灰氈毛忍冬SS基因的克隆及表達分析

摘要 ［目的］克隆灰氈毛忍冬SS基因全長序列，并進行生物信息學和表達模式分析。［方法］提取灰氈毛忍冬花總RNA，通過RT-PCR和RACE技術克隆LmSS基因的全長cDNA序列；運用相關軟件對該基因序列進行生物信息學分析；利用qRT-PCR測定灰氈毛忍冬莖、葉和不同花期花中該基因的相對表達量。［結(jié)果］克隆的LmSS基因開放閱讀框（ORF）長度為1 245 bp，編碼414個氨基酸，屬于親水性蛋白，定位于細胞質(zhì)中，具有典型的多聚異戊二烯基合成酶活性結(jié)構(gòu)域，與其他植物SS基因具有較高同源性。LmSS基因在灰氈毛忍冬不同花期和器官中表達有組織特異性。［結(jié)論］該研究成功地克隆灰氈毛忍冬中的SS基因，為進一步研究該基因的功能奠定基礎，同時為探究灰氈毛忍冬皂苷生物合成和調(diào)節(jié)機制提供了科學依據(jù)。

關鍵詞 灰氈毛忍冬；鯊烯合酶（SS）；基因克??；生物信息學；表達分析

中圖分類號 S567.7+9 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）21-0071-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.21.015

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Cloning and Expression Analysis of Squalene Synthase Gene in Lonicera macranthoides

CHEN Xun1，WANG Shan2，LONG Yu-qing3 et al

（1. Affiliated Nanhua Hospital， University of South China， Hengyang， Hunan 421002;2.The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005;3.School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208）

Abstract ［Objective］To clone the full-length sequence of the squalene synthase gene and perform bioinformatics and expression pattern analysis from Lonicera macranthoides. ［Method］Total RNA was extracted from Lonicera macranthoides， and the full-length cDNA sequence of LmSS gene was cloned using RT-PCR and RACE techniques， bioinformatics analysis was conducted on the gene sequence using relevant software， the relative expression of the gene in stem， leaf， and different flower period was determined by using Real-time PCR. ［Result］The open reading frame （ORF） of LmSS gene was 1 245 bp， encoding 414 amino acids.It belongs to a hydrophilic protein and is located in the cytoplasm. LmSS gene has a typical polyisoprene synthase active domain ， which has high homology with other plant SS genes. The expression of LmSS gene is tissue-specific in different flowering stages and organs of Lonicera macranthoides. ［Conclusion］This study successfully cloned the SS gene in Lonicera macranthoides， laying a foundation for further research on its function and providing a research basis for exploring the biosynthesis and regulatory mechanism of saponins in Lonicera macranthoides.

Key words Lonicera macranthoides Hand.-Mazz;Squalene synthase （SS）;Gene cloning;Bioinformatics;Expression analysis

基金項目 湖南省自然科學基金項目（2021JJ30497）；湖南省教育廳資助科研項目（16B193）；湖南省自然科學基金聯(lián)合項目（2024JJ8221）；湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目（D2022134）；湖南省教育廳科學研究項目（21C0245）。

作者簡介 陳勛（1995—），男，湖南衡陽人，主管藥師，碩士，從事中藥資源質(zhì)量與開發(fā)研究。

*通信作者，教授，博士，博士生導師，從事中藥資源與質(zhì)量研究。

收稿日期 2024-06-25

灰氈毛忍冬來源于忍冬科多年生藤本植物，歸于山銀花之下，其入藥部位為干燥花蕾或帶初開的花［1］。灰氈毛忍冬中含有的2種皂苷灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙是山銀花的指標性成分，同時灰氈毛忍冬中也含灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬次皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷丙等多種皂苷類成分［2-3］。有研究表明，灰氈毛忍冬的皂苷類成分具有保護肝臟、抑制腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和抗過敏、清除自由基抗氧化等多種藥理作用［3］。

