水解納米酶的類酶催化及傳感應用研究進展

關鍵詞 納米酶；仿生催化；類水解酶活性；傳感；評述

水解酶是一類能夠催化酯鍵、酰胺/肽鍵和糖苷鍵等特殊化學鍵水解的生物酶[1]，因具有優(yōu)異的選擇性和高效的催化能力而廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)[2-4]、醫(yī)療[5-7]、分析檢測與傳感[8-10]等多個領域。自2004 年Scrimin 等[11]首次發(fā)現(xiàn)金納米顆粒能夠高效水解磷酸二酯鍵以來，研究者開始聚焦于探索各種材料作為天然水解酶替代品的潛力。近年來開發(fā)的水解納米酶作為一種新型人工水解酶，具有類水解酶活性以及納米材料獨特的物理化學特性如磁性、光電效應和光熱效應等[12-16]，這些特性賦予了水解納米酶獨特的催化機制和良好的可操作性，使其能夠克服天然酶成本高和穩(wěn)定性差的缺點，突破了實際應用中的限制。近年來，水解納米酶研究發(fā)展迅速，已開發(fā)出多種類型的水解納米酶。水解納米酶具有成本低、易回收利用以及催化性能可調(diào)等優(yōu)點，在有機合成、化學武器降解和生物傳感等多個領域展現(xiàn)出巨大的應用潛力[17-20]。

仿生催化理念的興起為多種水解納米酶的設計與合成提供了指導[21-22]。然而，由于天然酶的催化機制復雜，水解納米酶對天然酶中的多種輔因子模擬困難，導致其催化活性不足，迄今僅有較少研究者致力于水解納米酶的開發(fā)與應用（約為7.1%）[23]。先進水解納米酶的設計仍然需要對天然水解酶催化機制的深入了解，精準模擬和調(diào)控多種輔因子的功能。本文總結了近年來水解納米酶的類酶催化及其傳感應用研究進展，主要介紹了天然水解酶的催化機制和各類水解納米酶，重點論述了模擬和調(diào)控金屬位點對和氨基酸微環(huán)境兩種輔因子功能的關鍵作用，系統(tǒng)總結了水解納米酶在農(nóng)藥檢測、離子檢測和生物分子檢測等傳感領域的研究和應用進展，并分析了其發(fā)展的機遇和面臨的挑戰(zhàn)。

1 天然水解酶的催化機理

1.1 金屬位點對的協(xié)同催化

多數(shù)天然水解酶為金屬酶，以天然磷酸三酯酶的催化機理為例，其催化機制如圖1 所示[21，24-25]。Zn²⁺金屬位點以羥基橋接的形式成對存在于活性口袋中，存在一定的三維空間距離以發(fā)揮協(xié)同催化作用。當磷酸三酯底物進入活性口袋后，其中一個Zn²⁺作為路易斯酸金屬位點吸附并活化底物，此過程能夠減少磷原子的電子密度，提高可進攻性。另一個Zn²⁺金屬位點則通過與橋連的羥基作用形成親核進攻試劑進攻底物，磷原子受到進攻后，離去基團脫去，完成底物的催化斷鍵。

1.2 氨基酸微環(huán)境的質子轉移作用

羥基橋接的成對金屬位點在天然酶中依靠賴氨酸的羧基側鏈固定在酶的活性口袋中。底物與Zn²⁺金屬位點結合后，位于另一側的Zn²⁺金屬位點所連接的天冬氨酸和組氨酸殘基充當近端堿基，將橋連羥基的氫質子轉移至兩者之間，形成親核試劑，進攻底物。當水解產(chǎn)物脫去后，另一側的Zn²⁺金屬位點吸附的水分子再次發(fā)生質子轉移作用，重新形成橋連羥基，完成水解反應循環(huán)過程。

2 水解納米酶的分類與調(diào)控

受天然水解酶催化機制的啟發(fā)，多數(shù)水解納米酶為金屬基納米酶（圖2A），如金屬氧化物、金屬氫氧化物、金屬有機框架、金屬配合物以及相關復合物等[23，26-28]。其中，同種金屬的不同價態(tài)或者不同金屬能夠有效模擬天然酶中的金屬位點對，發(fā)揮協(xié)同催化作用。結合天然酶的催化機制，基于金屬位點對的水解納米酶催化機制如圖2B 所示。當加入底物后，具有較強路易斯酸性的金屬位點吸附并激活底物，較弱的金屬位點則通過與溶劑作用，結合羥基形成親核試劑進攻底物。隨后，伴隨酯鍵的斷開以及離去基團的脫去，羥基與催化劑作用脫去殘留產(chǎn)物以完成水解反應[29-31]。由于氨基酸微環(huán)境的模擬難度較大，質子轉移作用對水解納米酶催化活性影響的機制尚不明確。本節(jié)將詳細闡述近年來水解納米酶模擬各類天然水解酶的相關策略，為先進水解納米酶的設計提供思路。

