銀杏內(nèi)生菌及其次生代謝產(chǎn)物多樣性和生防活性的研究進(jìn)展

摘要 銀杏是一種含有豐富內(nèi)生菌和次生代謝產(chǎn)物的藥用植物。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)銀杏內(nèi)生菌進(jìn)行了較多的研究，從銀杏的根、莖、葉、種子等部位分離出多種不同的內(nèi)生菌，通過(guò)培養(yǎng)發(fā)酵、分離、純化和鑒定，獲得了多樣化的次生代謝產(chǎn)物，如黃酮、萜類化合物等。這些化合物具有抗菌、抗氧化和抗病蟲(chóng)害等功能，在生物防治領(lǐng)域展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。綜述了銀杏內(nèi)生菌及其次生代謝產(chǎn)物的多樣性，并對(duì)其生物防治研究現(xiàn)狀進(jìn)行了總結(jié)，以期為銀杏內(nèi)生菌資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

關(guān)鍵詞 銀杏；內(nèi)生菌；次生代謝產(chǎn)物；多樣性；生物防治

中圖分類號(hào) Q 939 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）22-0020-09

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.22.003

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Endophytes of Ginkgo biloba and Its Secondary Metabolites Diversity and Biocontrol Activity

YANG Yu-wei ZHOU Xiang-ping3，YUAN Zhi-hui^2，4 et al

（1.College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128；2.College of Chemistry and Bioengineering，Hunan University of Science and Engineering，Yongzhou，Hunan 425199；3.Yongzhou Company，Hunan Tobacco Company，Yongzhou，Hunan 425100；4.Hunan Provincial Engineering Research Center for Ginkgo biloba，Yongzhou，Hunan 425199）

Abstract Ginkgo biloba is a medicinal plant rich in endophytes and secondary metabolites. In recent years，scholars at home and abroad have conducted more research on Ginkgo biloba endophytes，isolated a variety of different endophytes from the roots，stems，leaves，seeds and other parts of Ginkgo biloba，and obtained a variety of secondary metabolites，such as flavonoids and terpenoids，through culture fermentation，separation，purification and identification. These compounds have antibacterial，antioxidant and anti-pest and disease functions，and show good application prospects in the field of biological control. In this paper，the diversity of endophytes and their secondary metabolites was reviewed，and the research status of their biological control was summarized，in order to provide a reference for the development and utilization of endophytes in Ginkgo biloba.

Key words Ginkgo biloba;Endophytic bacteria;Secondary metabolites;Diversity;Biological control

基金項(xiàng)目 湖南省煙草公司永州市公司科技項(xiàng)目（YZ2022KJ04）；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目重點(diǎn)項(xiàng)目（21A0519）；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2023JJ50070，2022JJ30272）。

作者簡(jiǎn)介 楊雨微（1999—），女，湖南岳陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向：生物工程、微生物資源的開(kāi)發(fā)和利用。

*通信作者：方俊，教授，從事生物工程研究；何福林，教授，從事天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)與利用研究。

植物內(nèi)生菌（endophyte）是一類特殊的微生物，生活于植物組織、器官中，與植物共生，通常不會(huì)引起植物疾病，主要包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌^［1］。在各種植物的不同部位，包括木本和草本植物、單子葉和雙子葉植物^［2］，都存在內(nèi)生菌，這些內(nèi)生菌在寄主植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用，包括幫助宿主植物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，保護(hù)宿主對(duì)抗病原體，免受病原菌的侵害，有助于植物在不同的環(huán)境中更好的生存等。內(nèi)生菌是具有抗癌、抗菌和其他生物活性的次生代謝產(chǎn)物的重要來(lái)源。內(nèi)生菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，為開(kāi)發(fā)新的藥用化合物提供了支撐，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)^［3］。如內(nèi)生菌產(chǎn)生的黃酮、萜類等化合物，表現(xiàn)出抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗病蟲(chóng)害等生物活性，成為藥物研發(fā)的潛在來(lái)源。同時(shí)，內(nèi)生菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物防治，包括微生物農(nóng)藥、增產(chǎn)菌或生防菌等領(lǐng)域^［4］。 Selim等^［5］對(duì)內(nèi)生菌的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究后指出，內(nèi)生菌是生物活性次生代謝產(chǎn)物的重要來(lái)源，其產(chǎn)生的化合物可以廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

銀杏（Ginkgo biloba L.）屬落葉喬木，是一種古老的孑遺植物，其歷史可追溯到2億多年前，被譽(yù)為“活化石”，同時(shí)也是我國(guó)一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)的珍稀樹(shù)種。銀杏對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，能夠在不同類型的土壤和氣候條件下生長(zhǎng)，且自身具有很強(qiáng)的抗菌能力，使其在很長(zhǎng)的壽命內(nèi)幾乎不會(huì)感染植物病蟲(chóng)害^［6］，因此，銀杏被廣泛用作藥用植物，其種子、葉子和果實(shí)可用于制作具有抗菌、抗氧化、抗病蟲(chóng)害、抗癌等生物活性的藥物。這些藥物具有良好的藥理活性^［7］，即使長(zhǎng)時(shí)間使用也沒(méi)有副作用，因此市場(chǎng)上對(duì)銀杏的需求與日俱增。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者致力于優(yōu)化銀杏資源的開(kāi)發(fā)，以實(shí)現(xiàn)更高效、更環(huán)保的利用。研究表明，銀杏內(nèi)生菌也具有類似的抗菌活性，且能夠提高宿主在抗病、抗蟲(chóng)害和生長(zhǎng)發(fā)育等方面的能力。從銀杏的不同部位分離出的內(nèi)生菌多樣性非常豐富，其產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物約50%對(duì)各種病原體具有抗菌活性。一些次生代謝產(chǎn)物，如2-己烯醛，參與了植物對(duì)害蟲(chóng)的防御^［8］?；诖?，筆者總結(jié)近年來(lái)關(guān)于銀杏內(nèi)生菌及其次生代謝產(chǎn)物的多樣性和對(duì)植物病害的生物防治研究，以期為后續(xù)銀杏內(nèi)生菌資源的研究和挖掘提供參考。