灰氈毛忍冬皂苷屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜類化合物［4］，而鯊烯合酶（squalene synthase，SS）在植物三萜類生物合成過程中起到關鍵作用，可以催化法呢酯焦磷酸縮合產(chǎn)生鯊烯，鯊烯是生成三萜類化合物重要的前體物質(zhì)［5］。有研究者克隆出蒲公英的SS基因，并構(gòu)建了TaSS 過表達載體，提高了轉(zhuǎn)基因株系中蒲公英甾醇（齊墩果烷型五環(huán)三萜類化合物）含量［6］。將構(gòu)建的三七SS基因超表達載體，利用農(nóng)桿菌介導法導入三七細胞中，結(jié)果轉(zhuǎn)基因細胞中的皂苷含量均顯著增加［7］。在西洋參的各組織器官中，SS基因的表達量有顯著差異，與其皂苷含量呈正相關［8］。由此可見，鯊烯合酶在植物三萜類化合物生物合成過程中發(fā)揮著重要作用，其含量可影響后續(xù)產(chǎn)物的合成，提高鯊烯合酶的活性，增加三萜類化合物的含量［5］。筆者根據(jù)課題組前期灰氈毛忍冬的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選注釋為squalene synthase的Unigene基因，成功克隆得到LmSS基因的全長序列，通過在線軟件對其氨基酸序列進行生物信息學分析，測定不同花期、不同器官的SS基因相對表達量，以期為探明鯊烯合酶在灰氈毛忍冬三萜生物合成途徑中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

灰氈毛忍冬種植于湖南中醫(yī)藥大學藥植園，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學周日寶教授鑒定為灰氈毛忍冬，采收其新鮮莖、葉及花，用裝有液氮的泡沫盒運回實驗室，將樣品分類后用密封袋封口，保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.2 試藥

多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，杭州博日科技有限公司；DNA回收試劑盒，康為世紀生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Thermo；pEASY-T1 Cloning Vector，北京全式金生物科技有限公司；pEASY-Blunt Cloning Vector，北京全式金生物科技有限公司；TranStart Green qPCR SuperMix UDG，北京全式金生物科技有限公司；RACE試劑盒，Clontech。所用引物見表1（引物由上海生工生物工程股份有限公司合成）。

1.3 試驗方法

1.3.1 LmSS基因核心片段擴增。

用液氮預冷研缽，加入適量灰氈毛忍冬花蕾充分研磨，用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取花蕾的總RNA，將質(zhì)量較好的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈。

在轉(zhuǎn)錄組Unigene基因序列中，選取注釋為squalene synthase的序列，用Primer Premier 5.0設計特異性引物SS-F和SS-R（表1）。PCR反應體系和反應條件參考文獻［9］，用DNA回收試劑盒對目的條帶進行回收，將回收的 PCR 產(chǎn)物進行載體連接和轉(zhuǎn)化，載體選用pEASY-T1 Cloning Vector，挑選白色菌落進行陽性克隆檢測，根據(jù)菌落PCR結(jié)果，將陽性克隆接種于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.2 LmSS基因3′和 5′端RACE擴增。

以“1.3.1”中的總RNA為模板，按照RACE試劑盒說明書分別獲得LmSS基因的5′and3′-RACE-Ready cDNA，稀釋后保存于-20 ℃冰箱備用。根據(jù)“1.3.1”測序結(jié)果，設計RACE特異性引物SS-3′和SS-5′（表1），RACE的PCR反應體系和反應條件參考文獻［9］，目的條帶回收、載體連接和轉(zhuǎn)化、菌液PCR、測序等過程同“1.3.1”，載體選用pEASY-Blunt Cloning Vector。

1.3.3 LmSS基因cDNA全長序列驗證。

根據(jù)“1.3.2”獲得的LmSS全長序列，在其開放閱讀框（ORF）中，設計全長驗證引物V-SS-F和V-SS-R（表1）。全長驗證PCR的反應體系和反應條件參考文獻［9］，以“1.3.1”中獲得的cDNA為模板，目的條帶回收、載體連接和轉(zhuǎn)化、菌液PCR、測序等過程同“1.3.1”，載體選用pEASY-Blunt Cloning Vector。

1.3.4 生物信息學分析。

根據(jù)LmSS基因的全長序列，采用在線軟件ORF finder查找開放閱讀框；ProtParam分析蛋白理化性質(zhì)；ProtScale預測蛋白的親/疏水性；TMHMM 2.0預測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；SignalP 4.1 Server預測蛋白信號肽；WOLF PSORT預測蛋白亞細胞定位；NetPhos-3.1預測蛋白磷酸化位點；CD-Search預測蛋白結(jié)構(gòu)域；SOPMA和SWISS-MODEL分別預測蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)；MEME預測蛋白保守基序。

