高通量類(lèi)器官培養(yǎng)及其在藥物篩選中的研究和應(yīng)用進(jìn)展

關(guān)鍵詞 類(lèi)器官；微流控；高通量；自動(dòng)化；藥物篩選；評(píng)述

藥物發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)是一個(gè)漫長(zhǎng)、復(fù)雜且昂貴的過(guò)程，涉及藥物的識(shí)別、臨床前驗(yàn)證和臨床試驗(yàn)[1]。傳統(tǒng)方法使用二維（2D）貼壁細(xì)胞模型和動(dòng)物模型進(jìn)行藥物測(cè)試。細(xì)胞模型提供了一種簡(jiǎn)單、穩(wěn)定和低成本的方法，但細(xì)胞模型中細(xì)胞之間相互作用弱且不能形成高仿真的生理結(jié)構(gòu)。動(dòng)物模型作為藥物篩選和評(píng)價(jià)的重要模型，存在成本高、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)的問(wèn)題，并且動(dòng)物與人體具有物種間差別，對(duì)藥物的響應(yīng)存在很大差異。研究表明，經(jīng)過(guò)常規(guī)細(xì)胞模型和動(dòng)物模型層層篩選的候選藥物在臨床試驗(yàn)和批準(zhǔn)階段的失敗率可高達(dá)90%[2-3]。

類(lèi)器官是干細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞等體外培養(yǎng)自組裝而形成的三維細(xì)胞復(fù)合體，可形成與體內(nèi)器官關(guān)鍵單元相似的結(jié)構(gòu)和功能。類(lèi)器官技術(shù)為人類(lèi)生理和疾病研究提供了全新的、更接近真實(shí)生理學(xué)狀態(tài)的疾病模型，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于器官發(fā)育、發(fā)病機(jī)制、藥物篩選和精準(zhǔn)醫(yī)療等研究領(lǐng)域[4-6]。在藥物篩選領(lǐng)域，為獲得可靠的結(jié)果需要大量的實(shí)驗(yàn)樣本和數(shù)據(jù)，類(lèi)器官的高通量生成和分析能力有助于減少偶然性和變異性。但是，在傳統(tǒng)基質(zhì)膠圓頂?shù)臉?biāo)準(zhǔn)類(lèi)器官培養(yǎng)方法中，細(xì)胞分化受到空間因素的影響較大，實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性較差[7-9]，并且類(lèi)器官的生成通常需要數(shù)周甚至數(shù)月，無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量分析。因此，開(kāi)發(fā)快速、高通量的類(lèi)器官生成技術(shù)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本文對(duì)高重復(fù)性且利于下游分析的類(lèi)器官微流控高通量培養(yǎng)技術(shù)、高通量給藥技術(shù)以及高通量結(jié)果檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，對(duì)當(dāng)前類(lèi)器官在藥物篩選領(lǐng)域的典型應(yīng)用進(jìn)行介紹和分析，并對(duì)基于類(lèi)器官的藥物篩選研究的未來(lái)發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1 微流控高通量類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)

微流控是在微米級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi)對(duì)微量流體進(jìn)行操控的技術(shù)。微流控系統(tǒng)具有試劑消耗少、分析通量高、易于集成化和自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)、環(huán)境監(jiān)測(cè)和臨床診斷等領(lǐng)域。在類(lèi)器官培養(yǎng)應(yīng)用領(lǐng)域，微流控技術(shù)的引入可以更精準(zhǔn)地調(diào)控類(lèi)器官的生長(zhǎng)微環(huán)境，提高仿真度，并且系統(tǒng)易于自動(dòng)化和集成化，可高通量地獲得形態(tài)一致性更高的高仿真類(lèi)器官[10-12]。高通量類(lèi)器官培養(yǎng)首先基于高通量獨(dú)立單元中類(lèi)器官的生成，根據(jù)類(lèi)器官培養(yǎng)單元生成方式，可將微流控高通量類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)分為3 類(lèi)：液滴類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)、微孔陣列類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)和微柱陣列類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)。

1.1 基于微流控液滴的類(lèi)器官培養(yǎng)

微流控液滴技術(shù)具有快速、高通量的液滴生成能力，可有效減少試劑消耗，縮短培養(yǎng)時(shí)間，提升培養(yǎng)類(lèi)器官尺寸的均一性，被廣泛應(yīng)用于類(lèi)器官培養(yǎng)方法的開(kāi)發(fā)[13]。根據(jù)液滴生成方式，微流控液滴技術(shù)可分為多相流液滴技術(shù)和生物打印液滴技術(shù)。

1.1.1 多相流液滴類(lèi)器官培養(yǎng)

