蟬蟲(chóng)生真菌的分離純化及鑒定

摘要 為了解蟬的寄生真菌種類，通過(guò)分離和鑒定蟬體內(nèi)蟲(chóng)生真菌，觀察其主要特征并對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，為蟬的綠色生物學(xué)防治提供一定的理論依據(jù)。從感染真菌的蟬體內(nèi)分離純化出幾株病原真菌，命名為Y1、 Y3和Y6，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及核糖體DNA序列測(cè)序及分析，對(duì)其進(jìn)行鑒定和分析。由形態(tài)學(xué)可知，真菌Y1和Y3菌落顏色為黃棕色，菌絲白色，孢子黃棕色，圓形，大小均勻，經(jīng)過(guò)ITS序列比對(duì)，結(jié)合形態(tài)特征，其為Scopulariopsis alboflavescen屬真菌。Y6菌落顏色為白色，PDA培養(yǎng)基上菌絲短而致密，生長(zhǎng)緩慢，顯微鏡下觀察其菌絲為無(wú)色，孢子圓形或橢圓形，大小均勻，經(jīng)過(guò)ITS序列比對(duì)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定為Scopulariopsis屬真菌。

關(guān)鍵詞 蟬；寄生真菌；鑒定；Scopulariopsis alboflavescen；Scopulariopsis

中圖分類號(hào) S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）21-0078-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.21.016

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Isolation，Purification and Identification of Parasitic Fungi in Cicada （Hemiptera： Cicadidae）

PENG Hu1，3，CHEN Jin-hua1，2，3，WEI Yun1

（1.College of Environmental Science and Engineering，China West Normal University，Nanchong，Sichuan 637000; 2.State Key Laboratory of Crop Gene Exploration and Utilization in Southwest China，Sichuan Agricultural University，Chengdu，Sichuan 611130;3.Triticeae Research Institute，Sichuan Agricultral University，Chengdu，Sichuan 611130）

Abstract In order to understand the types of parasitic fungi in cicadas，we isolated and identified entomophytic fungi in cicadas，then observed their main characteristics，sequenced and analyzed ITS sequences of the strains.Several pathogenic fungi were isolated and purified from the cicada infected with fungi，named Y1，Y3，and Y6，and their morphology was observed，ribosomal DNA sequencing and analysis were performed to identify and analyze them.Morphologically，it can be inferred that the colonies of fungi Y1 and Y3 are yellow brown in color，with white hyphae and yellow brown spores.They are round and uniform in size.After ITS sequence alignment and combined with morphological characteristics，they belong to the Scopulariopsis alboflavescen genus of fungi.The color of Y6 colony is white，and the hyphae on PDA medium are short and dense，growing slowly.When observed under a microscope，the hyphae aokZ1l3eWr7CzfYztOLGyisykZ35xGDI3ErKI5CV5S/M=re colorless，and the spores are round or elliptical，with uniform sizes.After ITS sequence alignment and combined with morphological characteristics，it is classified as a Scoporariopsis fungus.

Key words Cicada;Parasitic fungi;Identification;Scopulariopsis alboflavescen;Scopulariopsis

基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32100163）；校科研基金項(xiàng)目（11A022）;博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（20E043）。

