OLR1基因生信分析及其在貴州黑山羊和黔北麻羊性腺軸中的表達

摘要 ［目的］研究OLR1基因與貴州黑山羊和黔北麻羊繁殖率之間的關(guān)系，為研究OLR1基因調(diào)控山羊卵泡發(fā)育的分子機制提供參考。［方法］通過生物信息學(xué)的手段對OLR1蛋白理化性質(zhì)、亞細胞定位、信號肽位點、蛋白高級結(jié)構(gòu)等進行預(yù)測，并通過對不同物種OLR1氨基酸序列進行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹；采用RT-qPCR 的方法檢測OLR1基因在單羔和多羔貴州黑山羊和黔北麻羊性腺軸各組織中的表達量。［結(jié)果］OLR1基因編碼 275個氨基酸，理論pi值為6.37，OLR1是一種主要由α-螺旋卷曲構(gòu)成的不具有信號肽的不穩(wěn)定親水性蛋白；與其他動物相比，山羊OLR1與反芻動物綿羊和牛的遺傳距離最近。qPCR 結(jié)果顯示：OLR1基因在貴州黑山羊及黔北麻羊下丘腦、輸卵管、垂體、子宮和卵巢組織中均有表達。在單羔組貴州黑山羊下丘腦、子宮、卵巢、垂體中的表達量均極顯著高于多羔組（P<0.01），在輸卵管中的表達量高于多羔組，但二者間差異不顯著（P>0.05）。在單羔組黔北麻羊下丘腦、垂體、卵巢中的表達量均極顯著高于多羔組（P<0.01）；在輸卵管中的表達量高于多羔組，在子宮中的表達量低于多羔組，但二者間差異不顯著（P>0.05）。［結(jié)論］OLR1基因表達量與貴州黑山羊和黔北麻羊的繁殖性狀呈負相關(guān)，可作為影響貴州本地山羊繁殖性能的重要候選基因。

關(guān)鍵詞 貴州黑山羊；黔北麻羊；性腺軸；OLR1基因；生物信息學(xué)；繁殖性狀

中圖分類號 S 826 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）22-0088-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.22.017

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Bioinformatics Analysis of OLR1 Gene and Its Expression in Gonadal Axis of Guizhou Black Goat and Qianbei Ma Goat

YANG Hong1， YANG Yuan-qing1， ZHOU Ming-shuai2 et al

（1. Bijie Livestock Station， Bijie， Guizhou 551700;2. College of Animal Science， Guizhou University/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction of Plateau Mountainous Animals， Ministry of Education， Guiyang， Guizhou 550025）

Abstract ［Objective］To study the relationship between OLR1 gene and the reproductive rate of Guizhou black goat and Qianbei Ma goat， and to provide reference for studying the molecular mechanism of OLR1 gene regulating goat follicular development. ［Method］The physicochemical properties， subcellular localization， signal peptide sites， and advanced structure of OLR1 protein were predicted by bioinformatics methods. The phylogenetic tree was constructed by homology analysis of OLR1 amino acid sequences of different species. Then RT-qPCR was used to detect the expression of OLR1 gene in the tissues of the gonadal axis of single-lamb and multi-lamb Guizhou black goats and Qianbei Ma goats. ［Result］OLR1 gene encoded 275 amino acids， and the theoretical pi value was 6.37. OLR1 was an unstable hydrophilic protein without signal peptide， which was mainly composed of α-helix curl. Compared with other animals， goat OLR1 has the closest genetic distance to ruminant sheep and cattle. The results of qPCR showed that OLR1 gene was expressed in hypothalamus， oviduct， pituitary， uterus and ovary tissues of Guizhou black goat and Qianbei Ma goat. The expression in hypothalamus， uterus， ovary and pituitary of Guizhou black goat in single-lamb group was significantly higher than that in multi-lamb group （P<0.01）. The expression levels in hypothalamus， pituitary and ovary of Qianbei Ma goat in single lamb group were significantly higher than those in multiple lamb group （P<0.01）. ［Conclusion］The expression level of OLR1 gene was negatively correlated with the reproductive traits of Guizhou black goats and Qianbei Ma goats， which could be used as an important candidate gene affecting the reproductive performance of Guizhou local goats.

