鵝掌楸基因組部分SNP標(biāo)記在種源評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

摘要 以6個(gè)鵝掌楸（Liriodendron chinense）種源和3個(gè)北美鵝掌楸（Liriodendron tulipifera）種源共計(jì)23個(gè)個(gè)體作為研究群體，選取11對(duì)真實(shí)SNP位點(diǎn)，對(duì)這253個(gè)SNP標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行正反向Sanger測(cè)序。結(jié)果表明：在11個(gè)真實(shí)SNP位點(diǎn)中，8個(gè)SNP位點(diǎn)在中國(guó)鵝掌楸和北美鵝掌楸間呈現(xiàn)出多態(tài)性，其中3個(gè)位點(diǎn)是檢測(cè)鵝掌楸和北美鵝掌楸種間分化的潛在標(biāo)記。11個(gè)SNP標(biāo)記在北美鵝掌楸種內(nèi)都沒(méi)有多態(tài)性。lm_ll_10205、lm_ll_10836、lm_ll_3853和lm_ll_8246 4個(gè)SNP位點(diǎn)在我國(guó)東部的湖南瀏陽(yáng)、浙江松陽(yáng)和江西廬山3個(gè)種源間存在多態(tài)性，僅有l(wèi)m_ll_10205位點(diǎn)在我國(guó)西部種源間存在多態(tài)性。前期開發(fā)的SNP標(biāo)記可以用于鵝掌楸種源遺傳多樣性的研究。研究種源間SNP位點(diǎn)的變異特征為揭示鵝掌楸的起源、進(jìn)化以及遺傳變異多樣性提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞 北美鵝掌楸；鵝掌楸；SNP標(biāo)記；SNP位點(diǎn)；種源

中圖分類號(hào) S792.21 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）21-0093-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.21.019

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Application of SNP Markers of Liriodendron Genome in Provenance Evaluation

LU Ye， SHI Ji-sen

（Key Laboratory of Forest Genetics & Biotechnology of Ministry of Education of China， Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China， Nanjing Forestry University， Nanjing， Jiangsu 210037）

Abstract In this study， a total of 23 individuals were selected from 9 provenances with representative geographical distribution （including six Liriodendron chinense and three Liriodendron tulipifera provenances） as the study population. After PCR with 11 pairs of primers from real SNPs， Sanger sequencing was performed on the 253 SNP-labeled PCR products. The results showed that among the 11 real SNP loci， 8 SNP loci showed polymorphism between Chinese and North American provenances， and 3 of them were potential markers for detecting the interspecific differentiation of Chinese and North American provenances. None of the 11 SNP markers were polymorphic within the North American Liriodendron provenances. Four SNP loci （lm_ll_10205， lm_ll_10836， lm_ll_3853 and lm_ll_8246） showed polymorphism in Liuyang （Hunan）， Songyang （Zhejiang） and Lushan （Jiangxi） species in eastern China， while only lm_ll_10205 showed polymorphism in western species of China. The results showed that the SNP markers developed in earlier studies could be used to study genetic diversity of Liriodendron provenance. The variation characteristics of SNP sites between provenances provide useful scientific data for revealing the origin， evolution and diversity of genetic variation of Liriodendron.

Key words Liriodendron tulipifera;Liriodendron chinense;SNP makers;SNPs loci;Provenance

基金項(xiàng)目 江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目“耐鹽型雜交鵝掌楸新品種培育及推廣示范”（SCX（23）3628）。

作者簡(jiǎn)介 陸葉（1982— ），女，江蘇鎮(zhèn)江人，實(shí)驗(yàn)師，從事林木遺傳育種研究。*通信作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事林木遺傳育種研究。

