托盤青岡葉綠體基因組特征及系統(tǒng)發(fā)育分析

摘 要 托盤青岡（Quercus patelliformis），作為青岡亞屬植物中的一種代表植物，有著巨大的經(jīng)濟價值。目前，關(guān)于托盤青岡葉綠體基因組的研究還未見報道。為有助于該物種的分子鑒定，首次報道了托盤青岡葉綠體基因組結(jié)構(gòu)與特征：托盤青岡葉綠體全基因組全長為160 910 bp，GC含量占基因總數(shù)的36.90%；其葉綠體基因組由1個大的單拷貝區(qū)（LSC，90 236 bp），1個小的單拷貝區(qū)（SSC，18 992 bp）和1對逆向重復(fù)區(qū)（IRs，各25 841 bp）組成；托盤青岡明顯偏好以A/U結(jié)尾的密碼子；此外，共檢測到116個簡單重復(fù)序列（SSR）和45個散在重復(fù)序列。在將托盤青岡與其他青岡亞屬植物進行比較分析時發(fā)現(xiàn)，它們的葉綠體基因組總體上比較保守，IR/SC邊界沒有明顯的收縮和擴展；還發(fā)現(xiàn)了4個高變異熱點，分別是trnK-rps16、trnF-ndhJ、rbcL-accD和ycf1。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，托盤青岡屬于青岡亞屬植物，且與赤皮青岡（Quercus gilva）有較近的親緣關(guān)系。

關(guān)鍵詞 托盤青岡；青岡亞屬；葉綠體基因組；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號：S718.46 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.19.001

櫟屬（Quercus）青岡亞屬（subgenus Cyclobalanopsi）植物是亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)的重要類群，目前全世界記載了90～120種[1]。長期以來，櫟屬青岡亞屬植物一直與人類生活密切相關(guān)，表現(xiàn)在其木材因堅硬和美麗的紋理而具有極高的價值，是建筑、家具甚至蘑菇栽培的優(yōu)質(zhì)材料[2]；此外，其殼斗和樹皮中富含單寧，可用于制備栲膠，而種子則可以用于飼料、釀酒和工業(yè)淀粉的生產(chǎn)[3]。托盤青岡是常綠喬木，它一般生長在海拔400～1 000 m的常綠闊葉林中，高可達25 m，胸徑可達1 m，我國江西（南部）、廣東、廣西等地均有分布[4]。目前，對托盤青岡的分類研究集中在形態(tài)學和核基因等方面，而對其系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系缺乏深入研究，其分類地位和種間關(guān)系也并不明確[5]。

葉綠體（cp）是一種半自主細胞器，負責淀粉等多種化合物的合成。以往的研究表明，這些細胞器有一套屬于自己的遺傳系統(tǒng)[6]。在不同的被子植物中，cp基因組的組成、排列和構(gòu)型通常是保守的[7]，因此它為研究植物品系和進化提供了寶貴的材料。此外，傳統(tǒng)的分類技術(shù)更依賴于植物的形態(tài)，與之相比，cp基因組已成為研究進化關(guān)系和種內(nèi)多樣性的更可靠的基因組材料來源[8]。隨著科學技術(shù)特別是二代測序的發(fā)展，cp基因組研究將繼續(xù)揭示更多植物生命的奧秘。本研究采用二代高通量測序技術(shù)對托盤青岡的cp基因組進行測序，再對其進行全面分析。

1 "材料與方法

1.1 "植物材料和DNA測序

本研究材料采自大明山自然保護區(qū)（廣西壯族自治區(qū)南寧市武鳴區(qū)兩江鎮(zhèn)明山路1號），將采集到的托盤青岡新鮮葉片第一時間進行干燥保存，再對提取的DNA進行雙端測序。使用FASTQ[9]軟件去除低質(zhì)量讀數(shù)后，獲得了用于分析的干凈數(shù)據(jù)（cleandata）。托盤青岡cp基因組DNA的提取和測序均由上海天昊生物科技有限公司完成。

1.2 "方法

1.2.1 "cp基因組組裝和注釋

首先，利用getOrganelle[10]軟件來裝配托盤青岡的cleandata；再將組裝好的數(shù)據(jù)放入CPGAVAS2[11]中進行注釋；最后把校正過的結(jié)果提交至美國國家生物信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫（登錄號：PP471978）。cp基因組的完整圖譜隨后在OGDRAW上繪制。

