微滴式數(shù)字PCR技術(shù)在菜豆暈疫病菌檢測中的應(yīng)用

摘要 為了建立菜豆暈疫病菌（Pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola）微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）檢測方法，實現(xiàn)菜豆暈疫病菌的高效率、高精度的檢疫鑒定和疫情監(jiān)控，以菜豆暈疫病菌為研究對象，以位點特異性重組酶作為靶標基因，SSRP_F、SSRP_R、SSRP_P為特異性引物與探針，建立菜豆暈疫病菌ddPCR反應(yīng)體系，結(jié)果表明，菜豆暈疫病菌的ddPCR檢測體系的絕對定量檢測低限為0.6 copies/μL，ddPCR的檢測靈敏度比常規(guī)PCR高2個數(shù)量級。同時研究了種子攜帶菜豆暈疫病菌是否具有活性，提高了疫情檢出率。

關(guān)鍵詞 微滴式數(shù)字PCR技術(shù)；菜豆暈疫病菌；快速檢測

中圖分類號 S432.4+2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）21-0163-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.21.034

開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Application of Droplet Digital PCR in the Detection of Pseudomonas savastanoi

LIU Xiao-yu，QIAN Zhu-xi，GUO Jing et al

（Animal，Plant and Food Inspection Center，Nanjing Customs，Nanjing，Jiangsu 210019）

Abstract In order to realize high efficiency and high precision quarantine identification and epidemic monitoring of Pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola （Psp），the detection method of Psp by droplet digital PCR （ddPCR） was established.The ddPCR reaction system was conducted with Psp as research object and site-specific recombinases were used as gene target with SSRP-F/SSRP-R/SSRP-P as primers and probe.The results showed that the detection limit of genomic DNA by ddPCR was 0.6 copies/μL.The detection sensitivity of ddPCR could increase two orders of magnitude than convention PCR.Meanwhile，the activity of Psp carried in peas was studied，which improved the epidemic detection rate.

Key words Droplet digital PCR;Pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola;Rapid detection

基金項目 南京海關(guān)科研項目（2022KJ22）。

作者簡介 劉曉宇（1975—），女，蒙古族，遼寧朝陽人，高級農(nóng)藝師，碩士，從事植物病原細菌檢測工作。*通信作者，農(nóng)藝師，碩士，從事植物病原真菌檢測工作。

收稿日期 2023-11-14

菜豆暈疫病菌是由薩氏假單胞菜豆致病變種（Pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola，Psp）引起的豆類作物上的細菌性病害［1］。該病菌廣泛分布于大多數(shù)矮生菜豆種植的國家和地區(qū)，歐洲、美洲、非洲、大洋洲的大多數(shù)豆類種植國家和地區(qū)有報道，至今在各大洲的60多個國家和地區(qū)有分布［2-3］。菜豆暈疫病菌具有廣泛的寄主群體，除普通菜豆外，還有大豆、豌豆、扁豆、赤豆、月豆、野葛、綠豆、豇豆等豆科自然寄主［3］。菜豆暈疫病菌主要通過帶菌種子進行遠距離傳播，潛伏在種子內(nèi)部或者附著在種子表面，并可存活2年以上［3-4］。病原菌的最適生長溫度為25～30 ℃，中國各豆科作物產(chǎn)區(qū)均具備其定殖的條件［5］。2007年我國就將菜豆暈疫病菌列為禁止進境檢疫性有害生物。

微滴式數(shù)字PCR技術(shù)（droplet digital PCR，ddPCR）是在傳統(tǒng)PCR擴增前對樣品進行微滴化處理，能夠快速精準檢測復(fù)雜樣品中微量目標序列的一種新技術(shù)。ddPCR技術(shù)通過將微量樣品進行大倍數(shù)稀釋后，每個微滴作為一個獨立的PCR體系，經(jīng)PCR 擴增后，對每個微滴反應(yīng)進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例即可得出靶標分子的起始拷貝數(shù)［6-9］。該試驗采用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)，針對進口豆類中風險高的病原細菌菜豆暈疫病菌開發(fā)超微量病原細菌核酸的快速、精準檢測方法，旨在對進境豆類樣品準確鑒定目標病原細菌，防止漏檢，保護我國豆類作物，從而保護本地農(nóng)業(yè)經(jīng)濟。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)條件