基于多相流的液滴生成技術(shù)是通過(guò)操縱微通道中兩種或多種不互溶流體而生成大量液滴的技術(shù)[14]?；谟桶奈⒘骺匾旱渭夹g(shù)使用重懸細(xì)胞的水溶液作為分散相和添加了表面活性劑的油相作為連續(xù)相，在微流控芯片內(nèi)高通量地連續(xù)生成細(xì)胞液滴，經(jīng)培養(yǎng)后得到尺寸可控的類(lèi)器官。雖然將細(xì)胞封裝到液滴中的過(guò)程簡(jiǎn)單且快速，但封裝的細(xì)胞無(wú)法從周?chē)挠拖嘀蝎@得營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充，因此細(xì)胞難以在液滴中保持長(zhǎng)期的活力和功能[15-17]。改進(jìn)的方案是使用含有水凝膠前體的細(xì)胞懸液替代純水相的細(xì)胞懸液，經(jīng)微流控芯片生成細(xì)胞凝膠液滴后，凝膠固化得到各獨(dú)立的固體細(xì)胞凝膠微球，此后便可用水相培養(yǎng)液代替外圍油相進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)。可用凝膠材質(zhì)主要包括基質(zhì)膠、海藻酸鹽、殼聚糖、瓊脂糖和聚乙二醇等，其中，細(xì)胞外基質(zhì)衍生材料基質(zhì)膠已被廣泛應(yīng)用于類(lèi)器官的培養(yǎng)[13，18]。Zhang 等[19]采用多相流技術(shù)實(shí)現(xiàn)了基質(zhì)膠細(xì)胞液滴的生成（圖1A），通過(guò)溫度控制使基質(zhì)膠液滴向固相微球轉(zhuǎn)變，并將其收集于培養(yǎng)皿中進(jìn)行類(lèi)器官的長(zhǎng)期培養(yǎng)。采用該方法從健康的肝組織和肝腫瘤組織中培養(yǎng)出的類(lèi)器官具有類(lèi)似于親本組織的細(xì)胞群體和微觀結(jié)構(gòu)。另一種策略是在溫和的全水條件下制造核殼狀水凝膠微膠囊[20-21]。Liu 等[21]利用海藻酸鈉和帶相反電荷的殼聚糖的相互擴(kuò)散和界面絡(luò)合生成核殼狀的水凝膠膠囊（圖1B）。該技術(shù)可在1 min 內(nèi)產(chǎn)生數(shù)百至數(shù)千個(gè)尺寸可控的細(xì)胞膠囊，凝膠外殼可限制內(nèi)部細(xì)胞的尺寸和形狀，防止其過(guò)度生長(zhǎng)，有助于提升類(lèi)器官尺寸的均一性。此外，核殼結(jié)構(gòu)可增強(qiáng)凝固后材料的強(qiáng)度，使其可在旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。Lu 等[22]用海藻酸鹽殼優(yōu)化了基質(zhì)膠微球，得到的核殼結(jié)構(gòu)水凝膠膠囊培養(yǎng)于旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中，充分的液流擾動(dòng)可提高傳質(zhì)效率，有助于類(lèi)器官內(nèi)干細(xì)胞群更高效地?cái)U(kuò)增。藻酸鹽殼可以保護(hù)類(lèi)器官免受懸浮培養(yǎng)過(guò)程中的剪切力和冷凍保存過(guò)程中的潛在機(jī)械損傷，此外還可以被溶解以回收類(lèi)器官。由于膠囊內(nèi)傳質(zhì)的增強(qiáng)，該研究培養(yǎng)的胃癌類(lèi)器官具有更高的干細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)gr5 和細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67 表達(dá)水平，表明該方法培養(yǎng)的類(lèi)器官具有更高的干性和更高效的擴(kuò)增能力。

1.1.2 生物打印液滴

盡管多相流液滴是高通量類(lèi)器官生成的強(qiáng)大工具，但通常以液滴群的方式進(jìn)行回收，很難對(duì)單個(gè)液滴進(jìn)行獨(dú)立操作和測(cè)量。生物打印液滴能夠?qū)⒁旱我躁嚵械男问酱蛴≡陂_(kāi)放基板上或?qū)⑵渲苯臃峙涞脚c高通量檢測(cè)匹配的孔板中，從而解決后續(xù)的類(lèi)器官培養(yǎng)單元的獨(dú)立問(wèn)題。生物打印可以基于預(yù)設(shè)位置精確控制生物材料和細(xì)胞的空間沉積，具有高重復(fù)性、高通量和可控創(chuàng)建腫瘤模型的潛力，適用于高通量藥物篩選應(yīng)用[23-26]。同時(shí)，由于對(duì)高通量的要求，藥篩應(yīng)用領(lǐng)域的生物打印技術(shù)更強(qiáng)調(diào)其定位組裝細(xì)胞功能，而不是創(chuàng)建復(fù)雜仿生結(jié)構(gòu)的能力。Lawlor 等[27]使用基于擠出的生物打印技術(shù)以3 秒每個(gè)的速度在96 孔板的不同孔內(nèi)打印細(xì)胞和生物材料混合物，具有高度可重復(fù)性，培養(yǎng)的類(lèi)器官的尺寸變異系數(shù)為1%～4%。Dong 等[28]采用基于液滴的3D 生物打印方法構(gòu)建肺癌類(lèi)器官陣列，使用海藻酸鈉、透明質(zhì)酸和細(xì)胞粘附肽作為生物打印墨水，可在6 孔板的每個(gè)孔中打印生成12×12 陣列的類(lèi)器官（圖1C）。Jiang 等[29]將多相流液滴生成與基質(zhì)膠微球的3D 打印相結(jié)合，在不到10 min 的時(shí)間內(nèi)生成100～1000 個(gè)類(lèi)器官，并通過(guò)3D 打印機(jī)以大約每秒1 個(gè)類(lèi)器官的速度將單個(gè)類(lèi)器官接種至對(duì)應(yīng)孔中（圖1D）。得益于基質(zhì)膠液滴中的高細(xì)胞密度，類(lèi)器官的生長(zhǎng)時(shí)間以及類(lèi)器官間均勻性得到顯著改善。

1.2 基于微流控微孔陣列的類(lèi)器官培養(yǎng)

