減氮對麥玉輪作農(nóng)田土壤反硝化細菌群落結構和多樣性的影響

關鍵詞：減氮；nirK；nirS；反硝化細菌；麥玉輪作；多樣性；群落結構

華北地區(qū)是我國重要的糧食生產(chǎn)基地，以冬小麥一夏玉米一年兩熟種植模式為主，該地區(qū)常規(guī)施肥模式（550-600kg·hm-2·a-1）不但沒有顯著提高作物產(chǎn)量，反而導致農(nóng)田N20排放量和硝酸鹽淋失量增加。農(nóng)田N20排放量占人類活動產(chǎn)生的N20排放量的84%。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中氮肥的大量施用是大氣中N20的排放量增加的重要原因之一。因此，減氮可有效降低農(nóng)田N20排放量、減少農(nóng)業(yè)面源污染。土壤中N20排放主要是在微生物和酶的作用下，通過硝化、反硝化作用、硝酸鹽異化還原成銨作用產(chǎn)生。其中反硝化作用是N20排放的重要途徑之一。土壤微生物是農(nóng)田土壤反硝化過程的主要參與者，土壤環(huán)境質量影響微生物種群、數(shù)量、活性和群落結構。反硝化細菌具有的Cu-亞硝酸還原酶（nirK）和細胞色素cdl-亞硝酸還原酶（nirS）是將亞硝酸鹽還原成NO的重要限速酶，也是區(qū)別于其他硝酸鹽代謝的標志性反應。故nirK和nirS基因常被作為分子標記物用于研究參與土壤反硝化過程中N02還原成NO的重要功能微生物。土壤反硝化作用是土壤氮循環(huán)的關鍵環(huán)節(jié)，因此，研究減氮對麥玉輪作農(nóng)田土壤nirS、nirK反硝化細菌群落結構影響及其作用機制對調控農(nóng)田土壤氮循環(huán)具有重要意義。

與農(nóng)民常規(guī)施氮量相比，減氮21%-24%處理的冬小麥和夏玉米產(chǎn)量增加，氮肥利用效率和經(jīng)濟效益均增加，氮損失降低了156kg·hm-2。與減氮20%處理相比，農(nóng)民常規(guī)施氮量處理夏玉米和冬小麥土壤全剖面硝態(tài)氮存儲量分別增加39.40%和35.55%，且減氮20%處理冬小麥和夏玉米水氮利用效率均較高，因此，在2-4m地下水埋深區(qū)域冬小麥和夏玉米減氮20%可行。土壤中的N03-N是反硝化細菌反硝化作用的電子受體，可直接影響土壤的反硝化作用，施用化學氮肥能夠顯著增加土壤中N03-N量，繼而增強反硝化作用強度。反硝化細菌對土壤含水率、NH4和可溶性有機碳（DOC）變化都很敏感，且存在明顯不同的環(huán)境偏好。另外，雖然nirS和nirK反硝化細菌均控制著水稻田土壤亞硝酸鹽還原酶活性，但二者對亞硝酸鹽還原酶活性貢獻不同。

