基于Taq-Man探針的多重qPCR檢測DuCV?DEV?NGPV方法的建立與應用

摘要 ［目的］建立一種快速、特異的鴨圓環(huán)病毒（DuCV）、鴨腸炎病毒（DEV）、新型鵝細小病毒（NGPV）的多重熒光定量PCR方法。［方法］針對DuCV、DEV、NGPV的基因保守區(qū)域序列，設(shè)計合成3對特異性引物及3種熒光基團標記的Taq-Man探針。構(gòu)建重組質(zhì)粒標準品，優(yōu)化反應條件。建立針對DuCV、DEV、NGPV的多重熒光定量PCR檢測方法。［結(jié)果］該方法能同時鑒別檢測DuCV、DEV、NGPV，并且與其他常見鴨病毒病不發(fā)生交叉反應。對DuCV、DEV、NGPV最低檢出限均為2.5×101 copies/μL。該方法重復性好，組間和組內(nèi)試驗變異系數(shù)低于1.0%。用該方法檢測150份臨床樣本，結(jié)果顯示，DuCV、DEV、NGPV的陽性率分別為32.0%（48份）、23.3%（35份）和18.7%（28份），DuCV和DEV混合感染率為4.6%（7份），DuCV和NGPV混合感染率為8.6%（13份），總陽性率為87.3%（131份），未檢出DEV和NGPV混合感染的結(jié)果。與常規(guī)PCR檢測方法比較，陽性符合率為100%。［結(jié)論］該研究建立的基于Taq-Man探針的多重熒光定量PCR方法能夠同時、快速、定量檢測DuCV、DEV、NGPV。較普通PCR更敏感，實用性更強，有效避免了多次檢測耗時長、費用高的問題，為DuCV、DEV、NGPV的監(jiān)測和防控提供了有效可靠的檢測技術(shù)。

關(guān)鍵詞 鴨圓環(huán)病毒；鴨腸炎病毒；新型鵝細小病毒；Taq-Man探針；熒光定量PCR

中圖分類號 S 851.34 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）22-0178-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.22.038

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Establishment and Application of Taq-Man Probe-based Multiplex qPCR Method for the Detection of DuC6PbUcumcv0MgDhVdNjHUIKYPRaRCix+Nn2aqW5m/hn4=V，DEV and NGPV

YANG Meng-hao LI Li-yuan1，XIAO Ya-qing^1，3 et al

（1.Poultry Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan，Shandong 250100;2.College of Animal Science and Technology，Shandong Agricultural University，Tai’an，Shandong 271000;3.Hebei Agricultural University，Baoding，Hebei 071000）

Abstract ［Objective］To establish a rapid and specific multiplex fluorescence quantitative PCR method for duck circovirus （DuCV），duck enteritis virus （DEV） and novel duck parvovirus （NGPV）.［Method］Three pairs of specific primers and three fluorophore-labeled Taq-Man probes were designed and synthesized for the conserved region sequences of DuCV，DEV and NGPV.Recombinant plasmid standards were constructed，the reaction conditions were optimized，and multiplex quantitative PCR detection methods for DuCV，DEV and NGPV were established.［Result］The method could identify DuCV，DEV and NGPV at the same time，and did not cross-react with other common duck virus diseases.The minimum detection amount of DuCV，DEV and NGPV was 2.5×101 copies/μL.The method was reproducible，and the coefficient of variation between and within groups was less than 1.0%.A total of 150 clinical samples were tested with this method，the results showed that the positive rates of DuCV，DEV and NGPV were 32% （48 cases），23.3% （35 cases） and 18.7% （28 cases），respectively，the mixed infection rates of DuCV and DEV were 4.6% （7 cases），the mixed infection rate of DuCV and NGPV was 8.6% （13 cases），and the total positive rate was 87.3% （131 cases），and the results of mixed infection of DEV and NGPV were not detected.Compared with the conventional PCR detection method，the positive coincidence rate was 100%.［Conclusion］A multiplex real-time PCR method based on Taq-Man probes was established to detect DuCV，DEV，NGPV simultaneously，quickly and quantitatively.It is more sensitive and practical than ordinary PCR，which effectively avoids the problems of time-consuming and cost-effective multiple tests，and provides an effective and reliable detection technology for the monitoring and prevention of DuCV，DEV and NGPV.