微孔是細(xì)胞聚集和3D 培養(yǎng)最常見(jiàn)的容器，可以通過(guò)微孔的結(jié)構(gòu)特征控制類(lèi)器官的尺寸和數(shù)量，并保障類(lèi)器官尺寸的均一性。微孔陣列可通過(guò)模具法、銑削和3D 打印等方式產(chǎn)生，在高通量類(lèi)器官培養(yǎng)方面具有很大的應(yīng)用潛力，研究者開(kāi)發(fā)了很多通過(guò)微孔進(jìn)行高通量類(lèi)器官培養(yǎng)的方法[ 30- 32]。Wiedenmann 等[31]制造了一系列六邊形PDMS 微孔，并在微孔中培養(yǎng)源自胰腺祖細(xì)胞的胰腺導(dǎo)管樣類(lèi)器官，微孔的使用促進(jìn)了胰腺祖細(xì)胞均勻聚集和類(lèi)器官的形成（圖2A）?；谠撐⒖仔酒l(fā)現(xiàn)了與胰腺癌發(fā)生相關(guān)的導(dǎo)管標(biāo)志物，進(jìn)一步將類(lèi)器官與基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，用于研究上皮和間充質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)，展示了微孔陣列在類(lèi)器官共培養(yǎng)研究中的潛力。類(lèi)似地， Brandenberg 等[32]開(kāi)發(fā)了U 型的水凝膠微孔，用于以無(wú)基質(zhì)的方式從均勻的干細(xì)胞聚集體中高通量生成胃腸道類(lèi)器官，采用該培養(yǎng)形式可實(shí)現(xiàn)數(shù)千個(gè)微孔陣列中類(lèi)器官的實(shí)時(shí)分析。相同數(shù)量細(xì)胞在微孔內(nèi)聚集培養(yǎng)可加速類(lèi)器官的生成速度，并可同步化群體內(nèi)異質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，有助于增加培養(yǎng)類(lèi)器官尺寸的均一性和重現(xiàn)性。每個(gè)微孔內(nèi)聚集生長(zhǎng)的單個(gè)類(lèi)器官使得動(dòng)態(tài)形態(tài)發(fā)生行為與下游測(cè)定（如免疫組化、DNA 或RNA 分析）一一對(duì)應(yīng)成為可能。

但是，高通量的微孔培養(yǎng)給細(xì)胞接種、換液和后續(xù)藥篩試劑的加入帶來(lái)了挑戰(zhàn)。為簡(jiǎn)化此過(guò)程，Hu 等[8]將微孔結(jié)構(gòu)與疏水涂層結(jié)合，開(kāi)發(fā)了一種具有疏水表面涂層的微孔芯片以取代傳統(tǒng)的96 孔板，用于培養(yǎng)肺癌類(lèi)器官（LCOs）和測(cè)量LCOs 對(duì)納升規(guī)模藥物的反應(yīng)（圖2B）。單個(gè)芯片（52 mm×37 mm）包含108 個(gè)微孔，凹陷微孔內(nèi)親水，微孔周?chē)砻嫱扛擦艘粚映杷繉?，多余的?xì)胞懸液從芯片中移除時(shí)，細(xì)胞懸液可以在微孔陣列中自發(fā)保留形成均勻的液滴陣列，微孔中的試劑可以通過(guò)向芯片中加入沒(méi)過(guò)微孔的培養(yǎng)基再抽走多余液體進(jìn)行整體更換，也可以通過(guò)預(yù)先制備與類(lèi)器官位置匹配的液滴陣列進(jìn)行單獨(dú)更換。在該芯片上培養(yǎng)的LCOs 顯示出與傳統(tǒng)孔板中培養(yǎng)的LCOs 相似的生長(zhǎng)速率和活力，形成了親本腫瘤組織的3D 結(jié)構(gòu)。另一種思路是將微通道與微孔結(jié)合，微通道可設(shè)置在微孔陣列的上方或下方，形成可灌流微孔。該方法已被用于胰島、肝臟和視網(wǎng)膜等多種類(lèi)器官的培養(yǎng)和分析，不僅便于試劑的更新，也可實(shí)現(xiàn)類(lèi)器官的仿真動(dòng)態(tài)培養(yǎng)[7，33-35]。Fang 等[7]設(shè)計(jì)了含10×20 微孔陣列的微流控芯片，微孔與介質(zhì)通道和壓力通道相連，基于外部泵送系統(tǒng)，介質(zhì)通道可進(jìn)行細(xì)胞和培養(yǎng)基的裝載，壓力通道可控制在微孔中生長(zhǎng)的人結(jié)腸腫瘤類(lèi)器官的周期性收縮，以模仿腸道肌肉的體內(nèi)機(jī)械刺激。但是，外部泵送裝置的使用要求芯片具有密封結(jié)構(gòu)，增大了芯片加工和使用難度。基于液位差的液體驅(qū)動(dòng)方式無(wú)需額外的外部泵送裝置，也可用于動(dòng)態(tài)類(lèi)器官培養(yǎng)。Rajasekar 等[35]設(shè)計(jì)了一種微流控芯片用于血管化類(lèi)器官的培養(yǎng)（圖2C），芯片上方采用類(lèi)似于孔板的開(kāi)放式設(shè)計(jì)，微孔底部加工微通道，允許培養(yǎng)基在孔間液位差的驅(qū)動(dòng)下流動(dòng)，無(wú)需額外泵送裝置。該芯片可同時(shí)培養(yǎng)多達(dá)128 個(gè)獨(dú)立灌注和血管化的結(jié)腸類(lèi)器官，并可將類(lèi)器官?gòu)目字刑崛∮糜谙掠畏治?。在恒定流速灌注下生長(zhǎng)的結(jié)腸類(lèi)器官在增殖和表型表達(dá)上明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)，為篩選潛在治療靶點(diǎn)和模擬相關(guān)疾病提供了有效的工具。

1.3 基于微流控微柱陣列的類(lèi)器官培養(yǎng)