肥料類型、施肥量、耕作措施、灌溉等農(nóng)作措施影響土壤反硝化微生物豐度、群落結構和多樣性。Yang等研究表明，施氮量影響堿性農(nóng)田小麥土壤nirK和nirS反硝化細菌相對豐度和群落組成，且nirS反硝化細菌豐度高于nirK反硝化細菌，高施氮量中的nirS反硝化細菌豐度降低；隨著施氮量的增加，nirK反硝化細菌豐度增加。周麗等研究表明，與常規(guī)施氮量相比，減氮25%降低了土壤反硝化作用，降低了玉米／大豆套作系統(tǒng)nirS反硝化細菌多樣性。Yang等在酸性茶田研究表明，施氮顯著提高了反硝化細菌絕對豐度，narG和nirK反硝化細菌絕對豐度隨著施氮量的增加而增加，但不同反硝化細菌絕對豐度隨施氮量變化不同，另外，隨著施氮量增加，土壤反硝化細菌多樣性降低，且施氮量顯著影響土壤反硝化細菌群落組成。Pan等研究表明，高鹽脅迫或高pH值脅迫均能顯著降低nirK、nirS基因豐度，但增加施氮量減弱了鹽脅迫或高pH值脅迫對nirK、nirS基因豐度的降低效應。楊祺等研究表明，施氮量顯著影響番茄根際細菌群落結構，土壤硝態(tài)氮、全氮和電導率是驅動細菌群落結構變化的主要因子。Wang等設置減氮配施生物炭試驗研究表明，土壤有機質量、硝態(tài)氮量、全磷量是影響nirS、nirK反硝化細菌群落結構的主要環(huán)境因子。減氮會增加土壤碳氮比，提升了土壤微生物活性，從而影響反硝化細菌的群落組成；減氮也會降低土壤孔隙度，影響土壤透氣性和貯水能力，進而影響微生物的繁殖和活動，影響微生物群落結構；施氮量過多可能導致土壤酸化，而酸性土壤通常不利于某些反硝化細菌的生長和活動。所以不同環(huán)境條件下，支配土壤N20釋放的微生物群落有很大差異，施氮量對土壤微生物群落結構影響機制不一致，施氮量對華北地區(qū)堿性麥玉輪作農(nóng)田玉米季土壤反硝化細菌群落結構影響尚不清晰。為此，本研究在地中滲透儀觀測場開展小區(qū)試驗，研究減氮對土壤反硝化細菌群落組成及多樣性的影響，揭示減氮對華北地區(qū)麥玉輪作農(nóng)田土壤反硝化細菌群落結構影響機制，為控制農(nóng)田N20排放、減少農(nóng)業(yè)面源污染提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗概況

試驗于2019年6月至2021年6月在中國農(nóng)業(yè)科學院河南新鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)水土環(huán)境野外科學觀測試驗站大型地中滲透儀觀測場（35°19'N、113°53'E，海拔73.2m）進行。試驗地多年平均氣溫14.1℃，無霜期210d，日照時間2398.8h．多年平均降水量588.8mm，降水量年際變化較大，豐水年與枯水年可相差3-4倍，7-9月降水量占全年降水量的70%左右，多年平均蒸發(fā)量2000mm。試驗土壤為粉砂壤土，主要理化性質詳見表1。測坑面積1.5mx3m，各測坑為帶底鋼筋混凝土結構。

1.2試驗設計

夏玉米（Zea malrs L.）品種為懷玉208。2019-2020年均為6月上旬播種，9月下旬收獲，全生育期105-108d．種植密度均為6667株·hm-2。供試冬小麥（Triticum aestivum L）品種為百農(nóng)4199。2019-2021年均為10月中旬播種，次年5月下旬收獲，播種量均為165kg·hm-2。

以不施氮為對照（CK），設置2個施氮量，分別為常規(guī)施氮量（純氮300kg·hm-2，當?shù)剞r(nóng)民常用量，N2）、減氮20%（純氮240kg·hm-2，N1），共計3個處理，每個處理4次重復，共計12個小區(qū)。在20cm土層處埋設RS-XAJ-100探頭，用于監(jiān)測土壤水分和指導灌溉。用井水灌溉，每次取水時檢測水質，灌溉方式為地面灌，土壤含水率低于55%田間持水率時灌水。試驗用肥為含氮46%的尿素、含P20512%的過磷酸鈣、含K20 50%的硫酸鉀；P202施入量為150kg·hm-2，K20施人量為120kg·hm-2。夏玉米氮肥以底肥和追肥4：6的方式施人，底肥于玉米播種時施入，追肥于大喇叭口期撒施；小麥氮肥以底肥和追肥6：4的方式施人，底肥于小麥播種時施入，追肥于返青期撒施，其他田間管理措施與當?shù)卮筇锵嗤?/p>

1.3測定指標及方法

1.3.1土壤理化性狀

分別于作物收獲后，在每個小區(qū)用螺旋鉆隨機采集0-20cm土層3個土壤樣品，組成每個小區(qū)的混合樣品，本次試驗土壤樣品為玉米季生育期末2020年9月24日取樣。取回土后一部分裝到鋁盒里面，用烘干法測定土壤含水率；剩余的土樣分3份，一份用4℃冰箱保存，并于1周內(nèi)完成硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的測定；一份于-80℃冰箱保存，用于土壤微生物多樣性測定；另一部分放陰涼處風干，室溫保存，研磨過不同孔徑篩子后，測定全氮、全磷、速效磷、速效鉀、pH值、電導率、有機質。其中，全氮、全磷、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮均采用流動分析儀（Bran Luebbe AA3）測定；速效磷采用碳酸氫鈉法測定；速效鉀采用火焰光度法測定；pH值（土水比1：2.5）和電導率（土水比1：5）采用pH計、電導率儀測定；有機質采用重鉻酸鉀容量法測定。