試驗用菌株共15株，菜豆暈疫病菌菌株LMG 2245由中國檢驗檢疫科學研究院提供，菌株2435為廈門海關(guān)提供，菌株2706、3760、4450、231、1010-1、CM20、ATCC29076、NVPPB402、NCPPB4200由上海海關(guān)提供，其余均為南京海關(guān)動植物與食品檢測中心植檢實驗室保存菌株。所有菌株均懸浮于30％甘油，保存在 -80 ℃冰箱中。菌株活化采用NA培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)3 d。所有參試菌株見表1。

1.2 儀器與試劑

微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)QX200 Droplet Digital PCR（Bio-Rad，美國）：微滴生成儀、微滴分析儀、封膜儀和Quanta Soft軟件。微滴式數(shù)字PCR 試劑和耗材：ddPCR TM Supermix for Probes、微滴生成油、微滴生成卡槽、微滴生成卡槽膠墊和錫紙膜，以上均由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)。天隆科技DNA自動提取儀；超微量核酸蛋白檢測儀（NEDROB）；PCR擴增儀（美國 MJ Research）；搖床（702R A-PLUS，美國）。

1.3 PCR引物與ddPCR引物探針組合 PCR引物為PH19（5′-CGTCTGTAACCAGTTGATCC-3′）和PH95（5′-GAATCCTTGAATGCGAAGGC-3′）［10］，目的產(chǎn)物大小為437 bp；ddPCR引物為SSRP_F（5′-GACGTCCCGCGAATAGCAATAATC-3′）和SSRP_R（5′-CAACGCCGGCGCAATGTCG-3′），探針為SSRP_P（5′-FAM-TGACGTGACACTCGCCGAGCTGCA-TAMRA-N-3′）［11］。PCR引物、ddPCR引物與探針均委托生工（上海）生物科技有限公司合成。

1.4 PCR與ddPCR反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)體系：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，加無菌水補足至25.0 μL。反應(yīng)程序：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s，58 ℃，30 s；72 ℃，60 s，35個循環(huán)；72 ℃，5 min。擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠1×TAE緩沖液中電泳，染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。

ddPCR反應(yīng)體系：ddPCR TM預(yù)混液（Supermix for Probes） 10 μL，核酸DNA模板1 μL，上、下游引物和探針各1 μL，無菌水補足至20 μL，隨后將上述20 μL 反應(yīng)液和70 μL微滴生成油加至微滴生成卡槽內(nèi)，蓋上膠墊，放入微滴生成儀中產(chǎn)生微滴。最后將生成的微滴用移液器吸40 μL轉(zhuǎn)移到96孔PCR板中，用封膜儀封口后，放在熱循環(huán)PCR儀準備擴增。擴增條件同常規(guī)PCR反應(yīng)條件。反應(yīng)完成后，將96孔PCR板放在微滴分析儀中讀取熒光信號，通過Quanta soft軟件對結(jié)果進行分析。

1.5 菜豆暈疫病菌和對照菌株DNA的提取和制備

將菜豆暈疫病菌和對照菌株在NA培養(yǎng)基上28 ℃活化培養(yǎng)3 d后，刮取菜豆暈疫病菌和對照菌株，用無菌水制備成菌懸液，菌懸液在12 000 r/min離心5 min，棄上清，取沉淀，使用天隆DNA自動提取儀提取DNA，進行ddPCR檢測。