收稿日期 2023-12-29

木蘭科（Magnoliaceae）鵝掌楸屬（Liriodendron）現(xiàn)僅存2個(gè)種，即鵝掌楸［Liriodendron chinense（Hemsl.）Sarg.］和北美鵝掌楸（Liriodendron tulipifera Linn.），是典型的孑遺植物［1］。新生代第三紀(jì)，該屬物種廣泛分布于歐亞大陸和北美洲。第四紀(jì)冰川之后，鵝掌楸分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域和越南北部，分化為東部和西部?jī)蓚€(gè)支系，北美鵝掌楸自然分布于北美洲東南部，遺傳上位于我國(guó)東西部鵝掌楸類群之間，更接近東部類群［2］。由于結(jié)實(shí)率低，加上人為對(duì)其適生環(huán)境的干擾，鵝掌楸在我國(guó)已被列為二類瀕危保護(hù)物種［3］。鵝掌楸屬物種不僅在林業(yè)產(chǎn)業(yè)方面具有重要的應(yīng)用前景，而且也是林木遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化及雜交育種等領(lǐng)域理論研究的理想材料［4-5］。

RAD-seq（Restriction-site associated DNA sequencing）技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行高通量測(cè)序［6］，可作為一種有效的方法，進(jìn)行高通量的SNP標(biāo)記的開發(fā)［7］。目前已有很多研究基于RAD-seq技術(shù)對(duì)物種的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。劉學(xué)鋒等［8］對(duì)168份藍(lán)花楹種質(zhì)材料進(jìn)行RAD-seq測(cè)序，獲得45 552個(gè)高質(zhì)量的SNP，分析表明，來(lái)自川渝地區(qū)的藍(lán)楹花具有相對(duì)較近的親緣關(guān)系。潘文婷等［9］用RAD-seq鑒定了北美和中國(guó)種源的鵝掌楸共4 454個(gè)SNP標(biāo)記，對(duì)鵝掌楸的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，認(rèn)為鵝掌楸屬遺傳結(jié)構(gòu)的形成與其地理隔離和片段化分布有關(guān)。

前期研究以北美鵝掌楸和鵝掌楸的雜交F1代和2個(gè)親本為材料，利用RAD-seq技術(shù)已開發(fā)的大量可靠的SNP標(biāo)記［10］，筆者從中選取了11對(duì)真實(shí)SNP位點(diǎn)，以6個(gè)鵝掌楸種源和3個(gè)北美鵝掌楸種源共計(jì)23個(gè)個(gè)體為研究材料，分析SNP位點(diǎn)在不同種源間的變異特征，旨在為研究鵝掌楸物種分子水平上的變異提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

種源材料均來(lái)自國(guó)家林業(yè)和草原局世行貸款項(xiàng)目管理中心于1990年推廣支持體系中的“闊葉樹中心組”的科研項(xiàng)目建立的實(shí)驗(yàn)林。在鵝掌楸全分布區(qū)內(nèi)抽樣收集了15個(gè)地理種源的鵝掌楸種子，同時(shí)分別從美國(guó)密蘇里（Missouri）、路易斯安那（Louisiana）、北卡羅來(lái)納（North Carolina，北卡）、南卡羅來(lái)納（South Carolina，南卡）、佐治亞（Georgia）引進(jìn)該地區(qū)北美鵝掌楸種源的種子，翌年分別在四川邛崍、湖北京山、湖南桃源、江西分宜和福建邵武進(jìn)行了地理種源研究試驗(yàn)。2014年4月從定植于湖北省京山縣虎爪山林場(chǎng)的24年生的種源材料中選取了9個(gè)種源的材料，每個(gè)種源23株，共計(jì)23株作為后續(xù)試驗(yàn)材料。取樣具體如下：湖南瀏陽(yáng)的3株鵝掌楸（1-10、1-13、1-23），浙江松陽(yáng)的2株鵝掌楸（4-1、4-24），江西廬山的3株鵝掌楸（8-3、8-17、8-24），四川敘永的3株鵝掌楸（9-5、9-19、9-22），貴州松桃的3株鵝掌楸（11-12、11-15、11-22），云南勐臘的2株鵝掌楸（12-5、12-22），北卡羅來(lái)納的3株北美鵝掌楸（15-19、15-21、15-23），南卡羅來(lái)納的2株北美鵝掌楸（18-16、18-21），密蘇里的2株北美鵝掌楸（19-16、19-21）。其中，來(lái)自湖南瀏陽(yáng)、浙江松陽(yáng)和江西廬山的種源為我國(guó)東南部種源，來(lái)自四川敘永、貴州松桃和云南勐臘的種源為我國(guó)西南部種源，來(lái)自北卡羅來(lái)納、南卡羅來(lái)納和密蘇里的種源為北美種源。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取。

