高山杜鵑組培快繁關(guān)鍵技術(shù)研究

摘要 以高山杜鵑品種“23XXL”“5RE”及“6GR”的葉片、莖段、苞片為外植體，研究基本培養(yǎng)基、外植體生理年齡及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)高山杜鵑外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，高山杜鵑外植體在WPM培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基上均能誘導(dǎo)出愈傷組織。愈傷誘導(dǎo)階段，添加2.0～3.0 mg/L TDZ誘導(dǎo)愈傷效果好，其中外植體生理年齡為2W葉片誘導(dǎo)的愈傷組織生長(zhǎng)較好，愈傷誘導(dǎo)率最高為100%；愈傷分化階段，最適宜的愈傷組織分化激素配比為ZT 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L和TDZ 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L，其中外植體生理年齡為1M葉片在Z7培養(yǎng)基愈傷組織分化較好，平均芽分化數(shù)為0.92；生根階段，培養(yǎng)基最佳激素配比IBA 0.5 mg/L+NAA 1.0～1.5 mg/L均適合高山杜鵑的3種品種。該研究結(jié)果為構(gòu)建高效、穩(wěn)定的高山杜鵑組培快繁體系提供科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)高山杜鵑產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 高山杜鵑；組織培養(yǎng)；外植體；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

中圖分類號(hào) S 685.21 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）22-0042-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.22.007

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Research on Key Techniques for Tissue Culture of Rhododendron lapponicum

NAN Ya-qi LIU Juan3，QI Yu1 et al

（1.Institute of Leisure Agriculture，Shandong Academy of Agricultural Sciences /East China Urban Agriculture Key Laboratory of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Shandong Engineering Research Center for Ecological Horticultural Plant Breeding， Jinan， Shandong 250100; 2.College of Horticulture and Landscape Architecture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300000; 3. Shandong Hongmei Horticultural Technology Co.， Ltd.， Rizhao， Shandong 276800）

Abstract This study used the leaves， stem segments， and bracts of alpine rhododendron varieties ‘23XXL’‘5RE’and‘6GR’ as explants to investigate the effects of basic culture medium， physiological age of explants， and plant growth regulators on callus induction in alpine rhododendron explants. The results showed that the explants of alpine rhododendron could induce callus on both WPM and MS media. During the callus induction stage， adding 2.0-3.0 mg/L TDZ had a good effect on inducing callus. Among them， the callus induced by leaves with a physiological age of 2W had better growth， and the highest callus rate was 100%;at the stage of callus differentiation， the most suitable ratio of callus differentiation hormones was ZT 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L and TDZ 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L. Among them， the explant with a physiological age of 1M had better callus differentiation on Z7 medium， with an average number of bud differentiation of 0.92;during the rooting stage， the optimal hormone ratio of the culture medium was IBA 0.5 mg/L+NAA 1.0-1.5 mg/L， which were suitable for the three varieties of alpine rhododendron. The research results provide a scientific basis for constructing an efficient and stable tissue culture and rapid propagation system of alpine rhododendron， and lay a foundation for further realizing the industrialization of alpine rhododendron.

Key words Rhododendron lapponicum;Tissue culture;Explants;Plant growth regulator

高山杜鵑一般是指以杜鵑亞屬、常綠杜鵑亞屬、馬銀花亞屬為主的生長(zhǎng)在海拔較高的地區(qū)的常綠杜鵑以及其經(jīng)過(guò)上百年雜交培育出的園藝品種，其花色繁多，花團(tuán)錦簇，極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值^［1］。