1.3.2反硝化細菌多樣性

采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNAPolymerase試劑盒抽提DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。按指定測序區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物進行PCR擴增，引物序列為：nirK（FlaCu-R3Cua）PrimerF：5’-ATCATGGTSCTGCC-GCG-3’．PrimerR：5’-GCCTCGATCAGRTTGTGGTT-3’： nirS （cd3a-R3cd） PrimerF：5’-GTSAACGTSAAGG-ARACSGG-3’， PrimerR：5’-GASTTCGGRTGSGTCTT-GA-3’。測序平臺為MiSeq PE300，由北京奧維森基因科技有限公司提供技術支持。測序原始數(shù)據(jù)下機后，首先進行數(shù)據(jù)質控，通過序列拼接、過濾和去嵌合體后得到優(yōu)化序列，然后進行OTU聚類及注釋?；诰垲惤Y果，進行Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析；基于注釋結果，可以得到各水平的分類信息，從而進行樣本組成及樣本間群落結構差異相關分析。文中將相對豐度gt;0.1%的菌群定義為優(yōu)勢菌群，將相對豐度lt;0.01%的菌群定義為稀有菌群。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010處理數(shù)據(jù)和作圖；在SPSS 19.0使用Duncan法進行方差分析和相關分析；運用CANO-C0 4.5進行RDA分析。

2結果與分析

2.1麥玉輪作農(nóng)田耕層土壤性質

由表2可知，N1、N2處理的硝態(tài)氮量、速效磷量、全磷量顯著高于CK，但CK速效鉀量顯著高于N1、N2處理，但N1、N2處理耕層土壤有機質量、硝態(tài)氮量、速效磷量、速效鉀量、全磷量無顯著差異；N2處理的全氮量顯著高于N1處理和CK，但CK與N1處理無顯著差異；N1處理的銨態(tài)氮量顯著高于CK．N2處理，但CK與N2處理之間無顯著差異；各處理土壤pH值和土壤電導率差異均顯著，其中土壤pH值表現(xiàn)為CKgt;N1處理gt;N2處理，土壤電導率表現(xiàn)為N1處理gt;N2處理gt;CK。

2.2反硝化細菌a-多樣性指數(shù)

各處理反硝化細菌Chao、Coverage、Observed_Spe-cies、Shannon、Simpson多樣性指數(shù)見表3。由表3可知，各處理Coverage值均較高，因此測序結果可反映樣本中微生物真實情況，各處理nirS、nirK反硝化細菌Coverage值無顯著差異。Chao是估計群落中的OTUs數(shù)目，因此其值越大，表明群落中的物種越豐富，各處理nirS、nirK反硝化細菌Chao值無顯著差異，CK、N1、N2處理nirS反硝化細菌Chao值分別是nirK反硝化細菌Chao值的2.11、1.64、1.84倍。ob-served_species是隨測序深度增加，實際觀測到OTUs的個數(shù)，因此其值越大，表明群落物種越豐富，CK、N1、N2處理的nirS反硝化細菌observed_species值分別是nirK反硝化細菌observed_species值的2.11、1.73、1.92倍，但3個處理nirS、nirK反硝化細菌ob-served_species值無顯著差異。Shannon、Simpson均為估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一，Shannon、Simp-son指數(shù)越大，說明群落多樣性越高。由表3可知，各處理nirS、nirK反硝化細菌Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)無顯著差異。綜上可知，3個處理nirS、nirK反硝化細菌a-多樣性指數(shù)無顯著差異，但nirS反硝化細菌a-多樣性高于nirK。