微流控微柱陣列是類(lèi)器官生長(zhǎng)培養(yǎng)的另一種易于實(shí)施的形式。微柱之間的間隙可用于細(xì)胞的捕獲、聚集和空間分離。Zhu 等[36]設(shè)計(jì)了一種由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的微柱芯片（圖3A），允許在微柱陣列間進(jìn)行細(xì)胞捕獲并可控地形成胚狀體，可實(shí)現(xiàn)腦類(lèi)器官的原位分化和發(fā)育。將微柱陣列集成到灌流芯片中，可實(shí)現(xiàn)類(lèi)器官的長(zhǎng)期培養(yǎng)，還可研究動(dòng)態(tài)流體對(duì)類(lèi)器官發(fā)育和功能的影響。Wang 等[37]將灌流平臺(tái)與微柱陣列進(jìn)行集成（圖3B），除了可在微柱陣列間隙之間形成大小均勻的胚狀體，進(jìn)行肝臟類(lèi)器官的特異性分化和原位長(zhǎng)期培養(yǎng)之外，連續(xù)灌注培養(yǎng)液有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和代謝廢物的清除，避免了傳統(tǒng)方法所需的多次換液操作。與靜態(tài)條件下培養(yǎng)的類(lèi)器官相比，基于該灌流平臺(tái)的肝臟類(lèi)器官顯示出更高的細(xì)胞活力和更高水平的內(nèi)胚層基因和成熟肝臟基因表達(dá)。

同時(shí)，彼此獨(dú)立的微柱的端面也可作為細(xì)胞凝膠的接種平面，在此基礎(chǔ)上還可將微柱陣列與微孔陣列配合使用，實(shí)現(xiàn)微柱端面上含細(xì)胞的凝膠和微孔芯片中培養(yǎng)基的獨(dú)立控制，在高通量的條件下進(jìn)一步簡(jiǎn)化流程[38-40]?；谠撔问剑?Muckom 等[40]實(shí)現(xiàn)了單個(gè)微柱芯片中500 多個(gè)類(lèi)器官的并行高通量培養(yǎng)和無(wú)擾動(dòng)的換液（圖3C），微柱上的類(lèi)器官可連續(xù)培養(yǎng)80 d，消耗的試劑體積低于相應(yīng)96 孔板規(guī)格的0.2%，充分展示了微柱-微孔陣列相互配合在簡(jiǎn)化操作和減少試劑消耗方面的優(yōu)勢(shì)。

2 高通量給藥系統(tǒng)

為了進(jìn)行高通量藥物篩選，除了實(shí)現(xiàn)高通量類(lèi)器官培養(yǎng)外，還要解決高通量藥物濃度梯度生成和輸送的問(wèn)題。常規(guī)藥物篩選通常利用自動(dòng)化移液工作站實(shí)現(xiàn)高通量藥液的配制和加入。在類(lèi)器官培養(yǎng)單元微型化后，藥物配制和加入裝置也需要在體積方面實(shí)現(xiàn)匹配，因此，基于微流控技術(shù)的藥液濃度梯度生成和輸送裝置得到了廣泛應(yīng)用[41]。微流控給藥方法按結(jié)構(gòu)和工作方式不同可分為兩類(lèi)：基于微通道網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行濃度梯度生成和給藥以及基于藥物液滴陣列進(jìn)行高通量給藥。

2.1 基于微通道網(wǎng)絡(luò)的給藥系統(tǒng)

根據(jù)微通道結(jié)構(gòu)的不同，微流控微通道自動(dòng)化給藥裝置可分為并行微通道和樹(shù)狀分支微通道網(wǎng)絡(luò)兩類(lèi)。并行微通道可獨(dú)立控制各個(gè)通道灌注的液體，實(shí)現(xiàn)不同種類(lèi)藥物的并行加入[33，42]，便于不同藥物作用時(shí)間的控制。Schuster 等[33]基于并行微通道結(jié)構(gòu)開(kāi)發(fā)了高通量類(lèi)器官培養(yǎng)和分析系統(tǒng)（圖4A），基于微流控微孔陣列預(yù)先進(jìn)行類(lèi)器官的培養(yǎng)，完成后在微孔平面上方可逆封合上具有不同流體通道的芯片層，用于灌注藥物。該研究中的單個(gè)芯片可并行實(shí)現(xiàn)10 個(gè)樣品20 個(gè)條件的高通量藥物篩選。并行微通道實(shí)現(xiàn)了類(lèi)器官作用藥物的濃度、組合和時(shí)間的自動(dòng)化精確控制，顯著簡(jiǎn)化了操作流程，減少了差錯(cuò)的發(fā)生概率。但是，該類(lèi)裝置通常需要為各個(gè)并行通道配置不同藥物溶液并使用獨(dú)立的泵進(jìn)行驅(qū)動(dòng)，裝置的復(fù)雜程度和操作難度也隨著通道數(shù)的增加而顯著增大。