Key words Guizhou black goat;Qianbei Ma Goat;Gonadal axis;OLR1 gene;Bioinformatics;Reproductive traits

氧化型低密度脂蛋白受體1（OLR1）是一種凝集素清道夫受體，可識別多種配體，如氧化型低密度脂蛋白、多陰離子化學(xué)物質(zhì)、陰離子磷脂等，具有結(jié)合、內(nèi)化和降解低密度脂蛋白的作用^［1-2］，主要分布于血管內(nèi)皮細胞和腎、肺、神經(jīng)元等血管豐富的組織中^［1］。活性氧（ROS）可通過ox-LDL與OLR1的結(jié)合而上調(diào)，ROS引起氧化DNA損傷，生成體內(nèi)氧化脂質(zhì)和蛋白質(zhì)^［3］。因此，OLR1與膽固醇代謝^［4］、動脈粥樣硬化^［5-6］，高血壓^［7］有關(guān)。在人類上，這些過程也伴隨著癌癥的發(fā)生，如在結(jié)腸癌中，OLR1敲低通過增加c-MYC下調(diào)SULT2B1來削弱糖酵解代謝，以抑制結(jié)腸癌細胞增殖及化學(xué)抗性；在胰腺癌中，OLR1通過增加c-myc表達和HMGA2的轉(zhuǎn)錄促進胰腺癌轉(zhuǎn)移等。在動物上，這些過程能夠優(yōu)化膽固醇含量、游離脂肪酸攝入量和脂滴含量^［8］，因此OLR1基因還與動物的乳脂率^［9］、肉品質(zhì)^［10］和脂肪沉積^［11］密切相關(guān)。此外，近年研究發(fā)現(xiàn)，OLR1也與動物的繁殖率相互關(guān)聯(lián)，研究發(fā)現(xiàn)，OLR1基因突變位點中TT基因型個體的硒都黑豬總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)最高^［12］，且OLR1基因中的p.K116Q SNP的母羊的窩產(chǎn)仔數(shù)、孿生率、繁殖力和產(chǎn)羔百分比低于CC基因型母羊^［13］。以上均是OLR1基因與動物繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性分析，但是，目前關(guān)于OLR1與山羊性腺軸中的表達及其與繁殖力之間的關(guān)系，只在貴州白山羊上有相關(guān)報道，而在貴州黑山羊和黔北麻羊上尚未被發(fā)現(xiàn)。因此，筆者以單羔、多羔貴州黑山羊和黔北麻羊為研究對象，對其性腺軸中OLR1的表達規(guī)律進行解析，以便為黔北麻羊和貴州黑山羊多胎品系的選育提供潛在的關(guān)鍵候選基因和分子標記物。此外，該試驗還將進一步分析OLR1在山羊性腺軸中的表達與繁殖能力之間的關(guān)系，以探索其在山羊繁殖性能中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

貴州黑山羊和黔北麻羊分別由貴州省富興畜牧業(yè)開發(fā)有限公司和貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院麥坪黑山羊養(yǎng)殖基地提供。按照體重相近的原則選擇體況良好且健康無病的2～3歲單、多羔貴州黑山羊和黔北麻羊各3只，根據(jù)《動物屠宰條例》的要求屠宰后，采集山羊卵巢、子宮、下丘腦、輸卵管和垂體組織，置于液氮中保存。

1.2 試劑及主要儀器

Trizol、氯仿、無水乙醇、SBYR Green RT-qPCR Mix、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、異丙醇等均購于貴州卓一生物科技有限公司；實時熒光定量PCR儀購自美國BIO-RAD有限公司；超微量紫外分光光度計購自美國賽默飛公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI上公布的山羊OLR1（XM_005680848）基因CDS編碼區(qū)序列，使用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計OLR1基因RT-qPCR引物，內(nèi)參基因β-acting引物序列參考^［14］，引物序列見表1，由上海擎科生物科技有限公司合成。

1.4 RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

使用Trizol法提取黔北麻羊和貴州黑山羊性腺軸組織RNA，將RNA濃度稀釋至500 ng/μL后，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，-80 ℃保存。

1.5 RT-qPCR檢測OLR1基因在黔北麻羊和貴州黑山羊不同組織中的表達

采用RT-qPCR檢測OLR1基因在單羔、多羔黔北麻羊和貴州黑山羊卵巢、下丘腦、垂體、子宮和輸卵管組織中的表達。以相同濃度的cDNA為模板進行RT-qPCR反應(yīng)，該試驗反應(yīng)終體系設(shè)定為10 μL：上、下游引物（100 μmol/L）各0.7 μL、cDNA模板1.2 μL、 qPCR mix 5.6 μL、ddHO補至10 μL。根據(jù)RT-qPCR Mix說明書，設(shè)置反應(yīng)條件，以β-acting作為內(nèi)參基因，每組3次重復(fù)，進行RT-qPCR反應(yīng)。