2.3反硝化細菌OTUs分析

圖1為各處理nirS、nirK反硝化細菌OTUs組成及重疊情況。由圖1（a）可知，CK、N1、N2處理nirS反硝化細菌獨有OTUs數(shù)為561、318、624；CK、N1、N2處理nirS反硝化細菌共有的OTUs數(shù)為1127；N1、N2處理nirS反硝化細菌共有的OTUs數(shù)為1306，CK、N1處理nirS反硝化細菌共有的OTUs數(shù)為1383，CK、N2處理nirS反硝化細菌共有的OTUs數(shù)為1389；CK、N1、N2處理nirS反硝化細菌OTUs總數(shù)為2206、1880、2192。由圖l（b）可知，CK、N1、N2處理nirK反硝化細菌獨有OTUs數(shù)為172、232、265；CK、N1、N2處理nirK反硝化細菌共有的OTUs數(shù)為582；N1、N2處理nirK反硝化細菌共有的OTUs數(shù)為734，CK、N1處理nirK反硝化細菌共有的OTUs數(shù)為737，CK、N2處理nirK反硝化細菌共有的OTUs數(shù)為649；CK、N1、N2處理nirK反硝化細菌OTUs總數(shù)為976、1121、1066。綜上可知，CK的nirS反硝化細菌OTUs數(shù)最多，N1處理的nirK反硝化細菌OTUs數(shù)最多；減氮增加了nirK反硝化細菌OTUs數(shù)，但降低了nirS反硝化細菌OTUs數(shù)。

2.4反硝化細菌群落組成

圖2為各處理耕層土壤反硝化細菌在門水平上的物種成分組成。由圖2（a）可知，3個處理nirS反硝化細菌物種優(yōu)勢菌門分別為Proteobacteria（變形菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、Planctomvcetes（浮霉菌門）、Actinobacteria（放線菌門），4個菌門累計占比為43.30%-55.20%。其中，3個處理nirS反硝化細菌主要以Proteobacteria為主，其占比為42.73%-54.89%，且3個處理之間無顯著差異。各處理間僅Firmicutes、Actinobac teria、Chloroflexi（綠灣菌門）差異顯著，其他菌門之間均無顯著差異，其中CK的Firmicutes、Chloro-flexi均顯著高于N1、N2處理，但是N1、N2處理之間差異不顯著；CK的Actinobacteria顯著高于N1處理，但二者與N2處理均無顯著差異。故減氮對nirS型反硝化細菌門水平物種組成無顯著影響。由圖2（b）可知，3個處理nirK反硝化細菌物種較多的菌門分別為Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria（酸桿菌門），3個菌門累計占比為97.16%-98.80%，其中，3個處理nirK反硝化細菌主要以Proteobacteria為主，其占比為96.53%-98.60%，且3個處理之間無顯著差異。各處理間僅稀有菌門Chloroflexi差異顯著，其他菌門之間均無顯著差異，其中CK的Chloroflexi均顯著高于N1、N2處理，但是N1、N2處理之間差異不顯著。故減氮對nirK型反硝化細菌門水平物種組成無顯著影響。綜上可知，減氮對nirK、nirK反硝化細菌門水平物種組成無顯著影響。

圖3為各處理耕層土壤反硝化細菌在綱水平上的物種成分組成。由圖3（a）可知，3個處理nirS反硝化細菌優(yōu)勢菌綱分別為Betaproteobacteria（p-變形菌綱）、Gammaproteobacteria（變形菌綱）、Alphaproteo-bacteria（a-變形菌綱）、Bacilli（芽孢桿菌綱）、Plancto-mycetia（浮霉菌綱），5個菌綱累計占比為43.13%-55.04%。其中，3個處理nirS反硝化細菌主要以Beta-proteobacteria為主，其占比為20.22%-29.19%，且N2處理Betaproteobacteria顯著高于CK，但CK、N2處理與N1處理均無顯著差異。3個處理nirS反硝化細菌Bacilli相對豐度為0.08%-0.41%，其中CK的Bacilli、Thermomicrobia（熱微菌綱）相對豐度顯著高于N1、N2處理，但是N1、N2處理之間無顯著差異。N2、CK處理的Deltaproteobacteria（變形菌綱）相對豐度顯著高于N1處理，但是CK與N2處理之間無顯著差異。CK的Actinobacteria（放線菌綱）相對豐度顯著高于N1處理，但是二者與N2處理均無顯著差異。3個處理其他菌綱之間均無顯著差異。故減氮顯著降低了nirS型反硝化細菌Deltaproteobacteria相對豐度，但對其他菌綱無顯著影響。由圖3（b）可知，3個處理nirK反硝化細菌相對豐度較高的優(yōu)勢菌綱分別為Alphap-roteobacteria、Gammaproteobacteria、Betaproteobacte-na、Actinobacteria、Vicinamibacteria，5個菌綱累計占比為97.14%-98.75%。其中，3個處理nirK反硝化細菌主要以Alphaproteobacteria為主，其占比為90.82%-97.66%，但3個處理之間無顯著差異。僅CK的Therm-omicrobia顯著高于N1、N2處理，但是N1、N2處理之間差異不顯著。故減氮對nirK型反硝化細菌綱水平物種組成無顯著影響。