作者簡(jiǎn)介 彭湖（1998—），男，四川遂寧人，碩士研究生，研究方向：病原微生物學(xué)。*通信作者，講師，博士，從事病原微生物學(xué)研究。

收稿日期 2024-02-23

蟬（Cicadidae）是昆蟲(chóng)綱，半翅目，蟬科（Hemiptera： Cicadidae）的昆蟲(chóng)。其活動(dòng)范圍廣泛，全球均有分布，全世界有180個(gè)屬，2 000余個(gè)種類［1］。在我國(guó)，蟬科昆蟲(chóng)從南到北均有分布，其危害宿主種類很多，包括蘋(píng)果樹(shù)、梨樹(shù)、櫻桃、杏、棗、柑橘等多種果樹(shù)，楊樹(shù)、柳樹(shù)、榆樹(shù)、茶樹(shù)等觀賞樹(shù)木或經(jīng)濟(jì)作物［2-3］。蟬是吸汁性害蟲(chóng)，主要以幼蟲(chóng)蟲(chóng)態(tài)危害植物根部及幼嫩部分，成蟲(chóng)蟲(chóng)態(tài)在樹(shù)枝產(chǎn)卵繁殖，嚴(yán)重影響林木的生長(zhǎng)，危害其產(chǎn)物的數(shù)量和品質(zhì)［2-3］。對(duì)蟬科害蟲(chóng)的防治方法很多，第一類是不同化學(xué)藥劑，如吡蟲(chóng)啉和苦參堿、撲虱靈和氟氯氰菊酯乳油、阿維菌素乳等［4-6］。第二類是生物防治策略，生物防治包括天敵防治，比如使用寄生蜂、蜘蛛、螳螂等［7-9］，以及微生物的防治方法，比如使用大孢巴科霉（Batkoa major）和球孢白僵菌（Beauveria bassiana ）［10］。化學(xué)防治方法，雖然效率較高，但容易對(duì)環(huán)境造成污染，影響非靶標(biāo)的生物，包括其他昆蟲(chóng)和人類健康，也可能影響天敵種群而導(dǎo)致害蟲(chóng)二次爆發(fā)。因此使用生物學(xué)的方法來(lái)防治害蟲(chóng)，專一性強(qiáng)，不易產(chǎn)生抗藥性，對(duì)人類和生態(tài)環(huán)境綠色無(wú)毒。蟲(chóng)生真菌寄生在特定昆蟲(chóng)的幼蟲(chóng)或成蟲(chóng)體內(nèi)［11］，通常對(duì)人類、非靶標(biāo)生物安全無(wú)害，而且能夠在害蟲(chóng)中，自然條件下廣泛流行，因此在農(nóng)業(yè)和林業(yè)害蟲(chóng)生物防治過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［12-13］。筆者分離自然界中蟬的蟲(chóng)生真菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)進(jìn)行種類鑒定，對(duì)進(jìn)一步利用蟲(chóng)生真菌綠色防治蟬等害蟲(chóng)提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

蟬的僵蟲(chóng)采自四川省射洪市鄉(xiāng)村自然生長(zhǎng)的柏樹(shù)。僵蟲(chóng)體表布滿乳黃色或白色菌絲，使用無(wú)菌袋帶回實(shí)驗(yàn)室。采集的僵蟲(chóng)在室內(nèi)陰干30 d后置于無(wú)菌紙盒中，室溫條件下存放。

1.2 蟬蟲(chóng)生真菌寄生現(xiàn)象觀察

用針灸針挑取蟬體表的分生孢子，切取1小塊馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），置于滅菌的載玻片上，置于超凈工作臺(tái)的顯微鏡下觀察。鏡檢發(fā)現(xiàn)圓形的分生孢子。

1.3 蟬蟲(chóng)生真菌分離

配置PDA培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium），加氨芐青霉素至終濃度為100 μg/mL。超凈工作臺(tái)上，使用無(wú)菌剪刀剪一小塊蟬僵蟲(chóng)組織，使用75%乙醇浸泡5 s，再用無(wú)菌水沖洗3次，使用無(wú)菌接種環(huán)挑取孢子，在PDA培養(yǎng)基上劃線分離純化，在25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通過(guò)多次劃線分離單菌落，從而獲得純培養(yǎng)。

1.4 菌落及菌絲、孢子形態(tài)觀察

純培養(yǎng)真菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)6 d后，觀察菌落形態(tài)。切取菌落邊緣小塊菌絲，在載玻片上壓片，使用徠卡光學(xué)顯微鏡（Leica DMi8，美國(guó)）觀察菌絲和孢子發(fā)育情況。使用滅菌的無(wú)紡布將孢子過(guò)濾，置于血球計(jì)數(shù)板或普通載玻片上，利用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.5 PCR擴(kuò)增蟲(chóng)生真菌ITS序列及分析