1.2.2 "散在重復(fù)序列和SSR分析

本研究使用REPuter[12]軟件來分析散在重復(fù)序列。采用特定的參數(shù)，包括最小重復(fù)長度30，漢明距離為3，其他的參數(shù)都是基于默認配置來設(shè)定的。利用了MISA[13]軟件對簡單重復(fù)序列（SSR）進行分析。不同的閾值用在不同的核苷酸重復(fù)序列上，具體參數(shù)設(shè)置如下：單核苷酸設(shè)置為10，二核苷酸設(shè)置為5，三核苷酸設(shè)置為4，四核苷酸設(shè)置為3，五核苷酸設(shè)置為3，六核苷酸設(shè)置為3，其他參數(shù)保持默認設(shè)置。對所有分析過的重復(fù)序列進行人工驗證，剔除多余的結(jié)果。

1.2.3 "密碼子使用頻度分析

本研究使用geneious prime 2022[14]，初步篩選了52個獨特的非重復(fù)序列，每個序列超過300個堿基對，包括ATG起始密碼子，為進一步分析做準備。利用CodonW 1.4.4[15]軟件對密碼子相對使用頻度（RSCU）進行統(tǒng)計學及偏好分析。

1.2.4 "cp基因組比較分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載青岡亞屬植物：扁果青岡（Quercus chapensis）等7個物種與托盤青岡共計8個物種的基因組數(shù)據(jù)，使用在線軟件IRscope（https：//irscope.shinyapps.io/irapp/）比較近緣物種的IR邊界（LSC/IRb、IRb/SSC、SSC/IRa和IRa/LSC）信息。采用DnaSPv5.1[16]計算8個cp基因組序列的核苷酸多樣性（Pi）。

1.2.5 "托盤青岡與其近緣物種系統(tǒng)發(fā)育分析

為了確定托盤青岡在櫟屬植物中的進化地位，以三棱櫟為外類群，13個青岡亞屬和5個櫟亞屬植物共計20個種的cp全基因組進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。首先利用MAFFT軟件對所獲得的序列數(shù)據(jù)進行高效比對分析，隨后采用MEGA11.0[17]來執(zhí)行更為準確的手工矯正工作，最后采用最大似然法（ML）和鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。為了提高系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的準確性和可靠性，將bootstrap值設(shè)定為1 000，這樣可以增強模型的穩(wěn)定性和預(yù)測能力，也有助于估計每個節(jié)點的真實支持率。

2 "結(jié)果與分析

2.1 "cp基因組的特征

由圖1（見封三）可見，托盤青岡cp基因組序列的總長為160 910 bp，呈現(xiàn)出典型的四方結(jié)構(gòu)，此四方結(jié)構(gòu)在大多數(shù)被子植物中均存在。其中LSC區(qū)域的長度為90 236 bp，IRs區(qū)域的長度為25 841 bp，SSC區(qū)域的長度為18 992 bp。GC含量在全基因組、LSC、SSC和IRs中分別為36.90%、34.74%、31.09%和42.77%。在被子植物中，比較常見的是IRs區(qū)域的GC含量明顯高于LSC、SSC區(qū)的GC含量，這是因為該區(qū)域存在rRNA基因[18]。

2.2 "散在重復(fù)序列、SSR的數(shù)量和類型

在生物學的復(fù)雜世界里，散在重復(fù)序列扮演著重要角色。正向重復(fù)序列（F）以一種固定的模式重復(fù)排列，回文重復(fù)序列（P）則表現(xiàn)為一種特殊的反向?qū)ΨQ性，反向重復(fù)序列（R）以相反方向進行復(fù)制，互補重復(fù)序列（C）則在DNA序列中形成一種互補配對。在托盤青岡cp基因組的研究中，我們總共檢測到了45個散在重復(fù)序列，包括16個F序列、23個P序列、5個R序列和1個C序列。這些重復(fù)序列大多數(shù)位于內(nèi)含子（Intron）和基因間隔區(qū)（IGS）中，少數(shù)位于外顯子中（見圖2）。

托盤青岡cp基因組中共檢測到116個SSR，包括單堿基80個、二堿基15個、三堿基7個，此外還有四堿基11個、五堿基3個，單堿基重復(fù)類型絕大部分表現(xiàn)為A/T（見圖3）。從基因的編碼區(qū)和非編碼區(qū)的角度分析，85個SSR位于基因間隔區(qū)，15個位于外顯子，16個位于內(nèi)含子中；從基因的四分體結(jié)構(gòu)分析，SSR有89個位于LSC區(qū)域，17個位于SSC區(qū)域，10個位于IRs區(qū)域。