Key words Duck circovirus （DuCV）;Duck enteritis virus （DEV）;Novel goose parvovirus （NGPV）;Taq-Man probes;RT-PCR

中國的水禽養(yǎng)殖業(yè)在過去的幾十年中不斷發(fā)展，其規(guī)模也在不斷擴大，目前中國的水禽養(yǎng)殖總量位居世界第一，但隨著規(guī)模不斷擴大，隨之而來的就是疫病不斷增多，水禽疫病不僅嚴重影響水禽飼養(yǎng)業(yè)的發(fā)展，同時也是水禽產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的桎梏，其中最大的障礙就是水禽病毒性疫病。

鴨圓環(huán)病毒（DuCV）首次被發(fā)現(xiàn)是在2003 年的德國^［1］ 。感染DuCV的鴨子表現(xiàn)出羽毛脫落、生長遲緩、體重降低和飼料轉(zhuǎn)換率低等特征，嚴重影響了鴨養(yǎng)殖業(yè)^［2］ 。DuCV感染可導致機體產(chǎn)生免疫抑制，繼發(fā)細菌性病原的二次感染，導致鴨的病死率升高^［3］ 。近年來，DuCV在我國鴨群中混合感染比例呈上升趨勢^［4-5］ 。鴨腸炎病毒（DEV），也稱為鴨瘟病毒，主要感染雁形目鴨科動物，造成鴨病毒性腸炎（DVE）^［6］ ，也稱鴨瘟。1923 年荷蘭首次報道了家鴨暴發(fā)鴨瘟，此后，全球大部分國家均對鴨病毒性腸炎的發(fā)生和流行有了報道^［7-8］，該病毒對鴨養(yǎng)殖業(yè)造成極大的影響。2014年11月以來，一種新型鴨源鵝細小病毒（NGPV）引發(fā)的“短喙-侏儒癥”^［9-10］ 在我國櫻桃谷鴨群中相繼暴發(fā)。該病多發(fā)生于1月齡以內(nèi)的肉鴨，大多數(shù)患鴨出欄時體重與健康鴨相比降低20%～30%，嚴重時患鴨僅為健康鴨體重的50%^［11］。

目前，群發(fā)性或地方流行性水禽病毒性疫病尤為常見，且不僅出現(xiàn)單純感染，更多以混合感染的形式發(fā)生，造成檢測困難，治療難度加大，從而導致發(fā)病狀況和病死率更加嚴峻。有檢測單位對2021年所接收的鴨病料檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，病毒性病原檢出率中，檢出率較高的病毒包括鴨圓環(huán)病毒、鴨細小病毒、鴨腸炎病毒^［12］ 。以上3種病毒不但會造成宿主的單純感染，也會出現(xiàn)混合感染，尤其是DuCV和DEV、DuCV和NGPV的混合感染普遍存在，混合感染相較于單純感染不僅檢測難度較高，而且對治療也造成極大的困擾，對養(yǎng)殖業(yè)造成極大的損失。目前，有關(guān)DuCV、DEV和NGPV多重PCR 檢測方法鮮見報道。

基于此，該試驗建立了用于鑒別檢測DuCV、DEV、NGPV的 Taq-Man 三重熒光定量PCR，以期為種鴨場的疫病凈化提供技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要儀器。博恒基因擴增儀、Bio-Rad-CFX96熒光定量PCR儀器均購自杭州博日科技有限公司。

1.1.2 主要試劑。熒光定量PrimerMix酶，購自諾唯贊公司；質(zhì)粒小提試劑盒、病毒DNA提取試劑盒，購自天根生物有限公司；pMD18-T載體，購自康潤生物公司。