1.6 帶菌種子制備

以經(jīng)檢測確認未攜帶菜豆暈疫病菌的豌豆種子作為樣品制備供試材料，使用前將種子置于烘箱中80 ℃烘干6 h。將試驗需要的部分豌豆種子完全浸泡在 108 CFU/mL的菜豆暈疫病菌菌懸液中，于28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)4 h，取出種子，在無菌環(huán)境下自然晾干5 d，獲得攜帶菜豆暈疫病菌的豌豆種子。

1.7 PCR與ddPCR檢測

1.7.1 引物特異性檢測。

將“1.5”得到的菜豆暈疫病菌的DNA和對照菌株的DNA分別進行PCR、ddPCR檢測。

1.7.2 PCR與ddPCR靈敏度檢測。

將菜豆暈疫病菌的DNA按10倍系列進行稀釋，然后按照菜豆暈疫病菌DNA原液（100）、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7濃度進行PCR和ddPCR檢測。

1.7.3 菜豆暈疫病菌活性檢測。

將攜帶菜豆暈疫病菌的豌豆種子和健康種子分別按照粒數(shù)比1∶50、1∶80、1∶100混合后進行試驗，每個比例設(shè)置3個重復(fù)。每份豌豆種子直接加至200 mL的NB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，按照2、4、6、8、10、12、14、24 h進行取樣，每培養(yǎng)瓶每次取樣500 μL，12 000 r/min離心后棄上清，取沉淀提取DNA后，進行ddPCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性驗證 利用PCR與ddPCR反應(yīng)擴增菜豆暈疫病菌和其他對照菌株（豌豆細菌性疫病菌、十字花科黑斑病菌、玉米細菌性枯萎病菌、丁香假單胞菌丁香致病變種、菜豆細菌性萎蔫病菌、柑橘潰瘍病菌、馬鈴薯青枯病菌、瓜類果斑病菌等14個菌株），結(jié)果見表2，除了目標菌株菜豆暈疫病菌，其他對照菌株均無擴增。菜豆暈疫病菌的PCR引物與ddPCR引物特異性強，能夠區(qū)分其他對照菌株以及菜豆暈疫病菌近似種，具體結(jié)果見表2。菜豆暈疫病菌與對照菌株的ddPCR檢測結(jié)果見圖1。由圖1可知，ddPCR檢測只有菜豆暈疫病菌能夠產(chǎn)生陽性微滴，對照菌株均不產(chǎn)生陽性微滴。

2.2 ddPCR的引物靈敏度 按10倍梯度稀釋菜豆暈疫菌懸液，使用梯度稀釋的菌懸液進行ddPCR檢測，同時提取每一梯度的菌懸液DNA同步進行ddPCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表3），菜豆暈疫病菌的DNA在10-5稀釋度時，檢測拷貝數(shù)為0.6 copies/μL，與菌懸液在10-4稀釋度下的單位拷貝數(shù)相同。同一梯度下的菜豆暈疫病菌菌懸液與其提取的DNA相比較，ddPCR對菜豆暈疫病菌DNA的檢測靈敏度比菌懸液高1個數(shù)量級。相同濃度的菜豆暈疫病菌菌懸液與提取的DNA稀釋后ddPCR微滴圖見圖2，菜豆暈疫病菌菌懸液在10-4稀釋度時陽性微滴的單位拷貝數(shù)與菜豆暈疫病菌的DNA在10-5稀釋度時陽性微滴的單位拷貝數(shù)相同，說明菜豆暈疫病菌DNA的檢測靈敏度更高。

2.3 PCR與ddPCR檢測靈敏度比較 用ddPCR與PCR進行相同濃度的菜豆暈疫病菌的DNA檢測，結(jié)果如表4所示，

PCR只能檢測到DNA的稀釋度為10-3的濃度，而ddPCR在稀釋度為10-5時，拷貝數(shù)為0.6 copies/μL。在相同的菜豆暈疫病菌DNA濃度下，ddPCR的檢測靈敏度比PCR高2個數(shù)量級。同等DNA濃度下PCR電泳圖與ddPCR微滴圖見圖3，對相同濃度的菜豆暈疫病菌的DNA進行PCR檢測，在DNA的稀釋度為10-3時，電泳條帶隱約可見，而ddPCR在稀釋度為10-5時仍能見到陽性微滴的拷貝數(shù)。