2.3 "密碼子的使用頻度

圖4下方的方框代表編碼每個氨基酸的所有密碼子，直方圖的顏色與密碼子的顏色相對應(yīng)。通過對托盤青岡cp基因組中密碼子使用情況的研究，發(fā)現(xiàn)30個密碼子的RSCU取值都在1以上，說明它們經(jīng)常被使用，這些密碼子中有28個是以A或U結(jié)束的，暗示了它們的基因組傾向于以A/U結(jié)束。然而，目前對色氨酸和甲硫氨酸密碼子的RSCU均未表現(xiàn)出顯著的偏好性（RSCU=1）。

2.4 "邊界比較與序列變異分析

通過對8個青岡亞屬植物cp基因組的單拷貝區(qū)和反向重復(fù)區(qū)邊界進行比較（見圖5），觀察到青岡亞屬的cp基因組整體上呈現(xiàn)出較高的保守性。研究發(fā)現(xiàn)，trnH基因長度在各物種中保持為75 bp，但在托盤青岡和其他3個物種中擴增了16 bp，在毛果青岡和其他3個物種中擴增了14 bp，從而表明了在進化過程中的適應(yīng)性變化。rpl2基因與LSC-IRb邊界的距離變化在61～65 bp，表明在不同物種中，IR邊界存在微小的變異。ndhF基因在所有物種中都沒有觀察到跨越IRb-SSC邊界的現(xiàn)象。但是，華南青岡和托盤青岡在IRb-SSC的邊界位置展示了最大127 bp的擴展，這凸顯了基因組邊界區(qū)域的動態(tài)變化。

以檳榔青岡為參考，進行8種青岡亞屬植物cp基因組比對分析（見圖6）（見封三）?？梢钥闯觯鄬鶃唽僦参锞哂辛己玫木€性關(guān)系，表示這8種青岡亞屬植物的cp沒有發(fā)生重排和易位；還可以看出青岡亞屬植物cp基因組序列變異度小，其進化非常保守，但在一些區(qū)域也存在差異，差異程度在區(qū)域上主要表現(xiàn)為LSC＞SSC＞IRs，變異主要出現(xiàn)在序列的非編碼區(qū)（CNS）。

在對8個青岡亞屬植物進行深入的遺傳研究后，發(fā)現(xiàn)了一項引人注目的核苷酸多態(tài)性（Pi）現(xiàn)象。如圖7所示，反向重復(fù)區(qū)域的序列保守性相對高于單拷貝區(qū)域。基于這個觀察結(jié)果，本研究篩選了trnK-rps16、trnF-ndhJ、rbcL-accD和ycf1基因（Pi ＞ 0.010），確定它們是研究櫟屬物種間遺傳和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的潛在DNA條形碼。

2.5 "系統(tǒng)發(fā)育推斷

為了探索托盤青岡在櫟屬植物之間的系統(tǒng)發(fā)育位置，本研究以三棱櫟為外類群，包括托盤青岡在內(nèi)的19個櫟屬植物構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用ML法和NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其拓撲結(jié)構(gòu)基本一致（見圖8）。外類群三棱櫟最先從發(fā)育樹分化出來，其余19個櫟屬植物聚成兩大支：第一支是由14個物種組成的青岡亞屬支，托盤青岡也在這一支中，值得注意的是托盤青岡未與其他青岡亞屬物種聚為姐妹支，其與赤皮青岡的親緣關(guān)系最近。第二支是由5個物種組成的櫟亞屬支，此結(jié)果與鄧敏使用RAD-seq（限制性位點相關(guān)DNA測序）重建了青岡亞屬的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果一致。完整的cp基因組序列為今后的分類學或資源保護等工作奠定了基礎(chǔ)。

3 "結(jié)論與討論

3.1 "結(jié)論

本研究對托盤青岡cp基因組進行了測序，并對測序結(jié)果進行了全面分析。cp基因組的組裝和注釋顯示，托盤青岡的cp基因組呈現(xiàn)出標準的環(huán)狀四聚體構(gòu)造，cp基因組大小為106 910 bp。通過對基因組特征進行分析，發(fā)現(xiàn)托盤青岡cp基因組更喜歡以A/U結(jié)尾的密碼子。托盤青岡cp基因組中最常見的簡單重復(fù)序列是單核苷酸，主要以A/T為基礎(chǔ)。隨后將托盤青岡與7個青岡亞屬植物的cp基因組進行比較，發(fā)現(xiàn)IR/SC邊界沒有明顯的收縮和擴展，青岡亞屬cp基因組整體較為保守。此外，還發(fā)現(xiàn)了4個高變異熱點，分別是trnK-rps16、trnF-ndhJ、rbcL-accD和ycf1。系統(tǒng)進化分析表明，托盤青岡屬于青岡亞屬植物，且與赤皮青岡有較近的親緣關(guān)系?？偟膩碚f，托盤青岡的cp基因組基本特征與其他青岡亞屬植物相似，這些發(fā)現(xiàn)將有助于進一步研究櫟屬植物的分類、系統(tǒng)進化和保存。