1 銀杏內(nèi)生菌的多樣性

銀杏作為一種古老的植物，其內(nèi)生菌種類繁多，廣泛分布于其根、莖、葉、種子等不同組織部位，影響內(nèi)生菌多樣性的因素也很多^［9］，如時(shí)間、溫度、濕度等，能夠進(jìn)一步豐富銀杏內(nèi)生菌的多樣性。

內(nèi)生菌的多樣性通常可以通過(guò)對(duì)銀杏根系或土壤樣本進(jìn)行分析來(lái)評(píng)估。利用分子生物學(xué)技術(shù)，如高通量測(cè)序、原核微生物的16S rRNA、真菌的ITS、18S rRNA、還有DNA測(cè)序等，可以對(duì)內(nèi)生菌進(jìn)行鑒定和分類，從而研究其多樣性和種類組成^［10］。此外，通過(guò)觀察銀杏本身的生長(zhǎng)和生長(zhǎng)環(huán)境，也有助于研究其與內(nèi)生菌的共生關(guān)系。

1.1 銀杏內(nèi)生真菌

銀杏內(nèi)生真菌能夠在其生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要的作用，有效防止有害病原菌的入侵，保護(hù)宿主植物免受感染^［9］。已發(fā)現(xiàn)的銀杏內(nèi)生真菌包括青霉菌屬（Penicillium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、鏈格孢屬（Alternaria）、根霉屬（Rhizopus）、枝孢屬（Cladosporium）、毛殼菌屬（Chaetomium）、曲霉菌屬（Aspergillus）等，其多樣性十分豐富^［11］。如Wu等^［12］從銀杏葉、莖、根中一共分離出58株內(nèi)生真菌，隸屬于24個(gè)屬，包括青霉菌屬（Penicillium）、Cylindrocladiella屬、Cylintrocarpon屬、副磷球藻屬（Paraphaeosphaeria）、Clonostachys屬、Glionectria屬、木霉屬（Trichoderma）、絲霉屬（Scytalidium）、鉤球藻屬（Leptosphaeria）、叢孢子蟲(chóng)屬（Pleosporales）、副孔蟲(chóng)屬（Paraphoma）、硬殼孢子蟲(chóng)屬（Sclerostagnospora）、黑木耳屬（Auricularia）、巴塔利尼亞屬（Bartalinia）、褐藻屬（Phaeoacremonium）、赤霉屬（Bionectria）、鏈格孢屬（Alternaria）、鐮刀菌屬（Fusarium）、毛球藻屬（Chaetosphaeronema）、枝孢屬（Cladosporium）、擬莖屬（Phomopsis）等。Cui等^［13］從銀杏根皮中分離出27株可培養(yǎng)的內(nèi)生真菌，分屬6個(gè)不同屬，這些分離株在形態(tài)學(xué)上被鑒定為鏈格孢屬（Alternaria）、曲霉屬（Aspergillus）、炭疽菌屬（Colletotrichum）、鐮刀菌屬（Fusarium）、肉豆蔻屬（Myrothecium）和青霉屬（Penicillium），揭示了生活在銀杏樹(shù)內(nèi)部的內(nèi)生真菌的種類和數(shù)量。Qian 等^［14］從銀杏的根、莖、葉和樹(shù)皮中共分離到57個(gè)真菌菌株，其中15個(gè)根分離株、34個(gè)莖分離株、1個(gè)葉分離株和7個(gè)樹(shù)皮分離株。內(nèi)生真菌包括鏈格孢屬（Alternaria）、曲霉屬（Aspergillus）、Colletotrichum屬、鐮刀菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）、Pestalotiopsis屬、Phomosis屬、Trichoderma屬、木霉菌屬（Trichoderma）和未鑒定菌株有親緣關(guān)系。

