尖葉茶藨子種子無(wú)菌苗再生體系的建立

摘要 以尖葉茶藨子成熟種子為試材，采用不同處理及消毒方式獲得無(wú)菌苗，再以幼苗莖段為外植體，研究不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)叢芽誘導(dǎo)、增殖、壯苗及生根的影響。結(jié)果表明：500 mg/L GA3浸泡處理有利于種子的萌發(fā)，發(fā)芽率可達(dá)66.7%，最佳消毒處理為75%乙醇30 s+0.1% HgCl消毒8 min，污染率為23.3%；最佳叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，增殖倍數(shù)為7.5；最佳壯苗培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+50 g馬鈴薯泥；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+2.0 mg/L IBA，生根率為100%，平均生根條數(shù)為6.33。煉苗后，移栽到泥炭土∶椰糠∶珍珠巖體積比為3∶1∶1的基質(zhì)中，成活率達(dá)87.5%。該研究建立了尖葉茶藨子種子組培快速繁育技術(shù)體系，適用于尖葉茶藨子種苗的規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用。

關(guān)鍵詞 尖葉茶藨子種子；組織培養(yǎng)；叢生芽；快速繁育

中圖分類號(hào) S 722.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）22-0115-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.22.023

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Establishment of Rapid Propagation for Sterile Seedlings of Ribes maximowiczianum Komarov by Tissue Culture

LIN Li-xia， LIN Jian-zhong，ZHANG Xue-qin et al

（Fujian Institute of Subtropical Botany/Fujian Lab of Subtropical Plant Physiology and Biochemistry， Xiamen， Fujian 361006）

Abstract The seedlings of mature Ribes maximowiczianum Komarov seed germination under different disinfection treatment were used as explants to study the influence of different plant growth regulators on buds induction， hyperplasia，sound seedling and rhizogenesis. The results showed that 500 mg/L GA3 soaking treatment was conducive to seed germination， and the germination rate could reach 66.7%， and the best disinfection treatment was 75% alcohol for 30s and 0.1% mercuric acid disinfection for 8 min，the contamination rate was 23.3%. The best medium for bud induction was MS + 2.0 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA， the proliferation times was 7.5. The best medium for rooting was 1/2MS+2.0 mg/L IBA， the rooting rate was 100%， and the average number of rooting shoots was 6.33. The survival rate was 87.5% in the medium of 3∶1∶1 in peat soil∶coir∶perlite. This study established a complete system of tissue culture and rapid propagation for Ribes maximowiczianum Komarov seed， which is suitable for the large-scale production and application of Ribes maximowiczianum Komarov seedlings.

Key words Seeds of Ribes maximowiczianum Komarov;Tissue culture;Cluster buds;Rapid propagation

尖葉茶藨子（Ribes maximowiczianum Komarov）為虎耳草科茶藨子屬的落葉小灌木^［1］，又稱北方茶藨或遠(yuǎn)東茶藨，生于海拔900～2 700 m的山坡或山谷林下及灌叢中，分布于我國(guó)東北各省、朝鮮北部、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)^［2-3］。茶藨子樹(shù)型優(yōu)美、花色鮮艷、氣味香馥，具有很高的觀賞價(jià)值，其漿果紅色可食，味酸，可制作果醬、果汁、果糖、果酒等，還可提取維生素、食品色素及果膠酶^［4-7］。尖葉茶藨子可通過(guò)播種、扦插進(jìn)行繁殖，但需外界干擾打破種子休眠才能相對(duì)縮短種子的繁殖周期，且實(shí)生苗較弱生長(zhǎng)較慢，扦插繁殖需要大量的母本材料，硬枝扦插不易生根。筆者利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立尖葉茶藨子快速繁殖體系，繁殖系數(shù)高，不受時(shí)間和外界環(huán)境的影響，更適用于工廠化育苗，滿足市場(chǎng)需求。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

該試驗(yàn)所用的寧夏尖葉茶藨子種子由寧夏皇達(dá)生物科技股份有限公司提供，果實(shí)采收后保鮮運(yùn)往福建省亞熱帶植物研究所，置于冰箱4 ℃保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子的預(yù)處理與消毒。

為保證種子質(zhì)量均一，試驗(yàn)前對(duì)保鮮漿果進(jìn)行搓揉去除果皮肉，將分離出來(lái)的種子混勻，選取顆粒飽滿、新鮮且有光澤的尖葉茶藨子種子，分成2組，其中1組種子用清水浸泡48 h，另1組種子采用500 mg/L GA3溶液浸泡48 h，每組30粒種子，3次重復(fù)。將處理好的種子用75%乙醇?xì)⒕?0 s，0.1% HgCl溶液消毒4～10 min，無(wú)菌水沖洗4～5次，滅菌種子置于無(wú)菌濾紙上吸干水分，轉(zhuǎn)接至MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，每處理接種20粒種子，3次重復(fù)。

1.2.2 叢生芽的誘導(dǎo)。

以尖葉茶藨子無(wú)菌苗為材料，切成1～2 cm的帶芽莖段，接種于添加不同濃度植物激素的MS培養(yǎng)基上，0.5、1.0、2.0 mg/L 6-BA與0.05、0.10、0.50 mg/L NAA組合共9種處理，每處理接種20個(gè)帶芽莖段進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，重復(fù)3次。