樹(shù)狀分支微通道網(wǎng)絡(luò)利用微尺度下低雷諾數(shù)層流擴(kuò)散混合的原理，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)并行藥物濃度梯度的生成，通過(guò)控制各輸入藥物的相對(duì)流速，作用于下游類(lèi)器官的藥物濃度可以連續(xù)改變，顯著減少了泵的需求量[41，43]?；跇?shù)狀分支微通道網(wǎng)絡(luò)自動(dòng)濃度梯度生成技術(shù)結(jié)合微流控液滴的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)， Song等[41]開(kāi)發(fā)了一種高效的腫瘤類(lèi)器官化療藥物評(píng)估平臺(tái)（圖4B）。海藻酸鹽凝膠微球中培養(yǎng)的胰腺癌類(lèi)器官預(yù)先裝載于芯片的培養(yǎng)室中，設(shè)計(jì)了八級(jí)樹(shù)狀分支通道用于藥物濃度梯度的生成，實(shí)現(xiàn)了不同化療方案的高通量動(dòng)態(tài)篩選。該研究比較了3 種不同患者來(lái)源的類(lèi)器官的藥物敏感性，結(jié)果與患者的臨床數(shù)據(jù)一致。在樹(shù)狀分支網(wǎng)絡(luò)濃度梯度形成過(guò)程中，可能存在層流效應(yīng)所導(dǎo)致的后續(xù)分支通道內(nèi)的溶液混合不完全的情況， Wang 等[43]在樹(shù)狀分支通道的濃度梯度生成的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了蛇形微通道混合器，蛇形的微通道結(jié)構(gòu)有利于上游通道中層流狀態(tài)不同的藥物溶液的充分混合，配合接種在下游腔室中的類(lèi)器官，可實(shí)現(xiàn)患者來(lái)源類(lèi)器官不同種類(lèi)藥物和濃度條件的篩選。由于樹(shù)狀分支微通道網(wǎng)絡(luò)上游入口的藥液種類(lèi)受擴(kuò)散距離限制，因此，在單一芯片上可同時(shí)施加的藥物種類(lèi)受限，通常不超過(guò)3 種，并且不同通道中實(shí)際濃度需經(jīng)過(guò)模擬和驗(yàn)證才能確定。

2.2 基于陣列微結(jié)構(gòu)的給藥系統(tǒng)

對(duì)于微孔或微柱類(lèi)陣列排布的類(lèi)器官，需要構(gòu)建與類(lèi)器官培養(yǎng)陣列位置相匹配的藥物液滴陣列，再將藥物液滴陣列與類(lèi)器官培養(yǎng)陣列進(jìn)行接觸即可實(shí)現(xiàn)高通量給藥。Lee 等[39]基于微柱的類(lèi)器官培養(yǎng)法，將患者來(lái)源的100 個(gè)癌細(xì)胞或正常細(xì)胞包裹在50 nL 海藻酸鹽中，分配在微柱陣列端面上進(jìn)行批量的類(lèi)器官培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后，再匹配預(yù)裝載有1 μL 藥液的微孔單元液滴陣列進(jìn)行高通量給藥，最終在25 mm×75 mm 面積的陣列芯片上實(shí)現(xiàn)了432 個(gè)類(lèi)器官的高通量藥物篩選測(cè)試（圖4C）。類(lèi)似地， Hu 等[8]基于微孔實(shí)現(xiàn)了類(lèi)器官高通量培養(yǎng)，通過(guò)自動(dòng)化液體工作站制備了與微孔結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的藥物液滴陣列，最終將藥液陣列與微孔類(lèi)器官凝膠陣列接觸，實(shí)現(xiàn)微孔類(lèi)器官芯片的高通量給藥。相較于微通道給藥，基于藥物液滴陣列的給藥方式更靈活，可自由選擇使用的藥物和濃度，但要求類(lèi)器官培養(yǎng)載體上方具有開(kāi)放的空間可供藥液陣列接觸。與直接使用自動(dòng)化液體工作站進(jìn)行給藥相比，使用陣列微結(jié)構(gòu)預(yù)先形成小體積藥物液滴陣列，對(duì)于一次性測(cè)試多個(gè)孔板/芯片的場(chǎng)景，可顯著降低細(xì)胞給藥操作的繁瑣程度，同時(shí)減少類(lèi)器官批間給藥時(shí)間的差異。

3 高通量藥物篩選結(jié)果檢測(cè)

為了實(shí)現(xiàn)真正的高通量篩選，除了高通量類(lèi)器官培養(yǎng)和給藥兩個(gè)環(huán)節(jié)外，高通量結(jié)果的檢測(cè)同樣不可或缺。在類(lèi)器官藥物篩選中，細(xì)胞存活率和代謝活性是兩個(gè)最基本的檢測(cè)指標(biāo)，通常使用酶標(biāo)儀或顯微鏡進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)。酶標(biāo)儀作為MTT、CCK8 和CTG 等方法的檢測(cè)儀器，可自動(dòng)化高通量地進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)。通常，酶標(biāo)儀僅能提供單一的細(xì)胞存活率的信息，通過(guò)結(jié)合酶聯(lián)免疫分析方法，也可實(shí)現(xiàn)生物標(biāo)志物（如腎損傷標(biāo)志物KIM-1[44]）的定量分析。