1.2 銀杏內(nèi)生細(xì)菌

銀杏根際內(nèi)生細(xì)菌在植物的整個(gè)生長(zhǎng)代謝過(guò)程中起著重要作用，能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)、吸收土壤中的養(yǎng)分、并增強(qiáng)植物的抗性。然而，由于對(duì)銀杏內(nèi)生細(xì)菌的分離和培養(yǎng)方式的不同，導(dǎo)致銀杏根際中的內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究受到限制，因此，需要不斷開(kāi)發(fā)和改進(jìn)新的研究方式，以便獲得更多有關(guān)內(nèi)生細(xì)菌的信息^［15-16］。Zhang等^［17］從銀杏根際中成功分離了455株內(nèi)生細(xì)菌，其中320個(gè)來(lái)自根內(nèi)圈，135個(gè)來(lái)自根際?；?6S rRNA基因序列分析，確定細(xì)菌分離株的多樣性，涵蓋了放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）和熱球菌門（Deinococcus-Thermus）等8個(gè)門、20個(gè)類、42個(gè)目、67個(gè)科和38個(gè)屬。收集最多的是6個(gè)屬，分別是芽孢桿菌（Bacillus）、類芽孢桿菌（Paenibacillus）、鏈霉菌（Streptomyces）、黃桿菌（Flavobacterium）、根瘤菌（Rhizobium）和微桿菌（Microbacterium）。此外，銀杏根際還可能存在來(lái)自不同屬的其他物種，其中大多數(shù)物種來(lái)自芽孢桿菌屬（Bacillus）。從根內(nèi)圈（35屬）和根際（16屬）培養(yǎng)的內(nèi)生細(xì)菌屬種更為豐富，包括紅球菌屬（Rhodococcus）、微桿菌屬（Microbacillus）、Cocuria屬、鏈霉菌屬（Streptomyces）、Deinococcus屬、孢桿菌屬（Bacillus）、賴西尼芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、帕尼芽孢桿菌屬（Panibacillus）、Cohnella屬、根瘤菌屬等，這些細(xì)菌在根際和根內(nèi)層之間共存。 Islam等^［18］從銀杏樹(shù)的果實(shí)和葉片中分離出50個(gè)內(nèi)生細(xì)菌，銀杏葉中有11個(gè)分離株，銀杏果實(shí)中有39個(gè)分離株。分別來(lái)自不同的培養(yǎng)基，如LB培養(yǎng)基中有30個(gè)分離株、YNA培養(yǎng)基中有19個(gè)分離株、MRS培養(yǎng)基中有1個(gè)分離株。這些內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)多樣，呈現(xiàn)出圓形或不規(guī)則的細(xì)胞，菌落的顏色也各異，包括白色、米白色、透明、棕色、淺棕色、淺黃色、黃色或橙色，菌落邊緣呈現(xiàn)粗糙或波狀。這些數(shù)據(jù)充分證明了銀杏根際內(nèi)生細(xì)菌的豐富多樣性。

1.3 銀杏內(nèi)生放線菌

近年來(lái)，內(nèi)生放線菌在植物生長(zhǎng)、控制病害、防治害蟲(chóng)以及抑制植物的非生物脅迫等方面都具有重要作用。植物內(nèi)生放線菌定殖的豐富度和多樣性不僅會(huì)受到植物種類影響，也會(huì)受土壤的類型和其他相關(guān)環(huán)境條件不同程度的影響，因此不同地域的銀杏內(nèi)生放線菌的豐富度和多樣性有一定的差別。Yan等^［19］從銀杏種子中分離出一種新型內(nèi)生放線菌菌株，命名為 KM-1-2T，通過(guò)鑒定發(fā)現(xiàn)KM-1-2T代表一種新的鏈霉菌物種，其名稱為銀杏鏈霉菌屬。詹剛明等^［20］從銀杏中共獲得內(nèi)生放線菌80株，其中，從葉片上分離得到60株，從果實(shí)上得到 20株，分離比率為3∶1。所分內(nèi)生放線菌菌落大小各異，形態(tài)差異顯著，菌落顏色變化復(fù)雜，表明銀杏內(nèi)生放線菌具有豐富的生物多樣性。根據(jù)Himaman等^［21］的研究，銀杏內(nèi)生放線菌主要有7個(gè)優(yōu)勢(shì)菌種，分別為鏈霉菌屬（Streptomyces）、小單胞菌屬（Micromonaspora）、小雙孢菌屬（Microbispora）、弗蘭克氏菌屬（Frankia）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）和鏈孢囊菌屬（Streptosporangium）。與內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌相比，對(duì)內(nèi)生放線菌的研究還相對(duì)較少，且內(nèi)生放線菌一直都是生物防治的重點(diǎn)菌株，其中鏈霉菌所產(chǎn)生的抗生素備受關(guān)注。除此之外，還有很多其他的放線菌還有待進(jìn)行挖掘和研究。因此，銀杏內(nèi)生放線菌的多樣性仍有待深入探究。

銀杏內(nèi)生菌的多樣性及其功能特性匯總見(jiàn)表1。由表1可知，銀杏內(nèi)生菌種類非常豐富，這些菌株不僅在銀杏中被分離，從其他植物當(dāng)中也可以分離到^［21］。雖然已有研究表明銀杏內(nèi)生菌的多樣性很豐富，但是很多種類都是基于序列分析得到的，其純培養(yǎng)的數(shù)量還不多，可以采用現(xiàn)代培養(yǎng)方法，優(yōu)化培養(yǎng)條件，比如高通量的培養(yǎng)方法、模擬自然生境、適應(yīng)菌株的生長(zhǎng)等方式來(lái)培養(yǎng)特定菌株，以此增加純培養(yǎng)的數(shù)量。