1.6 生物信息學(xué)分析

根據(jù)NCBI上公布的山羊OLR1蛋白氨基酸序列（XP_005680905.1），使用NetPhos 3.1（https：∥services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhos-3.1）在線分析軟件預(yù)測蛋白的磷酸化位點；Motif Search（https：∥www.genome.jp/tools/motif/）軟件預(yù)測蛋白保守結(jié)構(gòu)域；根據(jù)周志楠等^［14］研究中所應(yīng)用到的生物信息學(xué)分析方法，分別對OLR1蛋白氨基酸序列進行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、信號肽、蛋白質(zhì)2級及3級結(jié)構(gòu)等方面進行了預(yù)測，并將不同物種OLR1氨基酸序列進行同源性分析，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 OLR1基因在貴州黑山羊和黔北麻羊性腺軸中的表達

經(jīng)過qPCR檢測，OLR1基因在貴州黑山羊與黔北麻羊的性腺軸各組織中均有表達，由圖1和圖2可以看出，OLR1基因在2種山羊的單羔組下丘腦、卵巢、垂體中的表達均極顯著高于多羔組（P<0.01）；而在輸卵管中的表達雖然高于多羔組，但二者間差異不顯著（P>0.05）；在黔北麻羊單羔組子宮中的表達低于多羔組，但差異不顯著（P>0.05）。

由OLR1基因在貴州黑山羊與黔北麻羊性腺軸各組織中的表達量趨勢可知，OLR1基因在單羔組垂體、卵巢、下丘腦中的表達均極顯著高于多羔組（P<0.01），這表明OLR1基因與這2種動物的繁殖性狀存在顯著負相關(guān)。

2.2 OLR1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

OLR1基因CDS區(qū)總計編碼了275個氨基酸，編碼蛋白大小為31.5 kD，化學(xué)式為C1398H198N388O417S15，編碼的氨基酸中亮氨酸（12.7%）和絲氨酸（9.1%）的含量最多，此外，該基因還具有31個負電荷的氨基酸殘體（Asp+Glu），28個正電荷的氨基酸殘體（Arg+Lys），以及理論pi值達到6.37的特征。在大腸桿菌體內(nèi)半衰期>10 h，在酵母體內(nèi)的半衰期>20 h，在哺乳動物網(wǎng)織紅細胞半衰期為30 h；不穩(wěn)定指數(shù)為50.37，這意味著其是一種不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定指數(shù)大于40）。

2.3 OLR1蛋白信號肽

使用Signa IP 5.0 Server 在線分析軟件對OLR1蛋白信號肽進行預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白無信號肽（圖3）。

2.4 OLR1蛋白磷酸化位點

該研究通過NetPhos 3.1在線軟件對OLR1蛋白多個磷酸化位點進行了分析，發(fā)現(xiàn)OLR1蛋白的多個磷酸化位點超出了閾值，總數(shù)達到了27個。這些位點包括 Ser 、Thr 和Tyr，各占比18、7和2個（圖4）。

2.5 OLR1蛋白結(jié)構(gòu)域

通過Motif Search 軟件對OLR1蛋白肽鏈中含有的保守結(jié)構(gòu)域進行分析，結(jié)果顯示：在OLR1蛋白中主要包含Lectin_C、UL45、Ly49、FAM176、Selenoprotein_S、Vpu、DUF4446、SID-1_RNA _ chan 和Tmemb_9保守結(jié)構(gòu)域（圖5）。

2.6 OLR1蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)

通過SOPMA網(wǎng)絡(luò)在線技術(shù)，對COL1A1和COL1A2蛋白氨基酸序列進行二級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示（圖6）：OLR1蛋白的二級結(jié)構(gòu)分別由α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角組成，這些特征占比分別為51.64%、32.36%、12.37%和3.27%（圖6A）。隨后運用SWISS在線軟件預(yù)測OLR1蛋白三級結(jié)構(gòu)（圖6B），發(fā)現(xiàn)其特征與二級結(jié)構(gòu)一致，均以α-螺旋為主要結(jié)構(gòu)。