當(dāng)前國(guó)內(nèi)高山杜鵑的研究開發(fā)和推廣應(yīng)用方興未艾，在全國(guó)園林花卉大發(fā)展的背景下，高山杜鵑的市場(chǎng)潛力巨大^［2］。然而國(guó)內(nèi)高山杜鵑產(chǎn)業(yè)存在以下問(wèn)題：第一，國(guó)內(nèi)優(yōu)質(zhì)高山杜鵑品種主要依賴進(jìn)口，缺乏具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新優(yōu)品種^［3］。我國(guó)大部分栽培品種為歐洲選育的高山杜鵑品種，耐寒性強(qiáng)，但缺乏抗旱、耐熱性狀^［4］；第二，高山杜鵑為木本植物，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，養(yǎng)護(hù)成本高，生產(chǎn)企業(yè)積極性不高，導(dǎo)致產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢；第三，扦插不易成活、種苗依賴進(jìn)口，價(jià)格高。部分高山杜鵑品種缺乏完善、高效穩(wěn)定的組培繁育技術(shù)體系，種苗質(zhì)量得不到保障^［5-6］，使得高山杜鵑進(jìn)口種苗價(jià)格昂貴，不利于產(chǎn)業(yè)化推廣。

筆者針對(duì)目前高山杜鵑品種組培體系不完善、高效穩(wěn)定的組培繁育技術(shù)缺乏、種苗質(zhì)量參差不齊等問(wèn)題，以引入的高山杜鵑種質(zhì)資源為材料，開展高山杜鵑的種苗繁育關(guān)鍵技術(shù)研究，探索杜鵑花種質(zhì)創(chuàng)新的途徑和方法，實(shí)現(xiàn)種苗的高效繁育，為高山杜鵑產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)于2023年3—8月在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院休閑農(nóng)業(yè)所觀賞園藝課題組實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

高山杜鵑“23XXL”“5RE”“6GR”種質(zhì)資源，種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院休閑農(nóng)業(yè)研究所觀賞園藝課題組溫室，常規(guī)栽培管理。

選用WPM、MS作為基本培養(yǎng)基，使用激素有TDZ、ZT、NAA、IBA。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 外植體取材及消毒方法。

采用“23XXL”高山杜鵑品種的葉片、莖段、苞片為外植體材料，其中葉片按照新葉長(zhǎng)出時(shí)間分為生長(zhǎng)7 d（1W）、14 d（2W）、30 d（1M）3種；莖段按照生長(zhǎng)時(shí)間分為生長(zhǎng)30 d的莖段（JM）、14 d的莖段（J2W）；苞片（bp）。

將外植體用洗潔精浸泡10 min后，搓洗葉片表面黏膩的絨毛和莖段表面的污垢，用流水沖洗干凈，放置無(wú)菌瓶中備用。倒入75%乙醇消毒。其中，1W葉片消毒40 s，2W葉片消毒45 s，苞片（bp）消毒40 s，1M葉片消毒45 s，JM（莖段30 d）消毒45 s，J2W（莖段14 d）消毒45 s，外植體消毒要晃動(dòng)瓶身，使其均勻消毒。后分別夾到無(wú)菌瓶中，倒入0.1%氯化汞1W葉片、苞片（bp）消毒6 min，2W葉片、JM（莖段30 d）、J2W（莖段14 d）均消毒8 min。消毒期間不斷晃動(dòng)瓶身，使外植體與消毒液充分接觸，使其消毒徹底（表1）。

消毒后的外植體，用無(wú)菌水沖洗3～5遍，放入無(wú)菌盤中，切除莖段兩頭褐化部位，葉片切除葉尖、葉柄和葉片兩側(cè)備用。

1.3.2 愈傷組織誘導(dǎo)方法。

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基分為A1～A6，其中A1～A5以WPM為基本培養(yǎng)基，A6以MS為基本培養(yǎng)基，同時(shí)附加不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L，培養(yǎng)基調(diào)制為pH 5.8，具體配比見(jiàn)表2。將葉片切成大小均等4塊，背部朝下接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種4片，每個(gè)處理5瓶，3個(gè)重復(fù)。暗培養(yǎng)14 d后，培養(yǎng)光照強(qiáng)度1 500～1 800 lx，光照時(shí)間12 h/d，培養(yǎng)溫度（24±2）℃。接種30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率、褐化率。