1.3.5 LmSS基因的表達量分析。

按照“1.3.1”中的方法，用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒分別提取灰氈毛忍冬莖、葉和7個不同花期花（花蕾初期、青綠色花蕾期、綠白色花蕾期、白色花蕾期、白色開花期、金黃色開花期、枯萎期，見圖1）的總RNA，將RNA定量后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板。根據(jù)LmSS基因序列，設計熒光定量PCR的特異性引物Q-SS-R和Q-SS-F（表1）。熒光定量PCR的反應體系和反應條件參考文獻［9］，反應結(jié)束后用2-ΔΔCT計算基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 LmSS基因核心片段擴增結(jié)果

擴增結(jié)果為單一條帶（圖2），約850 bp。測序結(jié)果為860 bp，通過DNAMAN比對，該測序結(jié)果與注釋為squalene synthase的Unigene基因序列重合部分完全一致。

2.2 LmSS基因3′和 5′端RACE擴增結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，3′端在1 200 bp左右出現(xiàn)1條亮帶（圖3A），5′端在600 bp左右出現(xiàn)一條亮帶（圖3B），測序結(jié)果分別為LmSS基因RACE擴增的3′和5′端，利用軟件將克隆出的3′和5′端序列進行拼接，獲得 LmSS基因的 cDNA 全長序列為1 695 bp。

2.3 LmSS基因cDNA全長序列驗證

瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)在1 700 bp左右有明顯的單一亮帶（圖4），測序結(jié)果與拼接的全長序列完全一致。將其上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫并命名為LmSS，基因登錄號為MK419949。

2.4 生物信息學分析結(jié)果

2.4.1

LmSS蛋白理化性質(zhì)分析。

灰氈毛忍冬SS基因全長1 695 bp，開放閱讀框1 245 bp，3′非編碼區(qū)316 bp，帶有35 bp的ployA尾，5′非編碼區(qū)134 bp。根據(jù)ExPASy ProtParam在線軟件預測分析，LmSS的相對分子質(zhì)量為47 220.92，分子式C2129H3350N562O600S25，編碼的氨基酸數(shù)目為414個，等電點為7.59，不穩(wěn)定系數(shù)為43.07（＞40），屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)96.16，總平均親水指數(shù)（GRAVY）為-0.048，為親水性蛋白，同時ProtScale也預測LmSS為親水性蛋白。預測LmSS

蛋白亞細胞定位于細胞質(zhì)中。LmSS基因編碼的氨基酸具有一個跨膜區(qū)域，跨膜結(jié)構(gòu)域的位置389～408 aa；1～388 aa在膜外，409～414 aa在膜內(nèi)。SignalP 5.0 Server預測LmSS不具有信號肽序列，推測其不是分泌蛋白。蛋白磷酸化位點預測發(fā)現(xiàn)，LmSS有20個Ser位點、10個Thr位點及7個Tyr位點。

2.4.2 LmSS蛋白結(jié)構(gòu)分析。

通過 CD-Search 分析發(fā)現(xiàn)，LmSS蛋白具有典型的多聚異戊二烯基合成酶活性結(jié)構(gòu)域和鯊烯/八氫番茄紅素合成酶活性結(jié)構(gòu)域，屬于Isoprenoid-Biosyn-C1 超家族，為類異戊二烯生物合成酶（圖5），這與王琴波等［10］的研究一致。

用SOPMA預測LmSS蛋白的二級結(jié)構(gòu)顯示（圖6），該蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要元件為α-螺旋和隨機卷曲，占比分別為70.05%、20.77%。通過SWISS-MODEL建模得到LmSS 蛋白的三級結(jié)構(gòu)（圖7），其蛋白模型為D2K762.1.A，序列相似度為85.99%。

2.4.3 LmSS蛋白多序列比對、系統(tǒng)進化樹和保守基序分析。

在NCBI的BlastP中下載與LmSS相似度較高的幾個植物SS基因序列，通過多序列比對（圖8），結(jié)果顯示，LmSS與三七（ABA29019.1，Panax notoginseng）的氨基酸序列一致性最高，達87.47%；與人參（ACV88718.1，Panax ginseng）

達到86.27%；與西洋參（CAJ58418.1，Panax quinquefolius）達到86.02%；與其他植物的SS基因也有較高的相似度。

選取NCBI其他14個植物的SS基因序列，構(gòu)建NJ進化樹，結(jié)果見圖9。在SS基因的系統(tǒng)進化樹上，距離越近，表示在進化遺傳學上親緣越近，其中灰氈毛忍冬單獨為一

小支，與人參Panax ginseng、西洋參Panax quinquefolius、刺五加Eleutherococcus senticosus、茶Camellia sinensis、北柴胡Bupleurum chinense、三七Panax notoginseng、楤木Aralia chinensis為一大支。