2.1 具有類磷酸酯水解酶

活性的納米酶磷酸酯是一類典型的易水解底物，水解納米酶的研究工作多以模擬磷酸酯水解酶為主。天然磷酸三酯酶中成對Zn²⁺金屬位點的協(xié)同作用是催化反應的關鍵，合理設計以Zn²⁺為活性位點的納米酶有望進一步闡明天然水解酶的催化機制。Lee等[20]將硝酸鋅與硝酸鈰混合后，采用硬模板法合成了介孔Zn-m-CeO₂納米酶。該納米酶的兩種不同活性位點分別模擬了天然水解酶吸附和進攻底物的催化功能，實現(xiàn)了對甲基對氧磷（DMNP）底物的高效催化水解。然而，由于Zn²⁺的路易斯酸性相對較弱，對底物的吸附和活化能力有限。提高納米酶金屬活性位點的路易斯酸性以及引入具有強極化能力的親核進攻基團，有望實現(xiàn)催化活性的進一步提升。Xu 等[31]通過簡單的團簇金屬化策略，在85 ℃下將MOF-808 與硝酸鋁混合攪拌后，得到具有強路易斯酸性Al³⁺位點的MOF-808-Al 納米酶。采用氘代乙腈紅外實驗表征納米酶表面酸位點的相對含量，證實了Al³⁺位點的引入能夠將納米酶的路易斯酸性提升兩倍以上。MOF-808-Al 對乙基對氧磷底物（DENP）具有優(yōu)異的活化和親核進攻能力，其水解速率為1923.08 mol/（L?min），比MOF-808（188.14 mol/（L?min））提升了一個數(shù)量級，表現(xiàn)出極高的催化活性。此外， MOF-808-Al 具有優(yōu)異的生物相容性，在減輕有機磷（OPs）神經(jīng)毒劑的毒性和修復細胞組織損傷方面具有良好的效果（圖3A）。

天然水解酶催化活性的表達還依賴氨基酸微環(huán)境的質子轉移作用。Luo 等[32]采用氣相擴散法，將咪唑氣化到活化后的MOF-808 中，所得的Im@MOF-808 納米酶在結構上模擬了磷酸三酯酶的活性位點及其連接的組氨酸殘基（圖3B）。采用31P 核磁共振波譜法監(jiān)測水解反應過程，結果表明，納米酶在純水中對DMNP 底物的半衰期（底物水解50%時所需要的時間）lt;30 s，而MOF-808 卻達到了10 min。該研究組還發(fā)現(xiàn)，在MOF 合成所需的配體中引入氨基基團，制得的材料對底物表現(xiàn)出極高的催化活性。通過改變氨基在配體中的位置，研究了多種鋯基MOF 的催化活性[33]，結果表明，氨基存在于MOF 中鋯氧團簇的鄰近位置能夠顯著影響活性位點周圍的微環(huán)境，從而提高催化速率。該項研究通過將配體合理功能化實現(xiàn)了對天然酶微環(huán)境的模擬，有助于指導和設計出更高效的催化劑。

2.2 具有類蛋白水解酶活性的納米酶

酰胺鍵/肽鍵多見于蛋白質類底物，是連接蛋白質中各種氨基酸的化學鍵之一[34-35]。在溫和條件下將酰胺鍵/肽鍵水解，可以得到短鏈甚至單個的氨基酸，有利于對蛋白質的結構組成進行分析。金屬活性位點的強路易斯酸性使得底物易受到羥基等親核基團的進攻，從而顯著提升對酰胺鍵/肽鍵的水解能力。Wang 等[36]以四水合硫酸鋯和3，3′，5，5′-四羧基二苯甲烷為前驅體，通過水熱法合成了具有方形八面體拓撲網(wǎng)絡結構的鋯基MOF 材料MIP-201，其中的強路易斯酸性鋯位點將二肽底物的水解速率提高了3個數(shù)量級以上。該研究發(fā)現(xiàn)， MIP-201 能夠對肌紅蛋白153 個氨基酸中的5 個肽鍵進行選擇性切割，表現(xiàn)出良好的選擇性，有望成為蛋白質組學和生物技術中用于選擇性水解蛋白質的一種高效實用的替代品。