1.3.3 愈傷組織分化處理方法。

分化培養(yǎng)基以WPM為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的細(xì)胞分裂素TDZ、ZT和生長(zhǎng)素NAA，同時(shí)添加蔗糖30 g/L，瓊脂6 g/L，調(diào)pH至5.8，具體配比見(jiàn)表3。將“23XXL”外植體誘導(dǎo)的愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基中，每瓶接種4塊，每個(gè)處理5瓶，3個(gè)重復(fù)。暗培養(yǎng)14 d后，培養(yǎng)光照強(qiáng)度1 500～1 800 lx，光照時(shí)間12 h/d，培養(yǎng)溫度（24±2）℃，培養(yǎng)30 d后觀察生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)平均芽分化數(shù)。

1.3.4 組培苗生根處理方法。

當(dāng)叢生芽生長(zhǎng)至3～5 cm時(shí)，將其從基部切割，接種至生根培養(yǎng)基上。生根培養(yǎng)基以WPM為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的生長(zhǎng)素NAA和IBA，同時(shí)添加蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L、活性炭1 g/L，pH調(diào)至5.8，具體配比見(jiàn)表4。生根培養(yǎng)基為g1～g5，其中g(shù)5培養(yǎng)基放入活性炭，接種后的叢生芽，暗培養(yǎng)14 d后，光照強(qiáng)度1 500～1 800 lx，光照時(shí)間12 h/d，培養(yǎng)溫度（24±2）℃，35 d后觀察生根情況并統(tǒng)計(jì)生根率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用DPS軟件和Excel軟件進(jìn)行各數(shù)量性狀的誘導(dǎo)率、分化數(shù)、生根率計(jì)算。

誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)愈傷的總數(shù)/接種外植體數(shù)×100%

褐化率=褐化的總數(shù)/接種外植體數(shù)×100%

平均芽分化數(shù)=分化出的芽總數(shù)/接種中間繁殖體數(shù)

生根率=生根株數(shù)/誘導(dǎo)株數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)高山杜鵑愈傷組織誘導(dǎo)的影響

高山杜鵑外植體接入培養(yǎng)基后，先進(jìn)行暗培養(yǎng)，14 d后再進(jìn)行光照培養(yǎng)。葉片接入培養(yǎng)基7 d后，邊緣出現(xiàn)卷曲現(xiàn)象，開始形成愈傷組織，其他外植體無(wú)任何變化；接入14 d后，莖段開始長(zhǎng)出愈傷，1W葉片相比其他生長(zhǎng)期的葉片長(zhǎng)出愈傷數(shù)量較多；苞片接種20 d后，才開始誘導(dǎo)愈傷組織。30 d天后觀察并統(tǒng)計(jì)高山杜鵑外植體誘導(dǎo)愈傷情況和褐化死亡情況。

由表5可知，加入不同濃度TDZ、ZT、NAA的培養(yǎng)基對(duì)高山杜鵑外植體愈傷組織的誘導(dǎo)率差異較大。1M葉片培養(yǎng)基中A3、A5培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為100%，且愈傷長(zhǎng)勢(shì)良好。而其他培養(yǎng)基誘導(dǎo)率在86.9%～97.9%；2W葉片在A1～A6培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導(dǎo)率均為100%，其中A5培養(yǎng)基愈傷生長(zhǎng)勢(shì)最好，而A1培養(yǎng)基愈傷長(zhǎng)勢(shì)一般；1W葉片誘導(dǎo)率除A1外，均為100%，其中A5、A6培養(yǎng)基的愈傷長(zhǎng)勢(shì)狀態(tài)最佳；苞片的最適基本培養(yǎng)基為MS，誘導(dǎo)率為94.0%；JM莖段培養(yǎng)基中，A4培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為87.5%；J2W莖段培養(yǎng)基中A3、A5培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率最高，均為100%。部分葉片愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)見(jiàn)圖1。