對這15種植物蛋白進行保守基序分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)均有12個保守基序結(jié)構(gòu)（圖10），相似度極高，基序的長度在6～50個氨基酸。

2.5 LmSS基因的表達量

應用實時熒光定量PCR測定的表達量結(jié)果如下（圖11）：以花蕾初期為參照，LmSS基因在白色花蕾期表達量最高，金黃色開花期次之；在莖和葉中也有表達，其莖的表達量最低。SS基因在灰氈毛忍冬不同花期和器官均有表達，但表達量有一定差異。

3 討論與結(jié)論

三萜類化合物是植物重要的生物活性產(chǎn)物，具有廣泛的藥用價值與經(jīng)濟價值?；覛置潭碥找覟樯姐y花中主要的三萜皂苷，對肝癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤細胞能產(chǎn)生顯著的抑制效應，對于人體肝癌細胞 Hepal-6殺傷作用明顯，通過破壞Hepal-6 細胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的動態(tài)平衡，啟動凋亡程序［11］。灰氈毛忍冬次皂苷乙能抑制實體腫瘤細胞LOVE和非實體腫瘤細胞HL-60的生長，降低腫瘤細胞的存活率［12］?；覛置潭傇碥諏Υ蟆⑿∈蟾螕p傷有保護作用［13］。因此，解析灰氈毛忍冬三萜類化合物代謝途徑和調(diào)節(jié)機制可為灰氈毛忍冬合成生物學研究及新藥開發(fā)提供研究基礎。

目前有研究表明，在植物細胞中存在2條合成三萜化合物的途徑，即甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway，MVA）與甲基赤蘚糖磷酸途徑（methylerythritol-4-phosphate pathway，MEP/DXP），2條途徑分別于胞質(zhì)與質(zhì)體中進行［14］，其中 MVA 途徑是植物三萜類化合物合成的主要途徑［10］。在MVA途徑中，鯊烯合酶位于三萜合成通路的分支點上，是三萜類化合物的底物合成起始點的催化合成酶，是三萜類化合物合成途徑中一個關鍵限速酶，對三萜類化合物合成途徑的下游物質(zhì)合成和積累具有決定性意義［10］。該研究克隆得到

了灰氈毛忍冬SS基因的cDNA全長1 695 bp，開放閱讀框1 245 bp，該序列編碼氨基酸414個。LmSS屬于親水性蛋白，定位于細胞質(zhì)中，具有典型的多聚異戊二烯基合成酶活性結(jié)構(gòu)域，這與前人的研究結(jié)果基本一致［10］。通過蛋白質(zhì)序列比對，與人參、三七等SS基因相似度達80%以上。有研究表明，對SS基因過表達，人參［15］和三七［7］的皂苷含量提高。SS基因在灰氈毛忍冬的不同花期中表達量具有時空差異，在白色開花期的含量最高；SS基因在灰氈毛忍冬的不同組織中均有表達，但具有組織特異性。目前有文獻研究表明［16］，灰氈毛忍冬不同組織皂苷含量存在差異，花蕾中的含量最高，其次是葉，莖中含量最少，與該研究SS基因在花蕾、葉、莖的表達量成正相關，因此可推測SS基因在灰氈毛忍冬中表達量增加，可提高其皂苷含量。

有研究者構(gòu)建紫花苜蓿MsSS的超表達載體，介導轉(zhuǎn)化到紫花苜蓿中，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株中MsSS表達量和總皂苷量均高于野生型紫花苜蓿［17］。將含有甘草GuSS的植物載體通過介導轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)入甘草毛狀根中，轉(zhuǎn)基因毛狀根中甘草酸的最高含量約為野生型毛狀根的3.6倍［18］。紫菀AtaSS在擬南芥中過表達，其總?cè)坪亢虯taSS表達量均高于野生型擬南芥［19］。目前，有關灰氈毛忍冬三萜類合成酶生物合成基因的研究較少，該研究從灰氈毛忍冬中成功克隆得到LmSS基因全長，對其基因序列進行生物信息學預測和分析，LmSS與其他植物SS基因在結(jié)構(gòu)域、同源性、保守基序等具有較高的相似度，推測它們在功能上相似。下一步可將LmSS基因介導轉(zhuǎn)入煙草中異源表達，進行功能驗證，完善灰氈毛忍冬三萜類化合物的生物合成途徑，后期通過合成生物學的研究，優(yōu)化灰氈毛忍冬的種質(zhì)資源。

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