除了調(diào)控MOFs 的金屬活性位點外，活性中心周圍氨基酸第二配位微環(huán)境的作用也不容忽視[37-38]。Yuan 等[39]受天然酶活性口袋中各種輔因子協(xié)同作用的啟發(fā)，通過前合成方法，在MOF 材料鋅偶氮酸框架ZAF 的鋅金屬位點上原位引入了帶有羥基側鏈的絲氨酸，得到了具有高催化活性的ZAF（Ser）納米酶（圖4A）。其中，絲氨酸側鏈羥基能夠與偶氮配體形成氫鍵，構成氨基酸第二配位微環(huán)境。單獨的Zn²⁺和配體等混合物沒有顯示出明顯的活性，并且ZAF（Ser）的活性高于ZAF 和ZnSer（圖4B）。該研究表明，ZAF（Ser）的活性表達除了受到一級配位環(huán)境中路易斯酸金屬位點調(diào)控之外，氨基酸第二配位環(huán)境中氫鍵的形成也能進一步增強其催化活性。通過升高溫度去除氫鍵的實驗結果也證明了氫鍵的存在是ZAF（Ser）活性高于ZAF 的關鍵原因（圖4C）。ZAF（Ser）納米酶具有高穩(wěn)定性、可回收性和廣泛的底物范圍等優(yōu)點，是未來人工酶和蛋白質工程設計的潛在替代品。

2.3 具有類糖苷水解酶活性的納米酶

糖苷水解酶是一類參與生物體內(nèi)相關糖代謝過程的重要水解酶， 能夠將多糖化合物水解，生成一系列具有較低聚合度的糖及其衍生物[40-41]。目前，模擬糖苷酶以及探究其催化機制的研究較少，迫切需要設計高效的糖苷水解酶模擬物填補該領域的空白。Yu 等[42]將CuO NPs 與NaH₂PO_2"混合后于300 ℃下退火，得到的Cu3P 納米顆粒能夠作為糖苷水解酶模擬物催化糖苷鍵的斷裂。Cu3P 納米顆粒在酸性條件下對糖苷底物表現(xiàn)出優(yōu)異的催化活性，實驗結果和理論計算結果證實其催化路徑與天然酶類似。此外，該研究組還利用Cu3P 的類糖苷水解酶活性，將其與FeP 納米酶所具備的類葡萄糖氧化酶活性和類過氧化物酶活性結合，構成級聯(lián)反應。該策略將水解反應與氧化還原反應串聯(lián)起來，豐富了類糖苷水解酶在葡萄糖分析檢測領域中的應用[43]。

以上3種類型水解酶模擬活性的水解納米酶較常見，此外還包括對具有類碳酸酯水解酶和類環(huán)氧化物水解酶活性的模擬酶等。不同水解納米酶的催化反應及其應用見表1。

3 水解納米酶在分析傳感領域中的應用

基于其優(yōu)異的催化活性和物理化學特性，水解納米酶在分析傳感領域中得到了廣泛應用。

3.1 農(nóng)藥的檢測

有機磷作為一種高效農(nóng)藥，廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。然而，有機磷農(nóng)藥的過量使用導致其難以完全降解，殘留的有機磷農(nóng)藥將危害生命健康[46-48]。目前，多種檢測方法包括氣相/液相色譜-質譜法（GC/LC-MS）、酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）和表面增強拉曼散射（SERS）等已應用于有機磷農(nóng)藥的實際檢測中。然而，價格昂貴和操作復雜等缺點限制了這些方法在農(nóng)藥檢測中的進一步普及[49-51]，開發(fā)簡便、快速和經(jīng)濟的檢測方法具有重要的意義。

