凝結(jié)芽孢桿菌抑菌物質(zhì)的理化特性研究

趙鈺，傅玲琳，王彥波

（浙江工商大學(xué)食品質(zhì)量安全系，浙江省食品微生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，浙江杭州310018）

凝結(jié)芽孢桿菌抑菌物質(zhì)的理化特性研究

趙鈺，傅玲琳，王彥波*

（浙江工商大學(xué)食品質(zhì)量安全系，浙江省食品微生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，浙江杭州310018）

以益生菌凝結(jié)芽孢桿菌Bacillus coagulans LL1103為對象，研究了其生長情況與pH值和抑菌活性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其最佳抑菌發(fā)酵時間為18h。制備了其抑菌產(chǎn)物粗品并測定其抑菌譜，結(jié)果表明，抑菌產(chǎn)物對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有明顯的抑菌效果，具有廣譜抗菌性。隨后對抑菌產(chǎn)物粗品的理化性質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)它在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，最適溫度37℃，最適pH=6.0下具有最強(qiáng)的抑菌活性。此外，進(jìn)行了抑菌物質(zhì)的初步鑒定，在排除酸性末端產(chǎn)物和菌體的干擾后，用蛋白酶K等多種蛋白酶和過氧化氫酶去處理抑菌產(chǎn)物粗品，發(fā)現(xiàn)其對蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶較敏感，對氧化氫酶不敏感，初步推斷抑菌物質(zhì)的主要成分是對蛋白酶敏感的細(xì)菌素類物質(zhì)。

益生菌；凝結(jié)芽孢桿菌；抑菌物質(zhì)；細(xì)菌素

水產(chǎn)品營養(yǎng)物質(zhì)豐富，在加工和貯藏過程中極易因微生物的繁殖而腐敗變質(zhì)。目前，在全球有近25%的食品因微生物問題而被污染，水產(chǎn)品也包括在內(nèi)[1]。目前控制微生物污染主要采用化學(xué)方法和物理方法[2]，化學(xué)方法是在食品中加入防腐劑等化學(xué)物質(zhì)，物理方法則主要是對食品進(jìn)行超高壓、電離輻射、臭氧等處理，這兩種方法不同程度上容易引起二次污染、降低食品品質(zhì)等問題[3]，因此，開發(fā)相對安全的微生物污染控制及防腐保鮮技術(shù)已成為目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。研究表明，乳酸菌可廣泛應(yīng)用于乳制品、蔬菜、水果、飼料及肉制品的發(fā)酵與防腐保鮮中。凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）[4]又稱為芽孢乳酸菌，是一類認(rèn)為“普遍安全的”桿菌類乳酸菌[5-6]，對人體無害，且不改變食品自身的特性，具有較好的應(yīng)用前景。研究表明，許多乳酸菌除產(chǎn)生乳酸、乙酸和過氧化氫外，還可產(chǎn)生一些具有抑菌活性多肽物質(zhì)——細(xì)菌素（bacteriocin）[7-9]，具有可抑制腐敗菌和致病菌生長的能力，進(jìn)而對包括水產(chǎn)品在內(nèi)的食品等起到防腐保鮮的效果[10-12]。凝結(jié)芽孢桿菌同樣可以產(chǎn)生乳酸、凝結(jié)素等物質(zhì)[13]。本實驗室自行分離得到的凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）LL1103是乳酸菌的一種，除了具有乳酸菌的特點(diǎn)外，還具有抗逆性強(qiáng)、耐高溫、易儲存等生物學(xué)特性，彌補(bǔ)了一般乳酸菌的不足。鑒于此，我們研究了凝結(jié)芽孢桿菌抑菌相關(guān)的理化特性，并對其抑菌物質(zhì)做了初步鑒定，旨在為后續(xù)的應(yīng)用研究和水產(chǎn)品防腐保鮮劑開發(fā)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

凝結(jié)芽孢桿菌LL1103：浙江工商大學(xué)食品微生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室分離篩選自養(yǎng)殖大黃魚，并保藏備用。