將滅菌玻璃紙鋪在PDA培養(yǎng)基上，接種純化的真菌，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，揭開(kāi)玻璃紙，收獲菌體，使用CTAB法提取真菌基因組DNA。使用通用引物擴(kuò)增真菌rDNA基因ITS序列，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′），ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）［14］，PCR擴(kuò)增體系為50 μL，包含真菌基因組DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），10×Taq Plus Buffer 5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L） 4 μL（天根生化科技（北京）有限公司，中國(guó)北京），Taq Plus DNA Polymerase （2.5 U/μL） 0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足為50 μL。使用PCR熱循環(huán)儀（賽默飛，美國(guó)）進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s， 30個(gè)循環(huán)，最后 72 ℃延伸 5 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物，獲得清晰的單一預(yù)期條帶后直接送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將所獲序列在 NCBI 的 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中與已知序列進(jìn)行 Blast 比對(duì)。選擇與該試驗(yàn)得到的菌株相似性較高的其他真菌ITS序列，利用 Mega 11.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析，用鄰接法（Neighbor-joining method，N-J 法）構(gòu)建 ITS 序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲(chóng)生真菌形態(tài)觀察

分離純化得到了3個(gè)蟲(chóng)生真菌菌株，分別命名為Y1、Y3和Y6。其中，菌株Y1 在 PDA 培養(yǎng)基上絲狀菌絲呈放射性生長(zhǎng)，菌絲最初為白色，短而致密，生長(zhǎng)緩慢，有分支和分隔，待菌落開(kāi)始產(chǎn)孢后，逐漸變?yōu)辄S棕色，孢子為黃棕色，菌落背面和正面顏色相同，都是黃棕色。具有3級(jí)分生孢子梗，孢子圓形，如圖1所示。

真菌菌株Y3形態(tài)與Y1相似，在 PDA 培養(yǎng)基上菌絲放射性生長(zhǎng)，最初為白色，短而致密，生長(zhǎng)緩慢，菌絲有分支分隔，孢子為黃棕色，菌落背面也為黃棕色。具有3級(jí)分生孢子梗，孢子圓形，如圖2所示。

真菌菌株Y6在 PDA 培養(yǎng)基上菌絲為白色，短而致密，生長(zhǎng)緩慢，菌絲有分支分隔，孢子為白色，菌落正面背面都是白色。分生孢子發(fā)育時(shí)，分生孢子梗末端膨大，孢子圓形或橢圓形，如圖3所示。

2.2 蟬蟲(chóng)生真菌的ITS序列

使用真菌通用引物ITS1/ITS4對(duì)菌株Y1、Y3和Y6的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得了大小約600 bp的單帶，將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。蟲(chóng)生真菌Y1的ITS序列為609 bp，測(cè)序結(jié)果表明，與帚霉屬真菌（Scopulariopsis alboflavescens）的相似度為98.29%，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)將真菌菌株Y1與S.alboflavescens（ACCESSION NR_15620）聚類到一支（圖4），初步鑒定蟲(chóng)生真菌Y1為S.alboflavescens屬真菌。

蟲(chóng)生真菌菌株Y3的ITS序列為612 bp，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中與帚霉屬真菌Scopulariopsis alboflavescens相似度為98.45%，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)將真菌菌株Y3與S.alboflavescens（ACCESSION NR_15620）聚類到一起（圖5），初步鑒定菌株Y3為S.alboflavescens屬真菌。

蟲(chóng)生真菌菌株Y6的ITS序列為642 bp，與福斯卡帚霉Scopulariopsis fusca相似度98.66%，與Scopulariopsis caseicola的相似性為98.75%，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)將菌株Y6與S.caseicola