2.2 不同外植體對(duì)高山杜鵑愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表5可知，不同外植體愈傷組織褐化率差異顯著。1W和2W褐化率均為0，而1M葉片A1、A2、A4、A6均出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，其中A1培養(yǎng)基褐化率高于其他培養(yǎng)基，褐化率為10.8%。說(shuō)明1W葉片和2W葉片比1M葉片更適合誘導(dǎo)愈傷組織，幼嫩的葉片更適合作為外植體。苞片的A5培養(yǎng)基出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，褐化率達(dá)22.2%。JM莖段在6種培養(yǎng)基上均出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，其中A3培養(yǎng)基褐化率最高，為60.0%。J2W莖段在A4培養(yǎng)基上褐化率最高，為50.0%，而在A1、A3、A5培養(yǎng)基上均未出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。因此，高山杜鵑生長(zhǎng)14 d的莖段比生長(zhǎng)30 d 的莖段更適合作為外植體。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)高山杜鵑愈傷組織分化的影響

由表6可知，TDZ和ZT2對(duì)高山杜鵑愈傷組織分化起到促進(jìn)作用，隨著TDZ和ZT濃度的升高，平均芽分化數(shù)呈上升趨勢(shì)。其中1M、2W和1W的葉片愈傷組織在Z7培養(yǎng)基上的平均芽分化數(shù)均顯著高于其他處理，分別為0.92、0.83和0.72；苞片愈傷組織在7種培養(yǎng)基上的平均芽分化數(shù)差異不顯著；JM莖段愈傷在Z3培養(yǎng)基上的平均芽分化數(shù)高于其他培養(yǎng)基，為0.19；J2W莖段在Z1培養(yǎng)基上未分化出芽，Z2和Z7培養(yǎng)基平均芽分化數(shù)較低，為0.08，而在Z3～Z6培養(yǎng)基上無(wú)顯著差異。

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)高山杜鵑組培苗生根的影響

由表7可知，“5RE”品種在g2培養(yǎng)基中25 d和35 d的生根率均高于其他培養(yǎng)基，分別為45.50%和50.00%。在25 d時(shí) g1、g4培養(yǎng)基均未長(zhǎng)根。而35 d后，g1生根率與g2生根率均為50.00%；“6GR”品種生長(zhǎng)25 d時(shí)，在g2培養(yǎng)基中生根率高于其他培養(yǎng)基，為76.50%，35 d后生根率高達(dá)94.12%，而在g3～

g5培養(yǎng)基上35d的生根率均比25d的生根率增加；“23XXL”品種，生長(zhǎng)25 d時(shí)，g1培養(yǎng)基中生根率高于其他培養(yǎng)基，為83.40%，35 d后g1培養(yǎng)基生根率高達(dá)94.12%（圖2）。

3 討論

目前，高山杜鵑組織培養(yǎng)采用的外植體多為莖段、葉片、花苞、側(cè)芽和種子等。蘇家樂(lè)等^［7］選取高山杜鵑新品種富麗金陵幼嫩莖段，獲得了較高的組培成活率。董春枝等^［8］利用錦繡杜鵑、迎紅杜鵑、映山紅早春花后新發(fā)幼莖作為外植體，成功培養(yǎng)出大量的組培苗。湯桂鈞等^［9］選用高山杜鵑的莖段和莖尖進(jìn)行外植體誘導(dǎo)試驗(yàn)，成功培育出試管苗。陳平芬等^［10］以常綠雜交杜鵑一年生半木質(zhì)化莖段為外植體，運(yùn)用側(cè)芽建立杜鵑屬植物的組培快繁體系。王蔚瓊等^［11］采用高山杜鵑（Rhododendron lapponicum）“粉冠博士”的花苞誘導(dǎo)出不定芽，獲得試管苗。Preece等^［12］直接用葉片誘導(dǎo)得到叢芽；管耀義等^［13］選取高山杜鵑的嫩葉作為外植體和張楊軍等^［14］利用云錦杜鵑的葉片誘導(dǎo)出愈傷組織，并成功培育出組培苗。