指示菌：大腸桿菌（E.coli）、腐敗希瓦氏菌（Shewanella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）、沙門氏菌（Salmonella）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等。

1.1.2 主要藥品和試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、過氧化氫酶：美國Sigma公司。

HCl、NaOH、乳酸等試劑均為分析純級。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

臺式恒溫振蕩器THZ-D：太倉市實驗設(shè)備廠；pH計UltraBASIC：DENVER INSTRUMENT公司；超凈工作臺SW-CT-1FD：蘇州凈化公司；高速冷凍離心機(jī)Allegra X-30R Centrifuge：BECKMANCOULTER公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-50FBS：上海申安醫(yī)療器械廠；智能生化培養(yǎng)箱LRH系：上海一恒科技有限公司；酶標(biāo)儀Versmax：Molecular Devices公司；超純水裝置：Millipore公司；電子天平：DENVER INSTRUMENT公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司；超低溫冰箱：SANYO公司；4℃冰箱：西門子公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4：常州朗越儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化及培養(yǎng)

超低溫冰箱中取出本實驗室保存的凝結(jié)芽孢桿菌菌種，于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種培養(yǎng)，37℃條件下，培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)皿中挑取單一菌落并接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)18 h。

指示菌的培養(yǎng)：按2%的接種量接種在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為30℃，24 h。

1.2.2 凝結(jié)芽孢桿菌抑菌產(chǎn)物粗品的制備

將活化的凝結(jié)芽孢桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)18 h后，對發(fā)酵液高速冷凍離心（1 2000 r/min，20min，4℃），取上清液過0.22μm濾膜即為抑菌產(chǎn)物粗品，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抑菌效果的測定

抑菌試驗采用牛津杯法：利用0.85%的生理鹽水將指示菌制成約1×107cfu/mL（OD600≈0.3）的菌懸液備用，待營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基凝固后，吸取200μL指示菌菌懸液于平板上，用涂布棒涂布均勻，倒置培養(yǎng)1 h后放置牛津杯并在杯中加入抑菌產(chǎn)物粗品200μL，在4℃冰箱中擴(kuò)散12 h，將培養(yǎng)皿在30℃下恒溫培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。其中牛津杯內(nèi)徑約為6mm，每組均設(shè)定3個重復(fù)，用抑菌圈平均直徑（mm）來評價抑菌活性。

1.2.4 實驗設(shè)計

1.2.4.1 生長曲線、pH、抑菌能力的關(guān)系

將活化的凝結(jié)芽孢桿菌接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，每隔2 h取樣，用未接種的MRS液體培養(yǎng)基做空白對照，測定24小時內(nèi)的OD600和pH，并測定每個時間點(diǎn)的抑菌能力。

1.2.4.2 抑菌譜

采用牛津杯法對各指示菌做抑菌試驗，以抑菌圈平均直徑（mm）來描述抑菌效果。

1.2.4.3 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)對抑菌物質(zhì)粗品抑菌能力的影響

將活化的凝結(jié)芽孢桿菌分別接種于NB培養(yǎng)基和MRS液體培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)18 h，制備抑菌物質(zhì)粗品，測定抑菌活性，對比兩者差異。

1.2.4.4 不同pH對抑菌物質(zhì)粗品抑菌能力的影響

用3mol/LHCl和3mol/LNaOH調(diào)節(jié)抑菌物質(zhì)粗品pH分別為：2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，37℃下處理1 h，再調(diào)回pH至6.0，做牛津杯抑菌實驗，觀察抑菌圈大小。