1.2.3 無(wú)菌苗壯苗的培養(yǎng)。

以培養(yǎng)50 d的尖葉茶藨子叢芽為材料，轉(zhuǎn)接至壯苗培養(yǎng)基中繼續(xù)生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中添加6-BA（0.1、0.5 mg/L）、NAA（0.05、0.10 mg/L）、馬鈴薯泥（50 g/L），每個(gè)處理接種20瓶，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)苗高及生長(zhǎng)情況。

1.2.4 生根培養(yǎng)。

經(jīng)壯苗培養(yǎng)后，切取生長(zhǎng)健壯的單個(gè)芽苗接種至生根培養(yǎng)基上，在1/2MS培養(yǎng)基上分別添加不同濃度的IBA（0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L），每個(gè)處理接種20瓶，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)生根率、生根條數(shù)及根系生長(zhǎng)情況。

1.2.5 煉苗移栽。

將組培苗開(kāi)蓋置于育苗室中煉苗3 d，輕輕洗掉根部的培養(yǎng)基，移栽至泥炭土∶椰糠∶珍珠巖體積比為3∶1∶1的混合基質(zhì)中，應(yīng)用種苗智能化快繁苗床進(jìn)行植株的培養(yǎng)，育苗室中配有智能感應(yīng)系統(tǒng)、彌霧降溫系統(tǒng)及間歇式自動(dòng)噴灌系統(tǒng)等設(shè)施，保持室內(nèi)溫度為25 ℃，濕度為80%～90%，光照強(qiáng)度為2 500 lx。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2016、SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

萌發(fā)率=萌發(fā)種子數(shù)/（接種種子數(shù)-被污染種子數(shù)）×100%，污染率=被污染種子數(shù)/種子總數(shù) ×100%，成苗率=成苗數(shù)/（接種種子數(shù)－被污染種子數(shù)）×100%，

增殖系數(shù)=增殖后獲得的單芽個(gè)數(shù)/接種的外植體數(shù)，生根率=生根的苗數(shù)/接種的芽苗數(shù)×100%，平均生根條數(shù)=每處理生根的總根數(shù)/生根的總苗數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)種子萌發(fā)和污染情況的影響

由表1可知，48 h浸泡處理對(duì)尖葉茶藨子種子的萌發(fā)有明顯的促進(jìn)作用（圖1A、B），尤其是經(jīng)GA3浸泡后的種子發(fā)芽率可達(dá)66.7%，初始發(fā)芽時(shí)間縮短為20 d；相比于CK，清水浸泡48 h的種子

初始發(fā)芽時(shí)間提早12 d，發(fā)芽率約為CK的1.5倍。由表2可知，隨著0.1% HgCl處理時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率呈逐漸降低趨勢(shì)，而萌發(fā)率呈先升高后降低的趨勢(shì)；其中消毒時(shí)間為10 min的污染率最低，但萌發(fā)率僅為25.0%；消毒時(shí)間為8 min時(shí)，污染率為23.3%，萌發(fā)率達(dá)到最高61.7%。因此，綜合考慮污染率與萌發(fā)率，可以采用0.1% HgCl對(duì)尖葉茶藨子種子消毒處理8 min。

2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響

由表3可知，不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合均可誘導(dǎo)出尖葉茶藨子的叢生芽（圖1C），但其增殖系數(shù)差異較大，且叢生芽的生長(zhǎng)情況明顯不同。當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L時(shí)，不同組合處理的芽增殖系數(shù)為2.3～3.2，其中與0.10 mg/L NAA組合處理的分生芽最少，增殖系數(shù)僅為2.3，叢生芽較小且葉色偏黃；當(dāng)6-BA濃度為1.0、2.0 mg/L時(shí)，不同組合處理的芽增殖系數(shù)均在4.5及以上，其中2.0 mg/L 6-BA與0.05 mg/L NAA組合處理的增殖效果最佳，芽增殖系數(shù)最高，達(dá)7.5，誘導(dǎo)的分生芽多、粗壯且生長(zhǎng)旺盛；1.0 mg/L 6-BA與0.05 mg/L NAA組合處理的芽增殖系數(shù)高達(dá)6.7，但其叢生芽小、生長(zhǎng)緩慢且伴有少量愈傷組織，不利于后期培養(yǎng)。因此，從芽增殖系數(shù)和分生芽的生長(zhǎng)情況看，適合尖葉茶藨子叢芽增殖的最佳激素組合為6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L。