2 銀杏內(nèi)生菌的次生代謝產(chǎn)物多樣性

研究表明，從銀杏中提取共有26種萜類化合物和83種分離出的黃酮類化合物，分別占銀杏標(biāo)準(zhǔn)提取物的6%和24%^［22］。此外，還發(fā)現(xiàn)了20種烷基酚酸和烷基酚等微量化合物，雖然含量較少，但由于其副作用也受到了廣泛研究。與銀杏共生的銀杏內(nèi)生菌也能產(chǎn)生類似的次生代謝產(chǎn)物^［23］，如黃酮類、萜類等，并且還能產(chǎn)生特殊的代謝產(chǎn)物用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的生物防治活性。銀杏內(nèi)生菌的次生代謝產(chǎn)物是通過(guò)發(fā)酵、提取和分離獲得的一系列化合物，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物的種類繁多，如生物堿（alkaloids）、酚類化合物（phenolic compounds）、三萜類化合物（triterpenes）、酮類化合物（ketones）和類黃酮（flavonoids）等。對(duì)銀杏內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究表明，毛霉菌發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了115種代謝產(chǎn)物，在曲霉菌中發(fā)現(xiàn)了44種代謝產(chǎn)物，在木霉屬中發(fā)現(xiàn)43種代謝產(chǎn)物。這3個(gè)屬的代謝產(chǎn)物占內(nèi)生原核生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的72%，從鐮刀菌、鏈格孢菌和青霉中分離出的次級(jí)代謝產(chǎn)物占比約21%。銀杏的許多代謝產(chǎn)物對(duì)致病菌金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和銅綠假單胞菌等有很強(qiáng)的抑制作用。其中最著名的成分是黃酮類和萜類化合物，這些化合物還可以用作治療外周動(dòng)脈疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腦動(dòng)脈硬化和腦老化的藥物或前藥。近年來(lái)，開(kāi)發(fā)新型具有抗菌活性的內(nèi)生菌和代謝產(chǎn)物成為研究的重要方向之一^［24］。

2.1 黃酮類化合物

黃酮類化合物是以黃酮（2-苯基色原酮）為母核而衍生的一類化合物，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。其中包括黃酮的同分異構(gòu)體及其氫化的還原產(chǎn)物，也即以C6—C3—C6為基本碳架的一系列化合物，結(jié)構(gòu)如圖2所示。黃酮類化合物在植物界分布很廣，在植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成苷類或碳糖基的形式存在，也有以游離形式存在的。天然黃酮類化合物母核上常含有羥基、甲氧基、烴氧基、異戊烯氧基等取代基。由于這些助色團(tuán)的存在，該類化合物多顯黃色。

黃酮類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物的一個(gè)重要類別，在植物發(fā)育和防御中發(fā)揮著多種作用^［25］。許多黃酮類成分具有止咳、祛痰、平喘、抗菌的活性，可護(hù)肝，解肝毒，抗真菌，治療急、慢性肝炎及肝硬化^［26］。銀杏中的黃酮類化合物是一種多酚類化合物，具有抗氧化和清除自由基的作用。銀杏葉中含有豐富的黃酮類化合物，如槲皮素（quercetin）、蘆?。╮utin）、異鼠李素（isorhamnetin）等^［27］。

銀杏黃酮及其苷類化合物表現(xiàn)出顯著的生物學(xué)作用，包括抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用^［28］。一些銀杏黃酮類化合物具有抗神經(jīng)炎癥和神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)^［29-30］。此外，銀杏內(nèi)生菌的研究中也分離到了不同的黃酮類化合物，這些化合物與銀杏中提取出的黃酮類化合物具有類似的功能。

Pan等^［6］從Czapek-Dox培養(yǎng)基培養(yǎng)的銀杏葉種子中分離出一種可產(chǎn)生黃酮類化合物的內(nèi)生真菌（Psathyrella candolleana），對(duì)肉湯和菌絲體的乙酸乙酯提取物進(jìn)行色譜分離，鑒定得到了麥角甾醇、2′-羥基查耳酮、肉豆蔻酸、順式-9-十八碳烯酰胺、槲皮素、羧基苯、尿嘧啶和煙酰胺。Zhou等^［31］從銀杏中分離出來(lái)的尖孢鐮刀菌GF521產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物包括蘆丁和山奈酚等。Qiu等^［32］研究發(fā)現(xiàn)，從銀杏樹(shù)枝中分離的菌株構(gòu)巢曲霉ST22和米曲霉SX10能夠產(chǎn)生酚類和類黃酮化合物。Wu等^［33］從銀杏根部分離出了曲霉屬銀杏內(nèi)生菌Gbtc2，該內(nèi)生菌可產(chǎn)生類黃酮化合物。通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，苯丙氨酸可促進(jìn)內(nèi)生菌Gbtc2產(chǎn)生的類黃酮。

綜上所述，銀杏中含有豐富的黃酮類化合物，這些化合物具有重要的抗氧化和抗炎作用（表2）。與銀杏共生的內(nèi)生菌也能產(chǎn)生類似的黃酮類化合物，為植物提供多種保護(hù)和功能。對(duì)銀杏內(nèi)生菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究還有待進(jìn)一步挖掘和深入探索，為開(kāi)發(fā)新的生物活性化合物提供更多的潛在資源。

2.2 萜類化合物

萜類化合物是銀杏主要的活性成分之一，其中最主要的就是二萜類和倍半萜類。銀杏內(nèi)酯也是銀杏內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中一種重要的生理活性物質(zhì)，具有多種藥理作用，如擴(kuò)張血管、抗凝血和抗炎等^［34-43］。因此，它們?cè)谥兴幒捅＝∑分斜粡V泛應(yīng)用，尤其在改善血液循環(huán)和記憶力方面。表3列舉了一些銀杏內(nèi)生菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物中的部分萜類化合物，如銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C和孢子蟲(chóng)內(nèi)酯等。