1.2.4.5 不同溫度對抑菌物質(zhì)粗品抑菌能力的影響

將抑菌物質(zhì)粗品分別在-20、4、37、80、121℃處理30min后測定抑菌能力，觀察抑菌大小的變化。

1.2.4.6 抑菌物質(zhì)的初步鑒定

研究有機(jī)酸的影響：用與抑菌物質(zhì)粗品同樣pH的乳酸作空白對照做抑菌實驗，加以比較。

研究過氧化氫的影響：采用過氧化物酶法。

研究菌體及殘留細(xì)胞的影響：將抑菌物質(zhì)粗品用微孔濾膜過濾除菌后做抑菌實驗，與全菌液進(jìn)行抑菌能力對比。

研究蛋白酶和過氧化氫酶的影響：用3mol/LHCl和3mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和過氧化氫酶的最適pH，抑菌物質(zhì)粗品與酶在37℃水浴條件下反應(yīng)30min，再調(diào)回pH至6.0，研究不同酶處理對抑菌物質(zhì)粗品抑菌活性的影響，以未經(jīng)處理的凝結(jié)芽孢桿菌抑菌產(chǎn)物粗品為對照組。通過觀察對照組和處理組抑菌圈大小的差異來判斷該抑菌物質(zhì)是否為蛋白類物質(zhì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 生長曲線、pH、抑菌能力的關(guān)系

凝結(jié)芽孢桿菌在培養(yǎng)后4 h左右進(jìn)入對數(shù)期，菌體濃度開始隨時間指數(shù)型快速生長；培養(yǎng)后15 h左右，菌體開始進(jìn)入穩(wěn)定期，但穩(wěn)定期維持時間不長；18 h之后，由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，代謝產(chǎn)物的積累，菌體的死亡率慢慢大于繁殖率，菌體進(jìn)入衰亡期。

凝結(jié)芽孢桿菌在MRS液體培養(yǎng)基中的生長過程和pH變化過程如圖1所示。

圖1生長曲線與pH的關(guān)系Fig.1 Correlation between pH and growth antibacterial of bacterial strains

隨著菌體進(jìn)入對數(shù)期，菌液的pH從7.25左右開始迅速下降，證明有菌體生長過程中有酸分泌；且菌體在生長到6 h～8 h內(nèi)菌體生長速度放緩，這可能是pH的降低暫時抑制了部分菌體的生長。隨后，pH隨著時間的延長而逐漸降低，培養(yǎng)到16 h時降到最低，但穩(wěn)定在6.0左右。

圖2顯示的則是凝結(jié)芽孢桿菌生長曲線和抑菌能力之間的關(guān)系。

圖2 生長曲線與抑菌產(chǎn)物生成的關(guān)系Fig.2 Correlation between production of products and growth of bacterial strains

培養(yǎng)后0～6 h內(nèi)，凝結(jié)芽孢桿菌菌液并未表現(xiàn)出任何的抑菌活性；從8 h開始，菌液的抑菌活性隨時間不短增加，并在18 h達(dá)到最高峰，隨后便開始有所下降，但仍然具有明顯抑菌活性。

綜合圖1、圖2，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH從一開始下降至6.1時，凝結(jié)芽孢桿菌菌液仍未出現(xiàn)任何抑菌活性，故酸可能不是凝結(jié)芽孢桿菌抑菌的主要成分，還需要進(jìn)一步的鑒定。但我們可以確定的是，對該凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌活性進(jìn)行研究，最佳發(fā)酵時間應(yīng)選在18 h左右。

2.2 抑菌產(chǎn)物粗品抑菌譜

凝結(jié)芽孢桿菌抑菌產(chǎn)物粗品對各指示菌的抑制效果見表1。

表1 抑菌產(chǎn)物粗品抑菌譜Table1 Inhibitory spectrum of the antibacterial crude extract

結(jié)果表明抑菌產(chǎn)物粗品對革蘭氏陰性和陽性菌均有抑制作用，其中對常見的幾種食源性致病菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腐敗希瓦氏菌等抑菌效果十分明顯，對枯草芽孢桿菌和沙門氏菌也有一定程度抑制作用。這說明凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌產(chǎn)物具有廣譜抗菌作用，這也讓我們之后對其抗菌物質(zhì)的研究有了更深遠(yuǎn)的意義。

2.3 不同培養(yǎng)基、pH、溫度對抑菌產(chǎn)物粗品抑菌能力的影響

圖3 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下抑菌物質(zhì)粗品抑菌能力差異Fig.3 Effect on the antimicrobial activity of antibacterial crude extract incubated from different medium