1.1.3 主要試材。鴨腺病毒3型（DadV-3）、H9亞型禽流感病毒（AIV-H9）、禽腺病毒4型（FadV-4）、呼腸孤病毒（DRV）、新城疫病毒（NDV）、鴨肝炎病毒（DHV）、鴨圓環(huán)病毒（DuCV）、鴨腸炎病毒（DEV）、新型鵝細小病毒（NGPV） 由山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所保存，150份臨床樣本（肝、脾）采自山東各鴨養(yǎng)殖場臨床疑似感染鴨。

1.2 引物和探針

以GenBank收錄的DuCV（登錄號 MK814589.1）、DEV（登錄號AF043730.1）、NGPV（登錄號KY511124.1）基因序列為參考序列，針對DuCV的Rep基因、DEV的UL6基因、NGPV的VP1基因保守區(qū)域的序列分別設(shè)計一對常規(guī)PCR特異性引物和熒光定量PCR特異性引物及Taq-Man探針（表1），均由華大基因公司合成。

1.3 重組質(zhì)粒標準品的構(gòu)建

提取DuCV、DEV、NGPV的總DNA作為模板，分別使用表1中的引物。通過常規(guī)PCR儀擴增3個病毒的相應基因，擴增完成后，通過凝膠電泳觀察條帶是否正確，隨后進行凝膠產(chǎn)物回收，連接至pMD18-T載體，構(gòu)建病毒DNA的重組質(zhì)粒標準品，分別命名為pDuCV-Rep、pDEV-UL6、pNGPV-VP1。測定3種重組質(zhì)粒的濃度，計算出pDuCV-Rep、pDEV-UL6、pNGPV-VP1的拷貝數(shù)分別為2.83×10¹⁰、2.88×10¹⁰、3.13×10¹⁰ copies/μL，將pDuCV-Rep、pDEV-UL6、pNGPV-VP1稀釋為2.5×109 copies/μL后，置于-20 ℃冰箱備用。

1.4 反應條件的優(yōu)化

將3種重組質(zhì)粒等比例稀釋后選取2.5×107 copies/μL等比例混合后作為模板，與3對熒光定量PCR引物（qDuCV-F/R、qDEV-F/R、qNGPV-F/R）和3條Taq-Man探針（qDuCV-p、qDEV-p、qNGPV-p）在同一體系中進行擴增，采用方陣法，分別對循環(huán)數(shù)（35、40、45個）、引物濃度（終濃度分別為0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 μmol/L）、退火溫度（57、58、59、60 ℃）、探針濃度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 μmol/L）進行梯度優(yōu)化，得到最佳反應條件。

1.5 標準曲線的建立

將3種重組質(zhì)粒標準品10倍梯度稀釋后，選取2.5×108～2.5×102 copies/μL的質(zhì)粒標準品作為模板，等比例混合，按照優(yōu)化的反應條件擴增，繪制標準曲線。

1.6 引物和探針特異性檢測

分別以DadV-3、AIV-H9、FadV-4、DRV、NDV、DHV、DuCV、DEV、NGPV、pDuCV-Rep、pDEV-UL6、pNGPV-VP1的DNA或cDNA為模板，無菌水為陰性對照，利用該研究建立的熒光定量PCR方法進行檢測，以擴增曲線及Ct值作為評估該方法特異性的標準。

1.7 靈敏性驗證

將3種重組質(zhì)粒標準品10倍梯度稀釋，稀釋10個梯度，將3種標準品等比例混合后作為模板。利用該研究建立的熒光定量PCR方法進行擴增，根據(jù)熒光值確定最低檢出量，以此評估該方法的敏感性。

1.8 重復性試驗

將3種重組質(zhì)粒標準品10倍梯度稀釋后，選取2.5×108～2.5×105 copies/μL的標準品等比例混合后作為模板，利用建立的熒光定量PCR方法進行擴增，每個樣品重復3次，進行組內(nèi)重復試驗，以不同時空提取的標準品，按同樣的方式稀釋并混合后，利用該研究建立的熒光定量PCR方法擴增，進行組間重復性試驗，分別計算變異系數(shù)（CV）以此評估重復性。