2.3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)試管苗壯苗培育的影響

由于叢生芽的增殖系數(shù)較高，芽苗細(xì)弱，采用不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合及添加馬鈴薯泥對(duì)其進(jìn)行壯苗培養(yǎng)（圖1D），以獲得大量的健壯芽苗，有利于后期生根培養(yǎng)。由表4可知，只添加土豆泥的處理組可以促進(jìn)芽苗生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)緩慢且芽苗細(xì)弱，添加不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑后基部明顯膨大。當(dāng)6-BA濃度為0.1 mg/L、NAA為0.05 mg/L時(shí)，芽苗的基部膨大且粗壯，長(zhǎng)勢(shì)最好；當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L時(shí)，芽苗雖有長(zhǎng)高且基部膨大，但出現(xiàn)增殖現(xiàn)象或者產(chǎn)生少量愈傷組織，這都不利于壯苗培養(yǎng)。因此，尖葉茶藨子壯苗的最佳培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+50 g馬鈴薯泥+30 g蔗糖+8 g瓊脂。

2.4 不同濃度IBA對(duì)組培苗生根的影響

由表5可知，隨著IBA濃度增加，生根率逐漸升高，生根數(shù)量也隨之增多（圖1E）。當(dāng)IBA濃度為2.0 mg/L時(shí)，生根率高達(dá)100%，且生根數(shù)量也最多（6.33），根系生長(zhǎng)狀況良好，其主根多、粗壯、長(zhǎng)，生根效果最佳。因此，1/2MS+IBA 2.0 mg/L為最佳生根培養(yǎng)基。將生根30 d的瓶苗開(kāi)蓋在25 ℃育苗室中煉苗3 d（圖1F），保持其濕度為70%左右。根部的培養(yǎng)基沖洗干凈后，移栽至泥炭土∶椰糠∶珍珠巖體積比為3∶1∶1的混合基質(zhì)中，置于25 ℃育苗室中繼續(xù)培養(yǎng)，采用彌霧降溫系統(tǒng)及間歇式自動(dòng)噴灌系統(tǒng)，保持育苗室內(nèi)濕度85%左右。30 d后統(tǒng)計(jì)移栽的成活率達(dá)到87.5%。

3 結(jié)論與討論

該研究以寧夏尖葉茶藨子種子為試材，從種子消毒、叢芽誘導(dǎo)、壯苗和生根4個(gè)方面對(duì)尖葉茶藨子的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，用0.1%升汞對(duì)尖葉茶藨子種子消毒8 min的效果較好，經(jīng)過(guò)GA3浸泡后的尖葉茶藨子種子不僅縮短萌發(fā)時(shí)間，而且萌發(fā)率也有所提高。這與之前研究的GA3浸種能顯著促進(jìn)寧夏尖葉茶藨子種子萌發(fā)的結(jié)果一致^［8］。周慧晶等^［9］研究發(fā)現(xiàn)，雜交菠蘿種子在添加0.8 mg/L GA3培養(yǎng)基上萌發(fā)率最高，且所需時(shí)間最短，可見(jiàn)通過(guò)浸泡GA3溶液或者培養(yǎng)基中添加GA3都能明顯促進(jìn)種子萌發(fā)，后期可以嘗試將尖葉茶藨子種子浸泡后再接種于添加GA3的培養(yǎng)基上。

一般來(lái)說(shuō)，組培苗的增殖倍數(shù)在3倍以上就可以滿足快速繁殖的要求，在叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑起了關(guān)鍵作用^［10］。該試驗(yàn)中采用不同濃度6-BA與NAA誘導(dǎo)叢芽，隨著濃度的變化，增殖倍數(shù)差異顯著，2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA組合的增殖效果最佳，增殖倍數(shù)高達(dá)7.5。鄒薇薇^［11］采用香茶藨子嫩莖誘導(dǎo)腋芽，平均增殖系數(shù)最高為5.62，增殖的最佳激素組合和濃度為6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.10 mg/L+GA 0.5 mg/L。這說(shuō)明可能較高濃度的6-BA能促進(jìn)腋芽的增殖，也有可能與品種差異有關(guān)。

該試驗(yàn)的尖葉茶藨子是以腋芽誘導(dǎo)腋芽的方式進(jìn)行增殖，以致于芽苗相對(duì)較弱，在培養(yǎng)基添加0.1 mg/L 6-BA、0.05 mg/L NAA、50 g馬鈴薯泥進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，芽苗基部明顯膨大且粗壯。蝴蝶蘭附加100 g/L馬鈴薯泥有利于組培苗生根壯苗培養(yǎng)^［12］，玫瑰石斛在添加50 g/L馬鈴薯泥的培養(yǎng)基中生根壯苗情況最佳^［13］，添加馬鈴薯泥60 g/L顯著促進(jìn)蘭花新品種“小鳳蘭”試管苗生長(zhǎng)^［14］?？梢?jiàn)，在培養(yǎng)基中添加一定量的馬鈴薯泥能提高試管苗質(zhì)量。

適宜濃度的生長(zhǎng)素對(duì)生根有明顯的促進(jìn)作用，而過(guò)高濃度的生長(zhǎng)素則抑制生根^［15］。杠柳組培苗最佳的生根培養(yǎng)基配方為1/2 MS+IBA 0.5 mg/L+蔗糖25 g/L，該培養(yǎng)條件下生根率達(dá)91.67%^［16］。尖葉茶藨子在生根誘導(dǎo)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在1/2MS培養(yǎng)基中添加2.0 mg/L IBA時(shí)，主根多、粗壯、長(zhǎng)，生根效果最佳。

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