2.4 菜豆暈疫病菌活性檢測 對帶菜豆暈疫病菌豌豆種子分別按病健粒數(shù)比1∶50、1∶80、1∶100進行振蕩培養(yǎng)，自培養(yǎng)第2個小時開始，以2 h間隔取樣，經(jīng)過24 h取樣完成后進行ddPCR檢測，每次取樣做3次重復(fù)，最終結(jié)果取3次結(jié)果的平均數(shù)。菜豆暈疫病菌DNA的拷貝數(shù)見表5，ddPCR一維圖如圖4所示。結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液中菜豆暈疫病菌不斷繁殖，病菌的DNA拷貝數(shù)不斷增加。由此可見，該方法可以檢測菜豆暈疫病菌的活性。

3 討論與結(jié)論

菜豆暈疫病菌是豆科植物上的一種重要的病原菌，并已列入我國禁止進境植物檢疫性有害生物名錄。2021年4月，南京海關(guān)從日本進境的菜豆種子中首次截獲該病菌［12］，說明該病菌有較大的傳入風險。由于該病菌的自然寄主中包含了大豆，因而，對我國每年進口量近1億t的大豆，海關(guān)部門應(yīng)重視針對該病菌的口岸篩查，嚴防該病菌通過大豆傳入我國。

目前，口岸對進境豆類中菜豆暈疫病菌的檢測通常是先通過常規(guī)PCR初篩，對初篩陽性的樣品再進行分離培養(yǎng)。但由于常規(guī)PCR方法對DNA的擴增無法區(qū)分病菌的死活，即如果種子上的菜豆暈疫病菌已無活性，但仍然能擴增出目標條帶，若據(jù)此初篩結(jié)果進行后繼的分離培養(yǎng)，顯而易見分離到目標菌的概率很低，分離培養(yǎng)就失去意義，既浪費了人力、物力，又延長了檢疫周期。而ddPCR可通過對振蕩培養(yǎng)期的病菌進行規(guī)律間隔取樣檢測，根據(jù)微滴熒光信號拷貝數(shù)是否隨時間變化而增加，進而判斷病菌的活性，使目標病菌的后繼分離更具有針對性，可提高分離成功率。

目前，數(shù)字PCR技術(shù)主要應(yīng)用于醫(yī)學的臨床診斷、生物育種等領(lǐng)域，在微生物檢測和食品安全檢測方面也擁有很廣闊的前景。通過該研究也充分驗證了ddPCR技術(shù)的實用性和先進性，對于該研究中菜豆暈疫病菌的檢測而言，菜豆暈疫病菌的ddPCR檢測體系的絕對定量檢測低限為0.6 copies/μL，ddPCR的檢測靈敏度比常規(guī)PCR高2個數(shù)量級，與張健男［13］研究得到ddPCR比常規(guī)PCR高1 000倍結(jié)論接近。研究表明，ddPCR方法明顯優(yōu)于實時定量PCR（qPCR），通常比傳統(tǒng)qPCR高出1個數(shù)量級以上［14-15］。今后，在口岸檢測工作中，從嚴防外來有害生物傳入的角度，尤其是對進口量巨大的大宗糧谷以及疫情傳播風險極高的種苗來說，檢疫手段更應(yīng)從嚴掌握，檢測方法應(yīng)更靈敏，因而ddPCR是一種行之有效的檢測方法，應(yīng)逐步加大該技術(shù)在上述進口產(chǎn)品中的應(yīng)用，先行建立起傳入風險大的病菌的篩查方法。

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