基于酶標(biāo)儀的檢測(cè)方法要求類(lèi)器官培養(yǎng)單元布局與常規(guī)多孔板兼容，對(duì)于不符合常規(guī)多孔板布局的定制化類(lèi)器官陣列，酶標(biāo)儀無(wú)法實(shí)現(xiàn)獨(dú)立類(lèi)器官的信號(hào)檢測(cè)。使用顯微鏡進(jìn)行顯微成像分析是高通量類(lèi)器官藥篩結(jié)果檢測(cè)的另一種常見(jiàn)手段，可獲得比酶標(biāo)儀檢測(cè)更豐富的信息。通過(guò)明場(chǎng)顯微成像，可獲得不同時(shí)間序列的類(lèi)器官尺寸和形態(tài)變化信息。通過(guò)共聚焦顯微成像，使用鈣黃綠素-AM/碘化丙錠或鈣黃綠素-AM/乙錠同源二聚體的雙熒光染色法可對(duì)類(lèi)器官中的活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行成像，通過(guò)對(duì)活/死細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)或?qū)ο鄳?yīng)熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，可獲得細(xì)胞存活率。但在常規(guī)類(lèi)器官培養(yǎng)方案中，類(lèi)器官通常被嵌入基質(zhì)膠中培養(yǎng)，所得類(lèi)器官分布在基質(zhì)膠的不同深度位置上，這給顯微檢測(cè)快速準(zhǔn)確定位成像焦平面造成了困難，基于微孔[32，45]或基質(zhì)膠平面[45-46]的類(lèi)器官培養(yǎng)方法可實(shí)現(xiàn)類(lèi)器官在特定平面上的準(zhǔn)確定位培養(yǎng)，由此可提高類(lèi)器官成像速度。Gunasekara 等[46]開(kāi)發(fā)了一種水凝膠特定平面定位培養(yǎng)結(jié)腸類(lèi)器官的分析平臺(tái)。不同于常規(guī)類(lèi)器官包埋的培養(yǎng)方法，該研究在孔板內(nèi)基質(zhì)膠的上表面培養(yǎng)結(jié)腸類(lèi)器官，無(wú)需變焦即可快速掃描幾近于平面上的類(lèi)器官，培養(yǎng)得到的類(lèi)器官的細(xì)胞類(lèi)型、極性和增殖與水凝膠包埋培養(yǎng)的類(lèi)器官相似。得益于單平面的快速顯微成像，該平臺(tái)可在不到4 h 內(nèi)檢測(cè)獲得2248 個(gè)結(jié)腸類(lèi)器官的藥物反應(yīng)。除了通過(guò)控制培養(yǎng)類(lèi)器官的空間分布情況來(lái)提升檢測(cè)速度外，使用自動(dòng)化高速成像分析儀也可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。與普通手動(dòng)操作的顯微鏡和激光共聚焦顯微成像儀不同，高內(nèi)涵成像分析儀可實(shí)現(xiàn)高速高通量自動(dòng)成像和高效多參數(shù)數(shù)據(jù)分析管理，能夠在單細(xì)胞水平上同時(shí)檢測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞的多靶點(diǎn)和多參數(shù)的影響[44，47-48]。該技術(shù)能夠在復(fù)雜的培養(yǎng)環(huán)境中揭示化合物對(duì)類(lèi)器官的作用機(jī)制，大大擴(kuò)展了藥物篩選評(píng)價(jià)維度，提高了篩選的準(zhǔn)確性，結(jié)合液體工作站，可在短時(shí)間內(nèi)處理分析大量樣本，加速研究進(jìn)程。Czerniecki 等[44]使用高內(nèi)涵成像分析儀在15 min 內(nèi)對(duì)384 孔板中的類(lèi)器官進(jìn)行自動(dòng)快速熒光成像掃描，基于機(jī)器學(xué)習(xí)對(duì)熒光圖像進(jìn)一步分析，實(shí)現(xiàn)了類(lèi)器官的識(shí)別和多維表型鑒定。搭配液體工作站的自動(dòng)化藥液操作，完成了腎類(lèi)器官分化過(guò)程的優(yōu)化，證明了高內(nèi)涵成像分析儀結(jié)合液體工作站自動(dòng)化體系在藥物毒性測(cè)試、疾病建模和疾病機(jī)理分析方面的巨大應(yīng)用潛力。

除了上述基于酶標(biāo)儀和顯微鏡的檢測(cè)手段外，微流控系統(tǒng)也可將各種傳感器集成于類(lèi)器官培養(yǎng)容器中，這些傳感器將類(lèi)器官的生化信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)直接讀出，可連續(xù)監(jiān)測(cè)類(lèi)器官在培養(yǎng)過(guò)程中分泌的相關(guān)功能分子水平[49-50]。連續(xù)監(jiān)測(cè)類(lèi)器官培養(yǎng)系統(tǒng)中生物標(biāo)志物水平為藥篩結(jié)果評(píng)估提供了更豐富的時(shí)空信息[51-53]，可更好地理解和模擬生物體內(nèi)復(fù)雜的細(xì)胞行為，有助于提高藥物篩選的效率和準(zhǔn)確性。

4 類(lèi)器官在藥物篩選中的應(yīng)用

類(lèi)器官的結(jié)構(gòu)和功能相較于二維細(xì)胞和三維細(xì)胞球具有更高的仿真度，因此成為藥物篩選的理想模型。根據(jù)藥篩目的，可將類(lèi)器官藥物篩選應(yīng)用分為臨床藥物篩選和新藥測(cè)試兩大類(lèi)。