新鮮葉片用液氮冷凍，-80 ℃保存。采用天根試劑盒（DNAsecure Plant Kit，離心柱型）提取DNA，保存在-20 ℃冰箱中。

1.2.2 引物合成。

根據(jù)前期研究開發(fā)的鵝掌楸27個(gè)真實(shí)SNP位點(diǎn)［10］，選取其中的11個(gè)SNP位點(diǎn)，利用鵝掌楸和北美鵝掌楸不同種源個(gè)體，對(duì)SNP位點(diǎn)在種群間的多態(tài)性進(jìn)行研究，引物序列見(jiàn)表1。

1.2.3 PCR擴(kuò)增體系。

用11對(duì)引物和KOD FX（Toyobo，KFX 101）DNA聚合酶對(duì)23個(gè)DNA樣本進(jìn)行PCR，將具有特異性條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序。測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。用BioXM2.6軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果。

PCR反應(yīng)體系（50 μL）為：2×PCR Buffer for KOD FX 25 μL，2 mmol/L dNTPs 10 μL，10 μmol/L Primer 1.5 μL，KOD FX DNA polymerase 1 μL，DNA 5 μL，ddH2O 6 μL。PCR 反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性 2 min；98 ℃變性10 s，Tm 5 ℃退火 30 s，68 ℃延伸 1 min，36 個(gè)循環(huán)；最后4 ℃保溫。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA質(zhì)量檢測(cè)

對(duì)提取的DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，如圖1所示，DNA條帶清晰完整，無(wú)明顯彌散條帶，表明DNA質(zhì)量好且純度較高。用Nanodrop檢測(cè)DNA樣品的OD260/OD280值，均在1.8～2.0。高質(zhì)量的DNA達(dá)到后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.2 PCR產(chǎn)物檢測(cè)

PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將符合預(yù)期的目的條帶切膠回收、純化后進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。圖2為部分引物在不同個(gè)體間的PCR擴(kuò)增結(jié)果。

2.3 SNP位點(diǎn)檢測(cè)

對(duì)總計(jì)253個(gè)包含SNP標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行正、反向測(cè)序，因49個(gè)樣品未能測(cè)序成功，最后獲得204個(gè)測(cè)序結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)表2。

在11個(gè)真實(shí)的SNP位點(diǎn)中，nn_np_7542、lm_ll_11011、nn_np_5667、nn_np_4694、lm_ll_10205、lm_ll_10836、lm_ll_3853和lm_ll_8246 8個(gè)SNP位點(diǎn)在鵝掌楸和北美鵝掌楸間呈現(xiàn)出多態(tài)性，其中l(wèi)m_ll_7542、lm_ll_5667、lm_ll_4694 3個(gè)位點(diǎn)雖在鵝掌楸種內(nèi)和北美鵝掌楸種內(nèi)未檢測(cè)到多態(tài)性，但是在鵝掌楸和北美鵝掌楸種間呈現(xiàn)出多態(tài)性，是檢測(cè)鵝掌楸和北

美鵝掌楸種間分化的潛在標(biāo)記。nn_np_9274、nn_np_9109和nn_np_9757 3個(gè)SNP位點(diǎn)無(wú)論是在鵝掌楸種內(nèi)，還是北美鵝掌楸種內(nèi)，甚至鵝掌楸和北美鵝掌楸種間都未檢測(cè)出多態(tài)性。 11個(gè)SNP位點(diǎn)，在北美鵝掌楸種內(nèi)皆為單一且相同堿基，因此11個(gè)SNP位點(diǎn)在北美鵝掌楸種內(nèi)無(wú)多態(tài)性。