2.7 OLR1同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育進化樹

將山羊OLR1蛋白氨基酸序列與綿羊、牛、狗、豬、兔、鼠、人和馬的OLR1蛋白氨基酸序列使用Megalign軟件進行同源性分析。結(jié)果顯示，山羊OLR1基因與綿羊、牛、狗、豬、馬、兔、人、鼠的同源性分別為96.8%、88.7%、73.2%、73.0%、72.4%、68.2%、48.8%、46.4%，其中與反芻動物綿羊及牛的同源性最高，與鼠和人的同源性最低（圖7A）。進一步利用MEGA 7.0軟件中的NJ法構(gòu)建不同物種OLR1基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果顯示，山羊OLR1與反芻動物綿羊和牛的遺傳距離近，與人和鼠相距遠（圖7B）。

3 討論

貴州黑山羊、黔北麻羊和貴州白山羊作為貴州本土三

大優(yōu)秀品種，在貴州分布尤為廣泛，它們都有著諸如抗逆性

強、食性廣、肉質(zhì)鮮美等特點，在貴州廣受消費者喜愛。然而，隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，尤其是我國山羊規(guī)?；B(yǎng)殖的蓬勃發(fā)展，這3種山羊卻面臨著尷尬局面，由于存在著繁殖力低、窩產(chǎn)仔數(shù)少、舍飼能力低等缺點，造成了多以散戶散養(yǎng)，難以形成大規(guī)模的養(yǎng)殖場與企業(yè)等問題，這也是制約貴州山羊規(guī)模化發(fā)展的重要因素。繁殖性能作為山羊生產(chǎn)性狀的重要方面，受到諸多因素的影響，包括遺傳、環(huán)境、管理和營養(yǎng)因素等。氧化低密度脂蛋白受體-1（OLR1）是一種與低密度脂蛋白（LDL）結(jié)合并氧化的受體。其既往研究主要聚焦在動脈粥樣硬化等心腦血管疾病領(lǐng)域，常被用于腦出血的潛在治療靶點^［15-17］。該基因也與腎損傷、肥胖、糖尿病等代謝性疾病領(lǐng)域密切相關(guān)^［16］。在畜牧業(yè)中，有研究表明，該基因?qū)ι蠼?jīng)濟性狀有直接影響，如OLR1與奶牛的產(chǎn)奶量、乳脂組成和乳蛋白含量有關(guān)^［17］，并與豬的胴體組成和脂肪含量有關(guān)^［18］。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，OLR1基因在高產(chǎn)母豬卵巢中的表達量比低產(chǎn)母豬卵巢中的表達量要低，這表明OLR1基因在高產(chǎn)母豬卵巢中的表達水平要比低產(chǎn)母豬卵巢中的表達水平更低，這與該研究的OLR1基因在山羊單、多羔卵巢中表達趨勢一致。推測山羊產(chǎn)仔數(shù)可能與山羊OLR1基因單核苷酸多態(tài)性有關(guān)，后續(xù)可以進行關(guān)聯(lián)性分析。Ajafar等^［19］研究發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白質(zhì)可以吸收和降解低密度脂蛋白，從而影響能量平衡和繁殖性狀，并可能在調(diào)節(jié)綿羊繁殖力基因中起作用，未來可以將OLR1與高孿生率和繁殖性能聯(lián)系起來研究。Ruan等^［20］研究發(fā)現(xiàn)，阻斷OLR1信號通路可有效增加雌性哺乳動物體內(nèi)類固醇激素濃度，預(yù)防生殖功能障礙，并發(fā)現(xiàn)OLR1表達的上調(diào)可促進次級卵泡中顆粒細胞的自噬促進濾泡閉鎖，與貴州白山羊窩產(chǎn)仔數(shù)密切相關(guān)，推測OLR1基因也可通過調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育及閉鎖影響貴州黑山羊及黔北麻羊的繁殖性狀。總之，OLR1基因在動物繁殖能力的分子遺傳研究中起著至關(guān)重要的作用，同時也可作為貴州當?shù)厣窖蚋叻逼废档闹笜?，通過選擇培育，進一步提高山羊的繁殖率。

4 結(jié)論

OLR1是一種主要由α-螺旋卷曲構(gòu)成的不具有信號肽的不穩(wěn)定親水性蛋白，與其他動物比較，山羊的OLR1基因與牛、綿羊的親緣關(guān)系最密切。qPCR 分析表明：OLR1基因單羔貴州黑山羊和黔北麻羊下丘腦、垂體、和卵巢組織中表達量均極顯著高于多羔組（P<0.01）。這表明OLR1基因表達量與貴州黑山羊和黔北麻羊的繁殖性狀都呈負相關(guān)，可以作為影響貴州本地山羊繁殖性能的重要候選基因。

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