Cui等^［13］從銀杏根皮中分離出的內(nèi)生真菌SY0056，鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），從其代謝產(chǎn)物中成功分離出銀杏內(nèi)酯B。Qian 等^［14］從銀杏葉中分離出的內(nèi)生真菌GZUYX13，鑒定為Pestalotiopsis uvicolavia，在其生長(zhǎng)過(guò)程中，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中存在白果內(nèi)酯（BB）。Liu等^［41］從銀杏中分離出了一株橘黃色的內(nèi)生真菌，其產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物有果霉素A（fructigenine A）、β-谷甾醇（β-sitosterol）和孢子蟲(chóng)內(nèi)酯（sporothriolide）等化合物。Su等^［42］在銀杏葉中分離得到內(nèi)生真菌Paraphaeosphaeria sp.，從該內(nèi)生菌次生代謝物中分離出10種未描述的萜類化合物，包括聚酮-萜類雜交副萜酮，以及4種倍半萜類化合物A～D。

綜上所述，萜類化合物是銀杏中重要的藥理活性成分，銀杏內(nèi)生菌產(chǎn)生的萜類化合物與銀杏產(chǎn)生的同類物質(zhì)也有著相似的特性，這為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)銀杏內(nèi)生菌提供了潛在的資源和更多的可能性。

2.3 其他化合物

銀杏內(nèi)生菌的次生代謝產(chǎn)物除了黃酮類和萜類外，還有很多其他的化合物（表4）。從銀杏中分離出來(lái)的毛殼球菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物有毛球蛋白A、毛球蛋白C、毛球蛋白G、毛球蛋白Vb、毛球素A、毛球菌素D和過(guò)氧化麥角甾醇等^［46］。球毛藻菌屬產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物有3，4-二羥基苯基乙酸、4-氨基苯乙酸和3-甲基奧司林酸等^［44］。曲霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物包括 3-羥基-叔苯基、4，5-二甲氧基念珠菌素A、丙烯基念珠菌素C，對(duì)4″-脫氧念珠菌素A、4″-脫氧曲戊蛋白、4′-脫氧-3-羥基利培酮、曲霉菌病A、香豆素A和三芐基等^［45］。此外，Zhang 等^［47］從銀杏中分離的內(nèi)生真菌Chaetomium globosum No.04 的發(fā)酵液中分離純化了6 種生物堿，并鑒定出其結(jié)構(gòu)為Chaetoglobosin A、C、D、E、G、R。Yuan等^［43］從銀杏的根部分離出的內(nèi)生真菌Penicillium sp.YY-20，其提取物中得到了6種次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括腺苷、甲基b-D-呋喃核糖糖苷、腺嘌呤、20-脫氧腺苷、3-甲基哌嗪-2，5-二酮和20-脫氧尿苷。另外，Pan等^［48］從銀杏葉中分離出一種內(nèi)生真菌蕓苔鏈格孢 GL07，其可以產(chǎn)生果香揮發(fā)物，在GL03的次生代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了與銀杏精油成分相同的2，5-二羥基苯乙酮，β-紫羅蘭酮和壬醛。

3 銀杏內(nèi)生菌及次生代謝產(chǎn)物的生防活性

銀杏內(nèi)生菌的次生代謝產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和食品工業(yè)中有潛在的用途^［49］，銀杏內(nèi)生菌及其次生代謝產(chǎn)物的生防活性見(jiàn)表5。

3.1 銀杏內(nèi)生真菌及次級(jí)代謝產(chǎn)物的生防活性 由表5可知，

從銀杏中分離出的內(nèi)生真菌對(duì)植物有重要作用，包括促進(jìn)植物生長(zhǎng)和抑制病原菌的侵害等。Wu等^［12］從銀杏根中分離的內(nèi)生真菌中，其中一株青霉屬真菌（Penicillium cataractum SYPF 7131）對(duì)金黃色葡萄球菌FtsZ表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗菌活力。另外，Yuan等^［43］從銀杏的根部分離出的內(nèi)生真菌Penicillium sp.YY-20，其提取物中得到了6種次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括腺苷、甲基b-D-呋喃核糖糖苷等，通過(guò)光譜鑒定方法，這些化合物能夠抗氧化和促進(jìn)生長(zhǎng)的活性，對(duì)蘿卜、蕓薹屬植物種子發(fā)芽、甘藍(lán)型油菜和小白菜的生長(zhǎng)有刺激作用。Cui等^［13］從銀杏根皮中分離出的內(nèi)生真菌SY0056，鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），從其代謝產(chǎn)物中成功分離出銀杏內(nèi)酯B，具有生物活性化合物的潛力。張祖姣等^［50］從銀杏根、葉中分離出對(duì)青枯勞爾氏菌Ralstonia solanacearum有拮抗作用的內(nèi)生真菌，分離獲得的80株內(nèi)生真菌中有5株對(duì)青枯菌有拮抗作用，其中，Gbh45具有良好的抑菌效果和遺傳穩(wěn)定性，結(jié)合形態(tài)特征和ITS序列對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定，該菌株為球黑孢菌Nigrospora sphaerica，對(duì)姜青枯病的生物防治具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。Cao 等^［51］從銀杏葉分離出1株內(nèi)生真菌Nodulisporium sp.A21，它產(chǎn)生的孢子絲菌內(nèi)酯是聚酮類化合物，這種化合物對(duì)稻瘟病菌具有抑制作用。