圖4為各處理耕層土壤反硝化細菌優(yōu)勢菌屬相對豐度。由圖4（a）可知，3個處理nirS反硝化細菌主要優(yōu)勢菌屬為P.seudomona.s（假單胞菌屬）、Cupriavi-du.s（貪銅菌屬）、Pulveribacter、Thauera（陶厄氏菌屬）、Azospira（固氮螺菌屬），其相對豐度分別為7.43%-10.26%、7.36%-11.41%、1.07%-4.12%、2.05%-4.48%、2.07%-2.66%，其中N1、N2處理的Pulverib-acter屬相對豐度顯著高于CK，但是N1、N2處理之間無顯著差異。N2處理的Thauera相對豐度顯著高于N1、CK，但是N1處理與CK之間無顯著差異；各處理其他主要菌屬均無顯著差異。3個處理的屬相對豐度差異均顯著，且表現(xiàn)為N2處理gt;N1處理gt;CK。N2、N1處理的Rubrivivax（紅長命菌屬）相對豐度顯著高于CK，但是N2與N1處理之間無顯著差異。CK的Azoarcus（固氮弧菌屬）顯著高于N2、N1處理，但N1處理與N2處理之間無顯著差異。CK、N1處理的Azo.spira顯著高于N2處理，但是CK與N1處理之間無顯著差異。N2處理、CK的Ahniella屬、Rhodobacter（紅細菌屬）相對豐度顯著高于N1處理，但是N2處理與CK無顯著差異。N2處理的Aromatoleum屬相對豐度顯著高于CK、N1處理，但是CK與N1處理無顯著差異。N2處理的Herba.spirillum（草螺菌屬）相對豐度顯著高于N1處理，但是二者均與CK無顯著差異。N1處理的Zoogloea屬顯著高于N2處理和CK，但N2處理與CK差異不顯著。CK的Paracoccu.s（副球菌屬）相對豐度顯著高于N1處理，但二者與N2處理差異均不顯著。故減氮顯著降低了nirS反硝化細菌相對豐度，但是顯著提高了Azo-spLra、Zoogloea屬相對豐度。

由圖4（b）可知，3個處理nirK反硝化細菌主要優(yōu)勢菌屬為Mesorhizobium（中生根瘤菌屬）、Sinorhizobi-um（中華根瘤菌屬）、Rhodopseudomonas（紅假單胞菌屬）、Agrobacterium（土壤桿菌屬）、Bradyrhizobium（慢生根瘤菌屬）、Rhizobium（根瘤菌屬），其相對豐度分別為26.39%-29.03%、24.51%-36.29%、3.56%-7.46%、1.29%-7.38%、5.89%-7.49%、4.19%-6.71%，且3個處理的主要優(yōu)勢菌屬差異均不顯著。N2處理的Ensifer（劍菌屬）相對豐度顯著高于N1、CK，但是N1處理與CK之間無顯著差異；N1、N2處理的Devosia（戴沃斯菌屬）相對豐度顯著高于CK，但是N1、N2處理之間無顯著差異。N1處理的Aminobacter（氨基桿菌屬）顯著高于CK、N2處理，但CK與N2處理差異不顯著。CK的Defluviimonas（污物球菌屬）相對豐度顯著高于N2、N1處理，但N2處理與N1處理差異不顯著。N1處理的Paracoccus（副球菌屬）顯著高于N2處理、CK，但N2處理與CK差異不顯著。N2處理的Pseudomo-nas（假單胞菌屬）相對豐度顯著高于CK、N1，但是CK與N1處理之間差異不顯著。故減氮顯著降低了nirK反硝化細菌Ensifer（劍菌屬）、Pseudomonas相對豐度，但是顯著提高了Aminobacter的相對豐度。