（ACCESSION NR_155811）、福斯卡帚霉S.fusca（ACCESSION NR_145258）聚類到一起（圖6），初步認(rèn)定其是一種S.caseicola屬的真菌。

3 討論

該研究所獲得的3種蟬的蟲(chóng)生真菌，均為帚霉屬Scopulariopsis屬真菌，包括2株S.alboflavescens菌株和1株S.caseicola菌株。帚霉屬有性期隸屬于子囊菌門(mén)Ascomycota，真子囊菌綱Euascomycetes，小囊菌目Microascales，小囊菌科Microascacea。無(wú)性期隸屬于半知菌亞門(mén)Deuteromycontina，絲孢綱Hyphomycetes，叢梗孢目Hyphomycetales，叢梗孢科Moniliaceae。

Scopulariopsis屬真菌是一種自然界中廣泛分布的真菌，多數(shù)不具有致病性，短帚霉（S.brevicaulis）可能在免疫力低下的情況下導(dǎo)致人類疾病［16］。有研究發(fā)現(xiàn)， S. alboflavescens可導(dǎo)致急性白血病患者的感染［17］。邵長(zhǎng)倫等［18-19］使用柳珊瑚內(nèi)生Scopulariopsis屬真菌制作喹唑啉（quinazoline）類生物堿化合物，具有抑制腫瘤細(xì)胞的功能。Scopulariopsis屬真菌感染昆蟲(chóng)，有關(guān)其用于有害昆蟲(chóng)防治的研究目前鮮見(jiàn)報(bào)道。

蟲(chóng)生真菌作為生防菌株，用于害蟲(chóng)防治，也越來(lái)越受到重視，并且已廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)。白僵菌（Beauveria bassiana）是一種子囊菌類的蟲(chóng)生真菌，是最為廣泛使用的昆蟲(chóng)生物防治劑之一，已廣泛應(yīng)用于夜蛾、馬鈴薯塊莖蛾、鞘翅目昆蟲(chóng)等多種害蟲(chóng)的防治［19-21］。子囊菌科的綠僵菌（Metarhizium）被稱為排名第二的昆蟲(chóng)病原真菌，僅次于白僵菌，寄主范圍廣，包括蛛形綱和大多數(shù)其他昆蟲(chóng)目［22-23］，已廣泛用于生物農(nóng)藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用［24-26］。林儼等［27］從蟬科昆蟲(chóng)中分離到病原菌81株，并對(duì)多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)寄生蟬科的真菌主要是球孢白僵菌、蟬花蟲(chóng)草和綠色綠僵菌等。王軍等［28］研究了秦巴山區(qū)農(nóng)林作物害蟲(chóng)生防菌種資源，分離得到蟲(chóng)生真菌187株，為該地區(qū)蟲(chóng)生真菌資源的多樣性研究和開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

蟬是一種世界范圍內(nèi)嚴(yán)重的樹(shù)木吸汁性害蟲(chóng)，需要在綜合害蟲(chóng)管理中使用不同的方法來(lái)防控。在我國(guó)農(nóng)林業(yè)發(fā)展過(guò)程中，單一樹(shù)種密集種植，常常導(dǎo)致蟲(chóng)害逐年嚴(yán)重［28］。該研究純化和鑒定到的Scopulariopsis屬3個(gè)真菌菌株均導(dǎo)致蟬的成蟲(chóng)形成僵蟲(chóng)，體表和體內(nèi)長(zhǎng)滿菌絲和孢子，在防治蟬方面具有一定潛力。該研究豐富了生防真菌菌種資源庫(kù)，將為蟬的生物防治提供新的參考依據(jù)，在農(nóng)業(yè)和林業(yè)害蟲(chóng)防治領(lǐng)域具有應(yīng)用前景。在今后的研究中，將從這3種蟲(chóng)生病原真菌與宿主蟬的相互作用、致病機(jī)理和實(shí)踐應(yīng)用等方面展開(kāi)研究。

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