銀杏的其他部位也獲得了有生防活性的內(nèi)生真菌。例如Pan等^［6］從Czapek-Dox培養(yǎng)基培養(yǎng)的銀杏種子中分離出1種可產(chǎn)生黃酮類化合物的內(nèi)生真菌（Psathyrella candolleana），產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中化合物槲皮素表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)二苯基苦味肼（CL5014.538 μg/mg）和化合物槲皮素、羧基苯和煙酰胺對(duì)金黃色葡萄球菌具有抗菌活性。另外，Zhao等^［52］從銀杏中分離出的內(nèi)生真菌CDW7在體外對(duì)植物病原真菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，是一種有前途的農(nóng)業(yè)菌核生防真菌。CDW7菌株具有對(duì)7種植物病原真菌的抗真菌活性以及對(duì)菌核病引起的油菜菌核腐病的生化防治潛力。CDW7的發(fā)酵液可以有效抑制菌核侵染油菜體內(nèi)的疾病發(fā)生，保護(hù)效率為8.59%。通過(guò)采用生物測(cè)定指導(dǎo)方法，分離并通過(guò)光譜分析鑒定7種已知代謝物，其中，毛細(xì)胞蛋白A和D對(duì)菌核鏈球菌表現(xiàn)出抑制活性。此外，還有報(bào)道從銀杏葉、根和其他部位分離得到的內(nèi)生真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)多種植物病原菌具有顯著的抑制活性。Li等^［44］研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)生真菌球毛菌培養(yǎng)產(chǎn)生了5種細(xì)胞松弛真菌毒素，對(duì)蘿卜幼苗生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。Zhang等^［47］從藥用植物銀杏中分離得到內(nèi)生真菌毛殼菌No.04。其次級(jí)代謝產(chǎn)物包括6種生物堿和3種非靶向生物堿的純化，發(fā)酵產(chǎn)生的化合物及其結(jié)構(gòu)鑒定為毛球蛋白、麥角甾醇、尿囊素和尿嘧啶等，對(duì)抗2種重要的植物病原真菌R.stolonifer和C.diplodiella有顯著的抑制活性。Zhang等^［53］從健康的銀杏葉中分離出的內(nèi)生真菌，鑒定為曲霉屬IFB-YXS，通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的生物活性化合物，對(duì)植物病原體的抗菌活性和機(jī)制，在這些化合物中，黃素顯著抑制植物病原菌Clavibacter michiganense亞種的生長(zhǎng)。Sepedonicus的最小抑菌濃度（MIC）值為0.31 μg/mL，其比鏈霉素（MIC 0.62 μg/mL）更有效，鏈霉素是已研究出的有效抗菌藥物。黃素做為1種有效的抗菌農(nóng)用化學(xué)品，有助于開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物。

綜上可知，銀杏內(nèi)生真菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物在生物防治中具有潛在的應(yīng)用前景。通過(guò)對(duì)這些內(nèi)生真菌的深入研究和開(kāi)發(fā)，有望找到更多具有抗病原菌活性的化合物，為生物防治提供更多有效的措施，從而保護(hù)環(huán)境和糧食安全，為人類健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展作出貢獻(xiàn)。

3.2 銀杏內(nèi)生細(xì)菌及次級(jí)代謝產(chǎn)物的生防活性

內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)在生物防治和醫(yī)藥方面有著抗菌和無(wú)毒害等優(yōu)點(diǎn)，其中芽孢桿菌為代表，能夠產(chǎn)生抗菌脂肽物質(zhì)。Yang等^［54］從銀杏葉中分離出2株內(nèi)生細(xì)菌為Fy11 和Zy44，這2株內(nèi)生細(xì)菌混合使用時(shí)能有效抑制辣椒疫病，其中Zy44 所產(chǎn)生的粗脂肽起著主要作用。將辣椒疫霉（Phytophthora capsici）接入到3 周大的辣椒苗上，第7 天和第15 天接入Fy11 和Zy44 的混合菌劑，防治效果分別達(dá)到84.8%和67.2%。李勃等^［55］從銀杏中分離內(nèi)生細(xì)菌A97，經(jīng)過(guò)一系列分析，可確認(rèn)該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。通過(guò)體外篩選和活體篩選相結(jié)合的方法進(jìn)行植物病原拮抗菌的篩選，得到內(nèi)生細(xì)菌A97對(duì)病原菌如鐮刀菌屬、鏈格孢菌屬及青霉菌屬菌有顯著的拮抗作用，即對(duì)于甘薯干腐病、梨黑斑病、柑橘綠霉、蘋果青霉等主要園藝產(chǎn)品采后病害具有顯著拮抗作用，能夠在宿主表面有效定殖，并顯著抑制果實(shí)表面及傷口處病原菌的侵染，具有良好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)潛力。