1.9 臨床應用

采集150份臨床發(fā)病鴨的肝臟和脾臟組織，加入滅菌 PBS研磨處理，凍融3次后于10 000 r/min離心15 min，取上清，提取 150份待檢樣品的DNA，分裝后，置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。采用?yōu)化后的多重Taq-Man熒光定量PCR方法進行檢測，并與常規(guī)PCR方法進行平行分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重Taq-Man熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化

采用梯度法對各個反應條件進行優(yōu)化，結(jié)果顯示，多重Taq-Man熒光定量PCR最佳反應體系總量為20 μL，DuCV、DEV上下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL，探針（10 μmol/L）0.1 μL，NGPV上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，探針（10 μmol/L）0.2 μL，模板為3種重組質(zhì)粒標準品pDuCV-Rep、pDEV-UL6、pNGPV-VP1等比例混合物3.0 μL，去離子水4.8 μL；擴增程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，40個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號。

2.2 多重Taq-Man熒光定量PCR標準曲線的建立

取濃度為 2.5×108、2.5×107、2.5×106、2.5×105、2.5×104、2.5×103、2.5×102 copies/μL的重組質(zhì)粒，采用優(yōu)化后的條件擴增，獲得對應的擴增曲線，從而得到拷貝數(shù)與Ct值之間的關(guān)系（圖1）。結(jié)果顯示：pDuCV-Rep、pDEV-UL6、pNGPV-VP1的線性關(guān)系表達式分別為Ct=-3.569lgx+45.854（R2=0.992）、Ct=-3.545lgx+44.565（R2=0.991）、Ct=-3.636lgx+45.183（R2=0.991）。

2.3 重復性試驗

采用該研究構(gòu)建的多重Taq-Man 熒光定量 PCR方法 對2.5×108、2.5×107、2.5×106、2.5×105 copies/μL 的標準質(zhì)粒分別進行組內(nèi)和組間的重復性測試，結(jié)果顯示（表3），變異系數(shù)（CV）均小于1.0%。表明該方法重復性較好。

2.4 敏感性試驗

選取濃度為2.5×109～2.5×100 copies/μL的質(zhì)粒標準品混合物為模板，利用建立的Taq-Man熒光定量PCR擴增，結(jié)果顯示（圖2），該方法對pDuCV-Rep、pDEV-UL6、pNGPV-VP1的檢測下限均為2.5×101 copies/μL。

2.5 特異性試驗

分別以DadV-3、AIV-H9、FadV-4、DRV、NDV、DHV、DuCV、DEV、NGPV的DNA或cDNA為模板，利用建立的熒光定量PCR方法進行擴增，結(jié)果顯示（圖3）， pDuCV-Rep、pDEV-UL6、pNGPV-VP1、DuCV、DEV、NGPV均呈陽性結(jié)果，而其他病毒及陰性對照結(jié)果呈陰性，表明該方法的特異性較強。

2.6 臨床樣品的檢測應用

對150份臨床發(fā)病鴨的組織樣本進行檢測，結(jié)果顯示，DuCV的陽性率為32.0%（48份），DEV的陽性率為23.3%（35份），NGPV的陽性率為18.7%（28份），DuCV和DEV混合感染率為4.6%（7份），DuCV和NGPV混合感染率為8.6%（13份），總陽性率為87.3%（131份），未檢出DEV和NGPV混合感染的結(jié)果；使用常規(guī)PCR方法檢測，檢測結(jié)果顯示，DuCV的陽性率為27.0%（41份），DEV的陽性率為22.0%（33份），NGPV的陽性率為10.7%（16份），DuCV和DEV混合感染率為1.3%（2份），DuCV和NGPV混合感染率6.0%（9份），總陽性率為67.3%（101份），同樣未檢出DEV和NGPV混合感染的結(jié)果，且PCR陽性樣品經(jīng)多重Taq-Man熒光定量PCR檢測也均為陽性，陽性符合率為100%。

