，發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血再灌注側(cè)p-Akt (Ser473)表達增加［6］。本研究還發(fā)現(xiàn)，再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉組PI3K、Akt蛋白平均吸收光密度和/或陽性面積高于模型組;再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂組、依達拉奉組PI3K、Akt蛋白平均吸收光密度和陽性面積多高于模型組;再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉組PI3K、Akt蛋白平均吸收光密度和陽性面積多高于神經(jīng)節(jié)苷脂組或依達拉奉組，推測神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉能增強缺血半暗帶PI3K、Akt蛋白表達，調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路，抗腦缺血神經(jīng)元凋亡。但PI3K/Akt信號通路及其相關(guān)分子如何實現(xiàn)對神經(jīng)元凋亡的調(diào)控以及分子機制有待進一步的研究。

［1］杜江，鐵欣昕，歐紹武．神經(jīng)節(jié)苷脂對腦缺血再灌注大鼠海馬Fas表達的影響［J］．天津醫(yī)藥，2013，41(7):686-688．

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Effect of M onosialoganglioside Combined w ith Edaravone on Expressions of PI3K，Akt Protein in Ischem ic Penum braafter Focal Cerebral Ischem ia/Reperfusion in MCAO rats

ZHANG Le，LI Xiao-yan，LI Zhen，et al．
Anhui Province No．2 People's Hospital，Hefei 200041，China

Objective To investigate the effect of Monosialoganglioside and Edaravone on expressions of PI3K，Akt protein in ischemic penumbra after local cerebral ischemia/reperfusion in intraluminal thread occlusion of the middle cerebral artery(MCAO)rats and its related mechanism．M ethods The local cerebral ischemia/reperfusion model was established by intraluminal thread occlusion of the middle cerebral artery．The animals were randomly divided into pseudo surgery group(sham group)，model(MCAO)group，Monosialogangli oside group，Edaravone group and Monosialoganglioside combined Edaravone group．Using the techniques of immuno-histochemical sraining，the expressions of PI3K，Akt protein were observed at 3，7 and 14 days in ischemic penumbra．Results The A value and positive area of PI3K，Akt protein expression in model group were higher than those in sham group(P＜0．01)．The A value and positive area of PI3K，Akt expressions in Monosialoganglioside group and Edaravone group were higher than those in MCAO group(P＜0．01)．Compared with the model group，the A value and positive area of PI3K，Akt expressions increased more significantly in Monosialoganglioside combined Edaravone group(P＜0．01)．The A value and positive area of PI3K protein expression reduced more obviously in Monosialoganglioside group and Edaravone group than in Monosialoganglioside combined Edaravone group(except the A value and positive area of PI3K protein expression on the 14th day)(P＜0．01)．Compared with the Monosialoganglioside combined Edaravone group，the A value and positive area of Akt protein expression reduced significantly in the Monosialoganglioside group and Edaravone group(except the A value on the 14th day and the positive area on the 7th day in the Edaravone group)(P＜0．01)．Conclusion Monosialoganglioside and Edaravone can resist neural cell apoptosis，regulate PI3K/Akt signal transduction pathway by enhancing PI3K，Akt protein expression after local cerebral ischemia/reperfusion in MACO rats．

Monosialoganglioside;Edaravone;Brain ischemia/reperfusion;PI3K/Akt signal transduction pathway; Apoptosis

R 743

B

10．3969/j．issn．1008-5971．2015．04．049

2015-01-20;

2015-03-20)

(本文編輯:崔沙沙)

230041安徽省合肥市，安徽省第二人民醫(yī)院