圖3顯示的是凝結(jié)芽孢桿菌活化后分別接種到NB培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h后分別制取抑菌產(chǎn)物粗品，再選擇大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腐敗希瓦氏菌作為指示菌測定抑菌活性。

如圖所示，在MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下抑菌產(chǎn)物粗品的抑菌活性顯著高于NB培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下抑菌產(chǎn)物粗品的抑菌活性（P＜0.05）。我們分析在MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，有更多的抑菌分子被合成和釋放出來，且抑菌效果明顯。因此，制備凝結(jié)芽孢桿菌抑菌產(chǎn)物粗品的時候，用MRS液體培養(yǎng)基來發(fā)酵，能獲得抑菌效果更好的粗品，含有更多的抑菌物質(zhì)，便于我們之后對抑菌物質(zhì)的鑒定和應(yīng)用。

從圖4中，我們可以看出凝結(jié)芽孢桿菌抑菌物質(zhì)粗品在不同pH處理之后，在不同指示菌中抑菌活性的變化規(guī)律。

圖4 不同pH對抑菌物質(zhì)粗品抑菌能力的影響Fig.4 Effect on the antimicrobial activity of antibacterial crude extract treated with different pH

針對三種不同指示菌來說，不同pH處理下，抑菌活性大小均無顯著差異（P＞0.05）。我們發(fā)現(xiàn)pH=6.0時，抑菌產(chǎn)物粗品的抑菌活性最大，且結(jié)合之前測定生長曲線時測定的發(fā)酵液pH變化規(guī)律，我們認(rèn)為該菌抑菌產(chǎn)物抑菌效果最佳的pH在6.0左右。從圖5中，我們還發(fā)現(xiàn)，pH=2.0時抑菌產(chǎn)物粗品的抑菌活性要大于pH=4.0時，這可能是由于pH=2是酸性過大，它本身的酸性就對指示菌產(chǎn)生了抑菌作用。當(dāng)pH=10.0時，抑菌產(chǎn)物粗品的抑菌活性完全消失，我們認(rèn)為是堿性過大，有可能使我們抑菌物質(zhì)中的酸被中和或抑菌蛋白被抑制。

圖5結(jié)果顯示，凝結(jié)芽孢桿菌抑菌物質(zhì)粗品經(jīng)不同溫度處理后抑菌活性所呈現(xiàn)的規(guī)律。

圖5 不同溫度對抑菌物質(zhì)粗品抑菌能力的影響Fig.5 Effect on the antimicrobial activity of antibacterial crude extract treated with different temperature

對3種不同指示菌來說，不同溫度處理后，抑菌活性大小均無顯著差異（P＞0.05）。37℃條件下處理的抑菌產(chǎn)物粗品具有最高的抑菌活性，故把它作為最佳抑菌溫度。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度達(dá)到80℃時，抑菌產(chǎn)物還存在較低的抑菌活性，但當(dāng)121℃處理之后，抑菌活性完全消失，證明抑菌物質(zhì)以完全失活。但我們發(fā)現(xiàn)在溫度較低的時候，抑菌產(chǎn)物仍然保有活性，特別是在4℃的條件下，抑菌活性還保持在一個比較好的水平，這也說明了我們的這種抑菌物質(zhì)在冷藏保鮮[14-15]中可以作為一種生物保鮮劑來抑制腐敗微生物的生長，具有實際應(yīng)用的前景與價值。

2.4 抑菌物質(zhì)的初步鑒定

乳酸菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)種類繁多，包括蛋白質(zhì)類和非蛋白質(zhì)類物質(zhì)。其中蛋白質(zhì)類物質(zhì)主要是細(xì)菌素，非蛋白質(zhì)類抑菌物質(zhì)主要包括有機(jī)酸、過氧化氫等。因此本研究設(shè)計了對抑菌產(chǎn)物粗品的多種處理方式，并以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腐敗希瓦氏菌為指示菌來初步鑒定凝結(jié)芽孢桿菌抑菌產(chǎn)物的組成。