3.1.1 比色傳感法

比色傳感檢測方法的基本原理是通過催化反應底物在特定條件下顯色，利用紫外可見分光光度計和酶標儀等儀器對顯色信號的變化進行監(jiān)測，從而實現(xiàn)對底物的分析檢測。Li 等[52]以葡萄糖、雙氰胺和四水合硫酸鈰為前驅體，在900 ℃條件下熱解得到的復合材料CeO₂@NC 材料具有優(yōu)異的類磷酸水解酶活性。利用對氧磷農(nóng)藥水解后能夠產(chǎn)生顯色物質對硝基苯酚這一特點（圖5A），開發(fā)了一種簡單的檢測對氧磷農(nóng)藥的比色傳感器。該傳感器能夠在溫和條件下實現(xiàn)對氧磷農(nóng)藥的選擇性檢測，線性檢測范圍為3～100 μmol/L，大蒜和香蔥等實際樣品中的加標回收率為93.0%～104.6%。

3.1.2 化學發(fā)光傳感法

近年來，化學發(fā)光傳感法因具有高靈敏度和高信噪比的特點，在分析傳感領域得到了廣泛應用。然而，化學發(fā)光傳感多基于魯米諾和雙氧水介導的氧化還原反應實現(xiàn)，以水解反應作為化學發(fā)光傳感機制的研究較少[53-54]。Chang 等[55]以鋯基MOF 材料UiO-66 作為前驅體，通過NaOH 刻蝕后合成了羥基氧化鋯ZrOX-OH 納米酶，其表面上的大量羥基賦予了納米酶優(yōu)異的類磷酸水解酶活性。將3-（2′-螺烷胺基）-4-甲氧基-4-（3′-磷酸氧基苯基）-1，2-二氧乙烷作為反應底物時，其水解產(chǎn)物為金剛烷和羥基苯甲酸鹽。處于電子激發(fā)態(tài)的羥基苯甲酸鹽可在470 nm 處發(fā)射光子，從而實現(xiàn)化學發(fā)光。該研究還發(fā)現(xiàn)草甘膦能夠消耗納米酶表面的羥基，從而抑制其類磷酸水解酶活性的表達?；诖嗽碓O計了一種可直接選擇性檢測草甘膦的化學發(fā)光傳感器（見圖5B），檢出限為0.33 μmol/L，利用其檢測白菜汁中的草甘膦，加標回收率為96.8%～103.0%。該化學發(fā)光傳感器采用水解納米酶替代傳統(tǒng)天然酶，克服了天然酶成本高和穩(wěn)定性低的缺點，為采用化學發(fā)光法檢測農(nóng)藥開辟了新領域。

3.2 離子的檢測

微量離子的存在能夠維持生命體功能和自然系統(tǒng)的正常運行。然而，當離子濃度超過一定限度后，將危害生態(tài)環(huán)境和生命健康[56-58]。在各類金屬離子中，重金屬離子多具有較強的生理毒性。Xiong 等[59]采用常溫NaOH 水解方法，將金屬有機骨架前驅體轉化為具有優(yōu)異類磷酸酶催化活性的高孔GdOOH 納米酶。實驗結果表明， GdOOH 納米酶表面豐富的羥基可作為親核試劑直接攻擊底物分子三磷酸腺苷（ATP），產(chǎn)生二磷酸腺苷（ADP）和磷酸（Pi）。該研究還發(fā)現(xiàn)， Cr³⁺的存在能夠抑制GdOOH 納米酶的催化活性，在此基礎上設計了檢測Cr³⁺的比色傳感器（圖6A），線性檢測范圍為5.0～200 μmol/L，檢出限為0.84 μmol/L，實際水樣中Cr³⁺的回收率為92.0%～108.8%。

3.3 生物分子的檢測

生物體內(nèi)存在多種生物分子，實現(xiàn)生物分子的實時檢測對監(jiān)測生物體健康情況具有重要意義?；诩{米酶的生物傳感器已被成功應用于葡萄糖、乙酰膽堿和抗壞血酸等多種生物小分子的檢測[63-66]。Wen 等[67]通過后合成法將Pt 納米顆粒（Pt NPs）負載到具有類乙酰膽堿酯酶活性的鋯基金屬有機框架MOF-808 上，合成了MOF-808/Pt NPs 納米酶。MOF-808 作為支撐載體，能夠保證Pt NPs 的穩(wěn)定性和良好的類過氧化物酶活性。此外， Pt NPs 的引入還能夠增強MOF-808 的路易斯酸性，從而進一步提高類乙酰膽堿酯酶催化性能。利用納米酶的雙類酶活性，設計了一種靈敏檢測乙酰膽堿（ACh）的生物傳感器（圖7A）。MOF-808/Pt NPs 納米酶可催化ACh 水解產(chǎn)生乙酸，導致溶液的pH 值下降，進一步放大了納米酶的類過氧化物酶活性；隨后納米酶催化顯色底物TMB 被氧化，完成ACh 的檢測?；贛OF-808/Pt NPs的ACh 生物傳感器的線性檢測范圍為33～6700 μmol/L，檢出限為5 μmol/L。人血清樣本中ACh 的加標回收率在101%～108%范圍內(nèi)，相對標準偏差小于5%，表明MOF-808/Pt NPs 納米酶生物傳感系統(tǒng)在實際生物樣品檢測以及臨床診斷中具有廣闊的應用前景。