4.1 臨床藥物篩選

由于患者個(gè)體的差異，抗癌藥物的臨床前篩選對(duì)于指導(dǎo)臨床治療具有十分重要的價(jià)值[28]?；颊邅?lái)源的異種移植物（Patient-derived xenograft， PDX）可以重復(fù)傳代，保留了腫瘤結(jié)構(gòu)和遺傳特征，可作為研究患者治療反應(yīng)的模型。然而， PDX 價(jià)格昂貴且生成速度慢，限制了其在藥物篩選和精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用。相比之下，患者來(lái)源的腫瘤類(lèi)器官（Patient-derived organoids， PDO）為臨床應(yīng)用提供了速度更快、成本更低、通量更高的模型。PDO 特指干細(xì)胞來(lái)源于腫瘤活檢或手術(shù)切除樣本，并在體外培養(yǎng)得到的三維模型[4]。PDO 代表了新一代的體外腫瘤模型，可用于預(yù)測(cè)個(gè)體患者對(duì)不同抗癌藥物的臨床反應(yīng)，可在一定程度上避免因個(gè)體腫瘤異質(zhì)性導(dǎo)致的用藥失敗[54-55]。一些研究已經(jīng)證實(shí)PDO 保留了原始腫瘤的基因組和組織學(xué)特征，可用于個(gè)性化癌癥治療[56-57]，目前已經(jīng)成功建立了乳腺癌[58]、結(jié)直腸癌[59]、胃癌[60]、肝癌[61]、胰腺癌[62]、食管癌[63]、前列腺癌[64]、膀胱癌[65]和卵巢癌[56]等PDO，這些PDO 在篩選抗癌藥物、預(yù)測(cè)治療反應(yīng)、優(yōu)化免疫治療和識(shí)別預(yù)后生物標(biāo)志物方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。Yao 等[64]以Ⅲ期臨床試驗(yàn)患者直腸腫瘤活檢組織為來(lái)源，制備了80個(gè)類(lèi)器官，成功率為77.0%～85.7%，并以細(xì)胞活力和類(lèi)器官大小等指標(biāo)評(píng)估了這些患者來(lái)源的類(lèi)器官對(duì)5-氟尿嘧啶和伊立替康等抗癌藥物和放療的敏感性，整個(gè)評(píng)估過(guò)程可控制在4 周時(shí)間內(nèi)（圖5A）。培養(yǎng)的直腸癌類(lèi)器官反映了原始腫瘤的病理生理學(xué)特征， PDO對(duì)放化療的反應(yīng)與患者實(shí)際臨床放化療的反應(yīng)高度一致，由此證明了PDO在預(yù)測(cè)臨床直腸癌患者對(duì)放化療反應(yīng)的能力。類(lèi)似地， Vlachogiannis 等[54]基于71 名參加Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)的患者建立了膽管癌、結(jié)直腸癌和胃食管癌的類(lèi)器官生物庫(kù)并應(yīng)用于臨床藥物的測(cè)試，測(cè)試結(jié)果與患者臨床藥物反應(yīng)具有88%的一致性，證明了類(lèi)器官在預(yù)測(cè)患者藥物反應(yīng)方面具有應(yīng)用能力。

雖然PDO在預(yù)測(cè)患者對(duì)抗癌治療反應(yīng)方面的能力已得到廣泛認(rèn)可，但采用常規(guī)方法構(gòu)建PDO通常需要3～4周時(shí)間，耗時(shí)長(zhǎng)且效率低，這在很大程度上阻礙了PDO藥物敏感性測(cè)試在臨床上的應(yīng)用，尤其在面對(duì)僅能獲取含有少量細(xì)胞的活檢穿刺樣本時(shí)，常規(guī)類(lèi)器官培養(yǎng)少量細(xì)胞需要經(jīng)歷更長(zhǎng)的增殖時(shí)間才能獲得足夠的細(xì)胞，以滿(mǎn)足后續(xù)的藥物篩選需求。針對(duì)該問(wèn)題， Ding 等[67]使用多相流液滴微流控技術(shù)，從活檢穿刺的少量患者組織中快速生成數(shù)千個(gè)液滴，每個(gè)液滴中僅包含30～50 個(gè)細(xì)胞。該研究在14 d內(nèi)完成了PDO腫瘤藥物的敏感性測(cè)試。Hu 等[8]設(shè)計(jì)了集成的超疏水微孔陣列芯片，可在納升尺度上操作液體，由此顯著減少了細(xì)胞和試劑的消耗。該研究證明了培養(yǎng)所得類(lèi)器官在形態(tài)學(xué)、組織病理學(xué)、突變譜和基因表達(dá)等多方面與原始腫瘤的一致性。由于微孔孔徑在100 μm 的尺度范圍，無(wú)需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)增，獲得的類(lèi)器官可在1 周內(nèi)完成臨床藥物的敏感性測(cè)試。藥物敏感性測(cè)試結(jié)果與臨床數(shù)據(jù)相符，證明了PDO在預(yù)測(cè)患者治療反應(yīng)方面具有巨大的應(yīng)用潛力。

4.2 新藥測(cè)試

新藥的開(kāi)發(fā)過(guò)程漫長(zhǎng)、復(fù)雜且成本高昂，即便是進(jìn)入臨床階段的藥物，最終成功上市的比例低于10%，其中一個(gè)重要原因是目前臨床前藥物篩選所用的細(xì)胞和動(dòng)物模型存在局限性[68]。臨床前研究采用合適的模型可加速藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程，提高臨床試驗(yàn)階段的成功率。相比于二維細(xì)胞和球狀體，類(lèi)器官是一個(gè)更能模擬體內(nèi)環(huán)境的模型[68-69]，一些基于液滴、微孔和微柱的微流控技術(shù)已被應(yīng)用于高通量類(lèi)器官新藥測(cè)試研究中[28，39，68，70-71]。Hou 等[68]基于生物打印液滴技術(shù)與非細(xì)胞粘附表面，設(shè)計(jì)了一種與高通量藥物測(cè)試兼容的方法，可以在標(biāo)準(zhǔn)平底384 孔板和1536 孔板中生產(chǎn)均一的類(lèi)器官，使用ATP 化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行快速的結(jié)果讀出。基于該方法完成了約3300 種臨床藥物的細(xì)胞毒性試驗(yàn)，證明了類(lèi)器官在高通量藥物毒性測(cè)試中的應(yīng)用潛力。