3 討論

多重PCR技術(shù)具有快速、準確、敏感等優(yōu)點，在多種病原體的鑒別及混合感染診斷方面表現(xiàn)出更加明顯的優(yōu)勢，并且可以明顯降低檢測成本和檢測時間。

目前我國養(yǎng)鴨規(guī)模不斷擴大，隨之而來的就是養(yǎng)殖密度也在不斷增加，同時由于飼養(yǎng)水平和管理水平低下，從而導致鴨的發(fā)病率和病死率呈上升趨勢，并且常發(fā)生多種疫病病原的混合感染，往往對我國鴨病的防控造成困難^［13］ 。 DuCV、DEV和NGPV給我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成嚴重危害，且常以混合感染的形式出現(xiàn)。

近年來，在鴨病毒性腸炎的病例中經(jīng)常能夠同時檢測到DuCV，有學者分析研究，可能是由于DuCV在鴨群中普遍存在^［14］ 。感染圓環(huán)病毒后，會造成免疫器官的嚴重損傷，導致免疫抑制，降低宿主免疫力，從而在一定程度上提高了感染DEV的風險。感染DuCV也可能是鴨病毒性腸炎免疫失敗的原因之一^［8］ 。同時，有學者證明DuCV在NGPV造成短喙-侏儒癥（BADS）的過程中起著重要的協(xié)同作用^［15］ 。據(jù)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，新型鵝細小病毒（NGPV）和圓環(huán)病毒（DuCV）的混合感染在山東、河南、江蘇、安徽等地普遍存在，也有一些學者研究發(fā)現(xiàn)，2017年一種名為羽毛脫落綜合征的傳染病在中國東部的鴨群中不斷暴發(fā)，其也是由DuCV和NGPV混合感染造成^［16］ 。早期、快速、可靠、靈敏、準確地發(fā)現(xiàn)傳染病，對傳染病的防控具有重要意義。

WANG等^［17］建立的DuCV和NGPV的雙重SYBR熒光定量檢測方法對這2種病毒重組質(zhì)粒標準品的檢測下限為101 copies/μL。趙韻笛等^［18］建立了檢測鴨圓環(huán)病毒的熒光定量PCR方法，對DuCV重組質(zhì)粒標準品的最低檢測下限為3.46×101 copies/μL。周潔文等^［19］建立了新型鵝細小病毒熒光定量檢測方法，對NGPV重組質(zhì)粒標準品的檢測下限為5.17 copies/μL。萬春和等^［20］建立了DEV的Taq-Man熒光定量PCR檢測方法，對DEV重組質(zhì)粒標準品的檢測下限為1×101 copies/μL。該研究建立的多重Taq-Man熒光定量PCR檢測方法對3種病毒（DuCV、DEV、NGPV）重組質(zhì)粒標準品檢測下限均為2.5×101 copies/μL，相較于單重Taq-Man熒光定量PCR檢測方法敏感性略有降低，可能是由于同一體系中含有多種引物、模板及探針，導致其相互干擾，從而降低檢測方法的敏感性。

利用該方法對150份臨床發(fā)病鴨的組織樣本進行檢測，結(jié)果顯示，DuCV的陽性率為32.0%（48份），DEV的陽性率為23.3%（35份），NGPV的陽性率為18.7%（28份），DuCV和DEV混合感染率為4.6%（7份），DuCV和NGPV混合感染率為8.6%（13份），總陽性率為87.3%（131份），未檢出DEV和NGPV混合感染的結(jié)果。與常規(guī)PCR檢測方法相比，陽性符合率為100%。

4 結(jié)論

該研究建立了DuCV、DEV、NGPV多重Taq-Man熒光定量PCR檢測方法，特異性較強，敏感性高，組內(nèi)及組間重復性試驗的變異系數(shù)均在1.0%以內(nèi)，表明重復性良好，檢測結(jié)果穩(wěn)定可信，可為臨床檢測相關(guān)病原提供一個快速、便捷、高效的檢測手段。

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