酸性末端產(chǎn)物對抑菌活性的干擾：凝結(jié)芽孢桿菌是乳酸菌中的一種，而乳酸菌生長代謝過程中所產(chǎn)生少量乙酸和丙酸等有機(jī)酸，但大量生成乳酸，因此主要排除乳酸對抑菌效果的影響。抑菌產(chǎn)物粗品的pH為6.0左右，為了排除酸及酸性末端產(chǎn)物的干擾，用相同pH的乳酸來做對照。結(jié)果表明，相同pH的乳酸對改指示菌沒有任何抑菌作用。說明此胞外產(chǎn)物中含有除有機(jī)酸之外的其他抑菌活性物質(zhì)存在。

菌體及殘留細(xì)胞對抑菌活性的影響：分別以最佳發(fā)酵條件下的菌液和抑菌產(chǎn)物粗品做抑菌實驗，對比不同指示菌條件下兩者是否存在顯著差異。結(jié)果如圖6所示，發(fā)現(xiàn)兩個組的抑菌活性差異不顯著（P＞0.05），說明殘留的菌體及菌體細(xì)胞對實驗不產(chǎn)生明顯影響，主要是其他物質(zhì)在起抑菌作用。

排除過氧化氫的干擾：采用過氧化物酶法對凝結(jié)芽孢桿菌的發(fā)酵過程進(jìn)行檢測。結(jié)果表明對菌株在發(fā)酵的4、8、12、16、20、24 h進(jìn)行過氧化氫檢測時，抑菌產(chǎn)物粗品反應(yīng)后均無紅色染料物質(zhì)形成，說明沒有過氧化氫的產(chǎn)生，排除了過氧化氫與抑菌活性的關(guān)系。

圖6 抑菌物質(zhì)粗品和菌液抑菌能力對比Fig.6 Comparison between the antimicrobial activity of antibacterial crude extract and fermented liquid

不同酶處理：圖7顯示了抑菌產(chǎn)物粗品在經(jīng)過不同酶的處理之后，對3種不同指示菌的抑菌活性，對照組為未經(jīng)處理的抑菌產(chǎn)物粗品。

圖7 不同酶對抑菌物質(zhì)粗品抑菌能力的影響Fig.7 Effect on the antimicrobial activity of antibacterial crude extract treated with different enzymes

從圖7中我們不難看出，在經(jīng)歷了蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶的處理之后，處理組的抑菌活性較對照組顯著降低（P＜0.05）；而經(jīng)過過氧化氫酶處理后，處理組的抑菌活性雖然有細(xì)微下降，但差異十分不顯著（P＞0.05）。綜合來說，抑菌產(chǎn)物粗品對蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶均敏感，對過氧化氫酶的敏感性則較低，這不僅說明抑菌物質(zhì)不是過氧化氫或細(xì)菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生者過氧化氫量極低，更說明了我們的凝結(jié)芽孢桿菌能起到抑菌作用，很有可能是它在分泌一種胞外的細(xì)菌素類物質(zhì)。

3 討論

我們的研究對象凝結(jié)芽孢桿菌（Bacilluscoagulans）LL1103[16]分離自養(yǎng)殖大黃魚，其抑菌產(chǎn)物粗品對大腸桿菌、腐敗希瓦氏菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌等水產(chǎn)品中主要腐敗菌具有良好抑菌效果，對沙門氏菌等這些常見食品腐敗菌也都表現(xiàn)一定抑菌效果。這說明該菌株分泌的抗菌物質(zhì)在食品中作為生物保鮮劑尤其是水產(chǎn)品中的生物防腐保鮮劑存在廣闊前景。