人體是一個(gè)由多個(gè)器官組成的復(fù)雜系統(tǒng)，單一類(lèi)器官雖然在一定程度上能對(duì)藥物做出仿真度更高的反應(yīng)，但無(wú)法模擬體內(nèi)多器官的復(fù)雜環(huán)境及其彼此之間的相互作用。近年來(lái)，研究者開(kāi)發(fā)了多類(lèi)器官組合研究體系，以更好地模擬藥物和器官相互作用[66，72]。Skardal 等[66]基于微孔和灌流通道，開(kāi)發(fā)了一個(gè)多類(lèi)器官共培養(yǎng)的微流控平臺(tái)（圖5B）。該平臺(tái)在公共培養(yǎng)基的循環(huán)灌流下支持多達(dá)6 種不同類(lèi)型類(lèi)器官（肝臟、心臟、血管、肺、睪丸、結(jié)腸或大腦）的共培養(yǎng)。集成在芯片上的類(lèi)器官可長(zhǎng)期保持高活性并表達(dá)功能性生物標(biāo)志物?；诖似脚_(tái)，無(wú)毒性的前藥被功能性肝臟類(lèi)器官代謝，并產(chǎn)生影響相鄰類(lèi)器官的有害代謝物，該過(guò)程展示了這種集成多類(lèi)器官平臺(tái)在藥物安全性評(píng)估方面的應(yīng)用價(jià)值。類(lèi)似地，Tao 等[72]基于微孔和灌流通道，構(gòu)建了源自誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的肝和胰島類(lèi)器官相互作用系統(tǒng)。微孔的結(jié)構(gòu)使得培養(yǎng)的類(lèi)器官具有較好的一致性，可灌流的連接通道實(shí)現(xiàn)了肝和胰島類(lèi)器官的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)和相互作用，在系統(tǒng)中添加降糖藥物二甲雙胍可顯著改善高血糖引起的肝臟和胰島病理?yè)p傷，初步展示了該種類(lèi)器官相互作用芯片系統(tǒng)在疾病模擬和藥物評(píng)估方面的可行性和較好的應(yīng)用前景。

5 總結(jié)與展望

類(lèi)器官技術(shù)在很大程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)二維細(xì)胞模型與復(fù)雜人體之間的差距，將類(lèi)器官應(yīng)用于藥物篩選可顯著推進(jìn)個(gè)性化醫(yī)療和新藥研發(fā)的進(jìn)程。微流控技術(shù)具有微量和精確的流體控制能力，與類(lèi)器官結(jié)合可精確控制類(lèi)器官的生長(zhǎng)和給藥過(guò)程，有助于實(shí)現(xiàn)類(lèi)器官藥物篩選的標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化。微流控液滴、微孔和微柱類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)類(lèi)器官的高通量、高一致性培養(yǎng)，同時(shí)結(jié)合微流控的微通道網(wǎng)絡(luò)，可實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)的類(lèi)器官培養(yǎng)和高通量給藥。類(lèi)器官能夠再現(xiàn)原始腫瘤的病理生理學(xué)特征及分子表型，通過(guò)使用患者來(lái)源的類(lèi)器官進(jìn)行個(gè)性化臨床藥物篩選，可為患者提供量身定制的治療方案。在新藥開(kāi)發(fā)過(guò)程中，使用類(lèi)器官進(jìn)行早期藥物篩選和毒性評(píng)估，可有效降低臨床前藥物研發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)和成本。

建立更高仿真度的類(lèi)器官培養(yǎng)平臺(tái)將是一個(gè)長(zhǎng)期的綜合目標(biāo)，具體包括類(lèi)器官的血管化和免疫化，特定類(lèi)器官培養(yǎng)中物理、化學(xué)環(huán)境的重建以及多類(lèi)器官共培養(yǎng)等。但是，高仿真度通常也會(huì)增加系統(tǒng)的復(fù)雜度，系統(tǒng)復(fù)雜度高又將限制培養(yǎng)和檢測(cè)的通量。因此，需要根據(jù)具體應(yīng)用場(chǎng)景對(duì)仿真度和篩選通量進(jìn)行適當(dāng)平衡?；诟咄康姆抡骖?lèi)器官培養(yǎng)平臺(tái)，類(lèi)器官的培養(yǎng)條件可被進(jìn)一步篩選優(yōu)化，以在更短時(shí)間內(nèi)生成成熟類(lèi)器官，滿(mǎn)足臨床藥物篩選對(duì)時(shí)效性的需求。對(duì)于繁瑣復(fù)雜的類(lèi)器官培養(yǎng)操作，需建立標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程和類(lèi)器官鑒定方法，在常規(guī)顯微成像和免疫組化、免疫熒光的基礎(chǔ)上，可發(fā)展類(lèi)器官的基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組等多組學(xué)方法，以保證系統(tǒng)在類(lèi)器官培養(yǎng)方面的可重復(fù)性。為實(shí)現(xiàn)高通量的結(jié)果檢測(cè)，需要整體考慮前端的培養(yǎng)平臺(tái)與后端檢測(cè)裝置的兼容性。在最終的數(shù)據(jù)分析環(huán)節(jié)，如高內(nèi)涵熒光顯微成像圖片和多組學(xué)數(shù)據(jù)分析方面，可引入人工智能算法，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)化處理和深度挖掘?，F(xiàn)有的研究結(jié)果已初步證明了類(lèi)器官臨床藥物篩選結(jié)果和患者臨床藥物響應(yīng)的一致性，但仍需進(jìn)一步開(kāi)展大量類(lèi)器官藥篩臨床研究，以充分驗(yàn)證所開(kāi)發(fā)模型的可靠性。

隨著微流控技術(shù)、組織工程技術(shù)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展和進(jìn)步，更高仿真度、更快速和更低成本的類(lèi)器官藥物篩選模型將會(huì)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，為腫瘤患者的個(gè)性化精準(zhǔn)醫(yī)療和新藥的高效研制提供強(qiáng)有力的平臺(tái)支撐。