該研究比較了高山杜鵑“23XXL”不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)情況。結(jié)果表明，葉片>苞片>莖段，其中2W葉片比1W葉片和1M葉片更適合誘導(dǎo)愈傷組織。而苞片誘導(dǎo)愈傷組織周期較長(zhǎng)，且愈傷組織分化能力較弱。該研究發(fā)現(xiàn)WPM+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L和WPM+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L均適合1M葉片、J2W莖段愈傷組織誘導(dǎo)，這與姜澤盛等^［15］利用莖段誘導(dǎo)愈傷的結(jié)果一致；2W葉片在6種培養(yǎng)基中均可誘導(dǎo)出愈傷組織，其中WPM+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L誘導(dǎo)出的愈傷組織狀態(tài)最佳；最適1W葉片誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基為WPM+TDZ 0.5～1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L和MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，誘導(dǎo)率均為100%；最適苞片誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，誘導(dǎo)率為94%；最適JM莖段誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基為WPM+TDZ 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)87.5%。上述結(jié)果表明，ZT和TDZ均適合高山杜鵑外植體誘導(dǎo)，且隨著TDZ濃度的增高，愈傷組織誘導(dǎo)率呈上升趨勢(shì)。

不同品種高山杜鵑適合的培養(yǎng)基也不同^［15］。杜鵑屬組織培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基主要有Read、Anderson、1/2MS、1/4MS、WPM等^［16］。Read培養(yǎng)耐寒落葉杜鵑時(shí)，研制出的Read培養(yǎng)基被廣泛應(yīng)用；Anderson^［17］在1975年研發(fā)了Anderson培養(yǎng)基應(yīng)用于杜鵑屬組培；李俊強(qiáng)^［18］用Anderson培養(yǎng)基對(duì)銀葉杜鵑的葉片和莖段培養(yǎng)，獲得很好的試驗(yàn)結(jié)果；何芳蘭^［19］發(fā)現(xiàn)木本植物培養(yǎng)基（WPM和Read）對(duì)杜鵑科植物非常有效。苗永美^［20］發(fā)現(xiàn)WPM培養(yǎng)基對(duì)誘導(dǎo)大樹杜鵑和桃葉杜鵑愈傷組織的效果很好，但在誘導(dǎo)銀葉杜鵑的愈傷組織時(shí)，效果不及Read培養(yǎng)基；湯桂鈞等^［9］采用1/4 MS進(jìn)行外植體誘導(dǎo)、叢芽增殖及試管苗生根試驗(yàn)，效果良好。該研究結(jié)果認(rèn)為，WPM培養(yǎng)基比MS更適合高山杜鵑外植體誘導(dǎo)愈傷組織，這與何芳蘭^［19］和苗永美^［20］的研究結(jié)果一致。

該研究發(fā)現(xiàn)葉片誘導(dǎo)的愈傷組織較莖段和苞片的愈傷組織分化好，其中最適1M葉片和1W葉片愈傷分化的培養(yǎng)基為WPM+ZT 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，平均芽分化數(shù)為0.92；最佳2W葉片愈傷分化的培養(yǎng)基為WPM+ZT 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L和WPM+TDZ 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L；最適J2M莖段、JM莖段愈傷分化的培養(yǎng)基為WPM+TDZ 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L；表明ZT濃度為2.5 mg/L、TDZ濃度為1.5 mg/L適合高山杜鵑愈傷組織分化。

從生根試驗(yàn)看出WPM+IBA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L和WPM+IBA 0.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L均適合“5RE”“6GR”和“23XXL”生根培養(yǎng)，生根率達(dá)88.89%～94.12%。且隨著生長(zhǎng)素NAA濃度的升高，生根率呈上升趨勢(shì)。這與劉玉冬等^［21］ 和陳妹幼^［22］的結(jié)果一致。另外，該研究生根培養(yǎng)基中添加活性炭能夠促進(jìn)高山杜鵑生根，這與周艷等^［23］的研究結(jié)果一致。

該研究結(jié)果為高山杜鵑組培生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持，為進(jìn)一步推動(dòng)高山杜鵑產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

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