此外，Islam等^［18］從銀杏中分離的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)5種有害食源性致病菌的抗菌活性，即大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌。在分離的內(nèi)生細(xì)菌中，GbF-96、GbF-97和GbF-98對(duì)所有病原菌均表現(xiàn)出抗菌活性，抑制區(qū)范圍為33.47～9.55 mm。 GbF-96被鑒定為枯草芽孢桿菌，對(duì)所有測(cè)試細(xì)菌具有最高的抗菌活性。相比之下，GbF-96的乙酸乙酯提取物僅對(duì)蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌表現(xiàn)出抗菌活性。因此，從銀杏中分離內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌GbF-96可以有效抑制食源性病細(xì)菌，無(wú)論是菌株本身還是其代謝物。Yuan等^［56］從銀杏中分離到1種內(nèi)生細(xì)菌，命名為解淀粉芽孢桿菌CGMCC 5569，其提取物中得到一系列脂肽類抗真菌化合物，包括風(fēng)霉素、表面活性素和芽孢霉素等，對(duì)腐霉Lasiodiplodia rubropurpurea、L.crassispora和L.theobromae的生長(zhǎng)具有抑制活性（>65%）?？垢婢钚员砻鲀?nèi)生解淀粉芽孢桿菌CGMCC 5569及其生物活性成分可能為腐染的生物防治提供一種替代生物資源。王祖華等^［57］在銀杏中分離到枯草芽孢桿菌菌株YJ5，該菌株發(fā)酵液產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)能夠有效抑制草莓灰霉病原菌的生長(zhǎng)。范曉靜等^［58］在銀杏莖葉中分離內(nèi)生細(xì)菌，并且測(cè)定其體外抑菌活性及對(duì)辣椒果疫病的防治效果。一共分離出9株內(nèi)生細(xì)菌，其中菌株W5對(duì)檢測(cè)的6種病原菌均有抑制作用。Zhou等^［59］從銀杏根際發(fā)現(xiàn)了1株能產(chǎn)生類黃酮的球形細(xì)菌Deinococcus sp.43，對(duì)該菌株的全基因組進(jìn)行測(cè)序，并解釋一系列類黃酮合成代謝的基因。高效液相色譜（HPLC）結(jié)果表明，Deinococcus sp.43能夠產(chǎn)生黃酮類化合物，最大槲皮素產(chǎn)量為2.9 mg/L。這些研究結(jié)果表明，銀杏內(nèi)生細(xì)菌及其產(chǎn)生的活性物質(zhì)在生物防治中具有重要的應(yīng)用前景，有望為農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域提供新的生物防治手段和治療方法。

3.3 銀杏內(nèi)生放線菌及次級(jí)代謝產(chǎn)物的生防活性

放線菌由于其自身能產(chǎn)生抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物，因此在植物病害生物防治中應(yīng)用廣泛。目前對(duì)于銀杏內(nèi)生放線菌及其次生代謝產(chǎn)物生防活性的研究還相對(duì)較少。李玲玲等^［60］從健康的銀杏莖和葉片中分離出23株內(nèi)生放線菌，其中有3 株表現(xiàn)出了抑菌活性，XJF-2、XJF-8和XJF-13對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌活性，XJG-13對(duì)黑曲霉有抑菌活性，有抑菌活性菌株比例為13.0%。譚力等^［61］從銀杏的根、莖、葉中分離得到98、50、8株內(nèi)生放線菌，共計(jì)156株，其中有47株放線菌具有拮抗植物病原真菌活性。菌株KLBMP 5501表現(xiàn)出最佳的抗菌活性和廣譜性，經(jīng)過(guò)多項(xiàng)分類特征分析表明，菌株 KLBMP 5501是1株淺紫鏈霉菌（Streptomyces violascens），為放線菌在生物防治上的應(yīng)用提供新的菌種資源。詹剛明等^［20］從銀杏中分離到具有拮抗活性的內(nèi)生放線菌M和EAF-1，并對(duì)這2種菌進(jìn)行了了皿內(nèi)及盆栽生防活性檢測(cè)，結(jié)果表明，在皿內(nèi)試驗(yàn)中，M和EAF-1對(duì)玉米大斑病菌、辣椒炭疽病菌和玉米小斑病菌表現(xiàn)的抑菌圈較大，對(duì)棉花黃萎病菌的抑菌圈最小。在盆栽試驗(yàn)中，接種了EAF－1的番茄植株的番茄灰霉病發(fā)病率顯著降低，EAF-1表現(xiàn)出對(duì)番茄灰霉病菌有明顯的預(yù)防作用，由此可以看出，該菌在農(nóng)業(yè)生防方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。李慶蒙等^［62］從銀杏中分離篩選出拮抗放線菌奈良鏈霉菌（Streptomyces naraensis）對(duì)稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica）等植物病原真菌的相對(duì)抑制率高達(dá) 90% 以上。穆珊^［63］從銀杏中發(fā)現(xiàn)一株鏈霉菌 Streptomyces lycopersici RGN-GS-3 對(duì)番茄黃萎?。╒erticillium dahlia 和 Verticillium alboatrum引起的土傳病害）。