在對其抑菌產(chǎn)物粗品的理化性質(zhì)進(jìn)行分析的過程中，我們發(fā)現(xiàn)抑菌產(chǎn)物粗品的最佳抑菌溫度在37℃，但發(fā)現(xiàn)其在4℃的條件下仍保持了較高的抑菌活性，這說明該物質(zhì)在水產(chǎn)冷藏保鮮的應(yīng)用中具有一定的潛力。此外，有研究表明，水產(chǎn)品在保鮮過程中pH處于偏中性條件，后期達(dá)到弱堿性條件，而大多數(shù)乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素在堿性條件下抑菌活性很低，抑制不了腐敗菌的生長。我們研究中的抑菌產(chǎn)物最適pH為6.0，而在pH=8.0時仍保有抑菌活性，這說明我們的菌在水產(chǎn)保鮮中有了更大的可能。

最后在排除酸性末端產(chǎn)物、菌體干擾和過氧化氫的干擾后，我們用蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶處理了抑菌產(chǎn)物粗品，發(fā)現(xiàn)其抑菌活性都受到很大的影響，代謝物質(zhì)中含有對蛋白酶敏感的細(xì)菌素類物質(zhì)。

1998年，B.Hyronimus[17]等發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌I4菌株能分泌抗菌肽物質(zhì)——凝結(jié)素。凝結(jié)素經(jīng)60℃處理90min，pH在4.0～8.0的條件下，仍保持穩(wěn)定且不受α-淀粉酶、酯酶和有機(jī)溶劑（10%，V/V）的影響，對腸球菌、明串珠球菌、李斯特菌和小球菌等有抑制作用。2008年，Riazi[18]等在Bacillus coagulans ATCC 7050中發(fā)現(xiàn)了一種新型的抗菌蛋白lactosporin，對該抗菌蛋白研究表明其能有效的抑制某些致病菌的生長，并且對人身體安全。同年，Emad[19]等在廢水中篩選出一株具有較強(qiáng)抗菌活性的凝結(jié)芽孢桿菌，其能夠抑制革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌，也能夠抑制酵母菌的生長。對該抑菌物質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)其是一種分子量在7.5 KDa的類細(xì)菌素，由于其抑菌的廣譜性和熱穩(wěn)定性可以應(yīng)用于食品的防腐。2001年，Cintas[20]等根據(jù)細(xì)菌素結(jié)構(gòu)、分子量的大小、熱穩(wěn)定性和抑菌譜等方面的不同，把乳酸菌細(xì)菌素分為硫醚抗生素、不包含羊毛硫氨酸的小分子多肽類細(xì)菌素、大的熱不穩(wěn)定蛋白質(zhì)類細(xì)菌素3類。

因此，對我實驗室凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵得到的抑菌物質(zhì)中疑似存在的細(xì)菌素還需要進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化及鑒定，為其在食品中的防腐保鮮再建立起一定的理論基礎(chǔ)。

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Physiochemical Properties of Antibacterial Substance Produced by Bacillus coagulans LL1103

ZHAO Yu，F(xiàn)U Ling-lin，WANG Yan-bo*
（Food Quality and Safety Department，Zhejiang Gongshang University，Key Laboratory of Microbial Technology of Zhejiang Province，Hangzhou 310018，Zhejiang，China）

In the present study，the relationship among growth condition，pH and bacteriostatic activity of probiotics Bacillus coagulans LL1103 was examined，and the optimal fermentation time for antibacterial substance producing was 18 h.The antibacterial crude extract was then prepared for antibacterial spectrummeasuring.The results showed that the extract had a broad spectrum of significant bacteriostatic activity，including activities against gram-negative bacteria and gram-positive bacteria.In addition，the maximal bacteriostatic activity of this extract was observed by incubating B.coagulans LL1103 in MRS medium at37°C，pH 6.0.Furthermore，we found that antibacterial product was sensitive to protease K，trypsin and pepsin，but not hydrogen oxidation enzymes.Thus，we speculated that the main ingredients of antibacterial product was a kind of bacteriocin which was sensitive to proteases.

probiotics；Bacillus coagulans；antibacterial substance；bacteriocin

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.007

2014-09-02

趙鈺（1989—），男（漢），碩士，研究方向：食品質(zhì)量與安全。

*通信作者：王彥波（1978—），男（漢），教授，博士，致力于水產(chǎn)品質(zhì)量與安全的研究。