3.2 "討論

櫟屬的分類系統(tǒng)已得到全球公認，但在這一框架內(nèi)對完整的cp基因組的分析和報告卻很有限[19]，本研究旨在通過分析托盤青岡的cp基因組來填補這一空白。本研究經(jīng)過Illumina測序平臺測序、序列組裝、注釋，獲取了托盤青岡cp完整的基因組序列，G/C堿基含量雖然低于A/T堿基，但GC含量在基因組結(jié)構(gòu)進化歷程中扮演了重要角色，它能影響復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯過程與熱穩(wěn)定性[20]。cp基因組序列之間的邊界位置是研究cp基因組進化的關(guān)鍵部分，IR邊界的收縮和擴展有助于闡明不同類群之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[21-22]。值得注意的是，IR/SC邊界位置可能會因IR區(qū)域發(fā)生變化，這是植物支原體基因組中常見的進化現(xiàn)象[23]。本研究中比較的所有物種的IRs/SCs邊界都位于相似的位置，不同物種之間的位移差異很小。青岡亞屬植物部分的保守性表現(xiàn)在cp基因組的長度相對恒定，其區(qū)域邊界的變化較小，這與其他青岡亞屬物種的情況相同[24]。密碼子使用偏好是生物進化的一個重要方面，受到影響遺傳密碼子功能的各種因素的影響[25]。同義密碼子是由突變產(chǎn)生的，其相對使用情況可通過RSCU進行量化，從而揭示不同基因?qū)γ艽a子偏好的差異[26]，通過RSCU分析，托盤青岡明顯偏好以A/U結(jié)尾的密碼。重復(fù)序列在存儲遺傳信息、影響基因表達及影響物種的遺傳進化等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[27]，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)單核苷酸重復(fù)序列最為常見。托盤青岡cp基因組中SSR顯示出較高的A/T堿基組成，表現(xiàn)出對A/T堿基的偏好。值得注意的是，本研究中并未檢測到六核苷酸重復(fù)序列，這與之前對青岡亞屬的研究結(jié)果一致[28]。我們還在托盤青岡cp基因組中發(fā)現(xiàn)了分散的重復(fù)序列，這些重復(fù)序列主要由F和P組成。

本研究以檳榔青岡基因組為參照，分析比較了托盤青岡在內(nèi)的8個物種。結(jié)果表明，這些cp基因組在編碼區(qū)表現(xiàn)出高度的保守性，而在非編碼區(qū)尤其是在LSC、SSC區(qū)表現(xiàn)出顯著的差異，這與大多數(shù)被子植物cp基因組表現(xiàn)出高度區(qū)域多樣性的結(jié)果相似[29]。進行的核苷酸多態(tài)性分析顯示了8個植物物種cp基因組中核苷酸多樣性值（Pi）的范圍。共篩選出4個高突變區(qū)域，即trnK-rps16、trnF-ndhJ、rbcL-accD和ycf1基因。由于ycf1基因在cp功能中的作用尚不完全清楚，這種變異可能反映了這些物種特定適應(yīng)性的進化。這些高變異區(qū)為開發(fā)分子標記提供了寶貴的資源，而且由于其遺傳多樣性，是開發(fā)物種特異性DNA條形碼的理想候選區(qū)[30]。

中國是世界公認的第二大櫟屬多樣性中心，在了解櫟屬物種進化方面面臨著巨大挑戰(zhàn)。盡管存在這些挑戰(zhàn)，鄧敏還是為櫟屬青岡亞屬建立了一個分類系統(tǒng)。然而，中國櫟屬唯一的分子系統(tǒng)學分析依賴于RAD-seq測序[31]。大多數(shù)利用cp基因組的研究都成功得到了高分辨率和支持良好的系統(tǒng)發(fā)育樹，即使是在系統(tǒng)發(fā)育上具有挑戰(zhàn)性的植物類群中也是如此。本研究中，我們構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，確定了托盤青岡在青岡亞屬植物中的大概位置。但是在這個系統(tǒng)發(fā)育樹中，托盤青岡并未與現(xiàn)已公布了cp基因組的物種聚為姐妹分支，因此還需要更多的數(shù)據(jù)來確定托盤青岡的具體位置。理想情況下，我們能根據(jù)cp基因組信息解決整個青岡亞屬乃至櫟屬的物種劃分問題，期待未來能找到破解櫟屬植物進化的奧秘。

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（責任編輯：易 "婧）