生物大分子的結構復雜，檢測難度較大。多數(shù)生物大分子由多種生物小分子組成，這些生物小分子的連接可以通過形成酯鍵、酰胺鍵等實現(xiàn)，利用水解的催化方式有望設計出基于水解納米酶的生物傳感器，實現(xiàn)對特定生物大分子的檢測。Luo 等[68]采用混合攪拌的方式在MOF 材料UiO-66-NH₂"的氨基和含氧基團上修飾Zn²⁺，所得的Zn²⁺@UiO-66-NH_2"納米酶表現(xiàn)出優(yōu)異的類磷酸酶催化活性。該研究將Zn²⁺@UiO-66-NH₂"納米酶通過靜電相互作用的方法標記上檢測抗體，設計了用于檢測心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnI）的熒光酶聯(lián)免疫傳感器（圖7B）。該傳感器通過將熒光素二磷酸酯（FDP）水解產(chǎn)生熒光并作為反應信號輸出，其線性檢測范圍為1～10⁶"pg/mL，檢出限為0.9 pg/mL，分析檢測和抗干擾性能遠優(yōu)于以往多數(shù)檢測cTnI 的傳感器。利用其檢測生物血清樣品，加標回收率為93.8%～105.1%。該熒光酶聯(lián)免疫傳感器具有優(yōu)異的cTnI 檢測性能，拓寬了類磷酸水解納米酶在藥物分析、食品分析和各種疾病的早期診斷中的應用范圍。

4 結論與展望

本文從天然水解酶的催化機制的研究出發(fā)，討論了水解納米酶在仿生過程中運用的策略，重點闡述了模擬和調(diào)控成對金屬位點以及氨基酸微環(huán)境兩種輔因子功能的重要作用。此外，總結了水解納米酶在分析傳感領域中的具體應用，主要包括農(nóng)藥檢測、離子檢測以及生物分子檢測，為未來水解納米酶替代部分天然酶在實際應用中的作用提供了參考，為開發(fā)新型應用場景提供了思路。

雖然水解納米酶的研究取得了諸多進展，但是其發(fā)展過程中仍然面臨一些挑戰(zhàn)和機遇。（1）模擬材料種類不足。目前所報道的水解納米酶種類單一，僅有少數(shù)幾種金屬離子具有類水解酶活性，迫切需要開發(fā)出新型水解納米酶。（2）催化活性以及特異性不足。多數(shù)水解納米酶因難以有效模擬天然酶中的金屬位點對與氨基酸微環(huán)境等輔因子，催化活性和特異性通常較低。精準設計和調(diào)控水解納米酶的類酶輔因子以及三維空間結構有望解決該問題。（3）克服生理毒性，實現(xiàn)體內(nèi)傳感檢測?；谒饧{米酶的體外傳感檢測技術已逐漸成熟。然而，由于大部分納米材料具有生理毒性，體內(nèi)傳感應用尚未得到充分研究。設計出可降解可代謝的水解納米酶有利于擴大其在生物醫(yī)學傳感領域中的應用。（4）利用納米材料的特性，設計出多功能傳感器。納米材料獨特的物理化學性質賦予了納米酶除類酶活性以外的其它特性，通過修飾調(diào)控或者改變外界因素的方式能夠實現(xiàn)水解納米酶的功能切換，設計出功能多樣化的傳感器。（5）同多種類型天然酶或納米酶結合，拓寬實際應用領域?；谔烊幻富蚣{米酶的分析傳感應用發(fā)展迅速，將水解納米酶與多種類型的天然酶或納米酶結合有望設計出新型傳感器用于環(huán)境污染物分析和食品安全分析等領域。