從我國(guó)種源內(nèi)部來(lái)看，除了lm_ll_11011 SNP位點(diǎn)缺少測(cè)序結(jié)果，lm_ll_10205、lm_ll_10836、lm_ll_3853和lm_ll_8246 4個(gè)SNP位點(diǎn)在我國(guó)東部的湖南瀏陽(yáng)、浙江松陽(yáng)和江西廬山3個(gè)種源間存在多態(tài)性，其中l(wèi)m_ll_10205位點(diǎn)在浙江松陽(yáng)、江西廬山、四川敘永、貴州松桃、云南勐臘間呈現(xiàn)多態(tài)性，并且其在四川敘永種內(nèi)也存在多樣性。lm_ll_10836、lm_ll_3853和lm_ll_8246位點(diǎn)在我國(guó)西部的四川敘永、貴州松桃和云南勐臘3個(gè)種源間沒(méi)有多態(tài)性，其基因型分別為T、G、A，但都與東部的江西廬山種源呈現(xiàn)多態(tài)性。lm_ll_10836位點(diǎn)在浙江松陽(yáng)的基因型也是T，與西部種源沒(méi)有多態(tài)性，但在湖南瀏陽(yáng)種源中出現(xiàn)了基因型C。lm_ll_3853和lm_ll_8246位點(diǎn)，在東部種源湖南瀏陽(yáng)的基因型和西部種源相同，沒(méi)有多態(tài)性。

3 討論

SNP即單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism）是繼RFLP、SSR標(biāo)記后的第3代分子標(biāo)記，普遍存在于生物基因組中［11］。由于SNP遺傳穩(wěn)定性高，位點(diǎn)豐富且分布廣泛，富有代表性、二態(tài)性和等位基因性，檢測(cè)快速，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析等優(yōu)點(diǎn)，因此，SNP標(biāo)記已經(jīng)在遺傳圖譜、基因遺傳、分子進(jìn)化、功能基因組研究等領(lǐng)域得到了廣泛運(yùn)用［12］。

為了研究SNP位點(diǎn)在不同種源之間變異情況，該研究從前期開發(fā)的SNP位點(diǎn)中選取11個(gè)真實(shí)的SNP位點(diǎn)，采集6個(gè)我國(guó)種源和3個(gè)北美種源，共23個(gè)個(gè)體作為研究群體，結(jié)果表明，SNP位點(diǎn)在鵝掌楸不同種源間呈現(xiàn)不同的變異。11個(gè)SNP標(biāo)記在北美鵝掌楸種內(nèi)都沒(méi)有多態(tài)性。lm_ll_7542、lm_ll_5667、lm_ll_4694在鵝掌楸和北美鵝掌楸中間呈現(xiàn)出多態(tài)性，可以作為檢測(cè)鵝掌楸和北美鵝掌楸種間分化的潛在標(biāo)記。11個(gè)SNP位點(diǎn)在6個(gè)鵝掌楸種源和3個(gè)北美鵝掌楸種源間的多態(tài)性高于6個(gè)鵝掌楸種源內(nèi)的多態(tài)性，這可能與鵝掌楸物種的進(jìn)化關(guān)系有關(guān)。鵝掌楸在經(jīng)歷了第四紀(jì)冰川時(shí)期后，僅存在于我國(guó)漢水流域以南地區(qū)，以及北美洲的美國(guó)東部沿海至加拿大的安大略省五大湖區(qū)的多倫多地區(qū)。北美鵝掌楸種源在進(jìn)化歷程中SNP位點(diǎn)未見(jiàn)較大的突變發(fā)生；而在鵝掌楸種源中，我國(guó)東南部種源相比于西南部種源發(fā)生了一定比例的堿基突變，在SNP位點(diǎn)處堿基種類較多。由此可見(jiàn)，前期開發(fā)出來(lái)的SNP標(biāo)記可以用于鵝掌楸的起源和遺傳多樣性研究。在后續(xù)的研究中可增加種源的個(gè)體數(shù)和SNP標(biāo)記數(shù)量，確保測(cè)序準(zhǔn)確度的同時(shí)，為鵝掌楸種源變異的研究提供科學(xué)依據(jù)。

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