綜上可知，從銀杏中可以得到的內(nèi)生菌以及次級(jí)代謝物的種類眾多（表5），但目前研究仍較為集中在少數(shù)菌屬，如青霉菌、芽孢桿菌等，對(duì)于放線菌等其他菌屬的次級(jí)代謝物研究還比較少。因此，可以對(duì)不同屬的菌株進(jìn)行深入研究，將具有活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥等領(lǐng)域，進(jìn)一步發(fā)掘其在生物防治中的潛在作用。這些內(nèi)生菌及其次生代謝產(chǎn)物在生物防治中發(fā)揮著重要作用，通過(guò)利用內(nèi)生菌產(chǎn)生的生物活性化合物，可以更好地保護(hù)環(huán)境，減少對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的使用，同時(shí)利用這些天然資源，為生物防治提供潛在的發(fā)展前景^［64-65］。持續(xù)的研究和開(kāi)發(fā)，有望為植物病害控制提供更環(huán)保、高效的解決方案，確保農(nóng)作物的健康生長(zhǎng)和糧食安全。

4 總結(jié)與展望

目前對(duì)于銀杏內(nèi)生菌株的純培養(yǎng)數(shù)量仍然不足，對(duì)于內(nèi)生菌所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物有待進(jìn)一步挖掘，菌株主要集中在少數(shù)屬中，對(duì)其他屬的研究還不夠深入，而且內(nèi)生菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)的關(guān)鍵原因尚未完全厘清，還需要進(jìn)一步探索。雖然人們可以根據(jù)不同的病原菌疾病進(jìn)行研究，找出對(duì)應(yīng)的活性菌株，對(duì)某種特定的病原菌進(jìn)行針對(duì)性的有效抑制，但仍需進(jìn)一步思考內(nèi)生菌活性物質(zhì)的關(guān)鍵。內(nèi)生菌的生防活性的研究尚存不足，當(dāng)前內(nèi)生菌對(duì)于培養(yǎng)方法的要求還不足以表現(xiàn)其多樣性，被培養(yǎng)出的菌不多，因此急需找到一個(gè)新的高效的培養(yǎng)方法；同時(shí)，次生代謝產(chǎn)物依賴傳統(tǒng)方法進(jìn)行研究，分離到的很多化合物均已有研究，效率有待提高，因此急需開(kāi)發(fā)高通量的方法，另外，對(duì)于內(nèi)生菌抗菌、抗蟲(chóng)以及化合物合成的機(jī)制缺乏研究，真正應(yīng)用于生防的內(nèi)生菌較少。

該研究提供了對(duì)于銀杏內(nèi)生菌及次生代謝產(chǎn)物的多樣性和生物防治方面的參考，并為其他相關(guān)研究提供了方向。銀杏內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生大量新的生物活性化合物，這些化合物可被用作生物控制劑，幫助宿主植物抵抗外界環(huán)境的侵害，對(duì)抗病原菌、病蟲(chóng)害、促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育等，也可被用作藥物開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵成分。不管是在植物病害或是醫(yī)藥領(lǐng)域，這些具有生物活性的銀杏內(nèi)生菌及其次生代謝產(chǎn)物的多樣性為發(fā)現(xiàn)新藥提供了不竭動(dòng)力，成為研究新藥的潛在來(lái)源。這些藥物在植物病害防治中可以抑制病原菌、促進(jìn)植物生長(zhǎng)，在醫(yī)藥方面可以對(duì)抗癌癥和保健身體。銀杏中分離的內(nèi)生菌種類的多樣性能有效防治植物病原菌，銀杏內(nèi)生菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物（如黃酮類物質(zhì)和銀杏內(nèi)酯）對(duì)于人體也有很大的益處，可以用于治療心血管疾病等，因此，研究?jī)?nèi)生菌已經(jīng)成為防治植物病害和醫(yī)藥保健的重點(diǎn)發(fā)展方向，同時(shí)也有望為植物病害防治提供可持續(xù)、環(huán)保的解決方案。

一直以來(lái)，植物病害一直都是我國(guó)的熱點(diǎn)問(wèn)題，病原菌對(duì)于宿主植物的侵害越來(lái)越嚴(yán)重，而過(guò)度使用農(nóng)藥化肥對(duì)于土地和環(huán)境造成的嚴(yán)重污染，亟待高效無(wú)污染的植物病害防治方法解決。植物內(nèi)生菌是一種新型的微生物資源，其在微生物藥物方面的研究越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外的重視，生物防治是天然的藥物防治，具有安全、高效、環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)正朝著生態(tài)化的方向發(fā)展，對(duì)植物內(nèi)生菌及其次生代謝產(chǎn)物的研究與應(yīng)用已經(jīng)成為一個(gè)重要的研究方向。近年來(lái)，內(nèi)生菌及其次生代謝產(chǎn)物已經(jīng)逐漸成為防治植物病原菌有效藥物和抗病品種的重要來(lái)源，同時(shí)生物防治有利于減少環(huán)境污染、生產(chǎn)投入和農(nóng)藥的使用，符合農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展的要求，內(nèi)生菌產(chǎn)生的生物活性化合物對(duì)農(nóng)作物的生長(zhǎng)和健康具有積極的影響。通過(guò)研究和利用內(nèi)生菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，人們能夠開(kāi)發(fā)更環(huán)保、高效的生物控制劑，減少對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的依賴，提高作物的抗病能力和產(chǎn)量。同時(shí)，對(duì)內(nèi)生菌進(jìn)行深入研究，挖掘和利用其豐富的生物活性化合物，有望為新藥的發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)提供新的方向和可能性。因此，繼續(xù)探索和開(kāi)發(fā)內(nèi)生菌的潛力，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)藥領(lǐng)域都具有重要的意義。

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