2.5基于braV-curtis距離的反硝化細菌群落PcoA分析

由圖5（a）可知，第一主軸和第二主軸分別解釋了nirS反硝化細菌群落結構差異的32.86%、24.11%，CK、N2處理4個重復樣本點之間距離較小，說明樣本重復性較好，N1處理樣本點之間距離較大，說明N1處理重復性略差。3個處理樣本點距離均較遠，說明3個處理nirS反硝化細菌群落結構差異均較大，Anosim分析表明，CK、N1、N2處理的nirS反硝化細菌群落結構差異顯著（Plt;0.05）。由圖5（b）可知，第一主軸和第二主軸分別解釋了nirK反硝化細菌群落結構差異的25.61%、18.94%，CK的4個重復樣本點之間距離較小，說明樣本重復性較好，N1、N2處理樣本點之間距離較大，說明N1處理重復性略差。Anosim分析表明，CK、N1、N2處理的nirK反硝化細菌群落結構差異顯著（Plt;0.05）。綜上可知，減氮顯著影響nirS、nirK反硝化細菌群落結構。

2.6反硝化細菌與土壤環(huán)境因素冗余分析

圖6為麥玉輪作農(nóng)田耕層土壤反硝化細菌top10菌屬與土壤環(huán)境因子的RDA分析，圖6中SOC代表有機質，AN代表銨態(tài)氮，NN代表硝態(tài)氮，AK代表速效鉀，AP代表速效磷，TN代表全氮，TP代表全磷。由圖6（a）可知，第一軸、第二軸分別解釋了nirS型反硝化細菌群落變異程度的32.51%、25.93%，合計58.44%。與第一主軸正相關的土壤環(huán)境因子由大到小依次為銨態(tài)氮、全磷、速效磷、硝態(tài)氮、全氮，與第一主軸負相關由大到小依次為速效鉀、有機質、EC值、pH值；與第二主軸正相關的土壤環(huán)境因子由大到小依次為EC值、速效磷、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、全磷、有機質、全氮，與第二主軸負相關由大到小依次為速效鉀、pH值。相關分析表明，硝態(tài)氮（Plt;0.01）、速效磷（Plt;0.01）、pH值（Plt;0.01）對土壤nirS反硝化細菌組成影響顯著。圖7為麥玉輪作農(nóng)田耕層土壤反硝化細菌top10菌屬與土壤環(huán)境因子Spearman相關分析結果，由圖7（a）可知，硝態(tài)氮與高度正相關，與unidentified高度負相關；pH值與高度負相關，與un-identified高度正相關。

由圖6（b）可知，第一軸、第二軸分別解釋了nirK型反硝化細菌群落變異程度的56.44%、20.76%，合計77.20%，與第一主軸正相關的土壤環(huán)境因子由大到小依次為全磷、硝態(tài)氮、速效磷、全氮、EC值、有機質、銨態(tài)氮，與第一主軸負相關由大到小依次為pH值、速效鉀；與第二主軸正相關的土壤環(huán)境因子由大到小依次為pH、速效鉀、銨態(tài)氮、全磷，與第二主軸負相關由大到小依次為全氮、EC值、速效磷、有機質、硝態(tài)氮。相關分析表明，pH值（Plt;0.01）對土壤nirK反硝化細菌組成影響顯著。由圖7（b）可知，pH值與Ensifer高度負相關，與Agrobacterium高度正相關。

3討論

3.1減氮對nirS、nirK反硝化細菌多樣性和群落組成的影響

土壤細菌多樣性是指土壤生態(tài)系統(tǒng)的微生物種類、數(shù)量及其與環(huán)境因子之間相互作用的多樣化程度，其種類、豐度與土壤肥力密切相關，豐富的細菌種類和多樣性代表土壤內(nèi)較為活躍的生理代謝活動。本研究表明，3個處理中nirS反硝化細菌OTUs數(shù)高于nirK，且nirS反硝化細菌a-多樣性指數(shù)高于nirK，表明nirS反硝化細菌在堿性麥玉輪作農(nóng)田土壤種類更豐富，這與Chen等研究結果一致，但與喻江等研究結果不一致，這可能是由土壤環(huán)境因子不同造成的，本研究中土壤pH值偏堿性，而喻江等研究中土壤pH值為5.35-6.65，土壤偏酸性，且本研究中土壤銨態(tài)氮量遠低于喻江等研究中土壤銨態(tài)氮量。另外，本研究表明，減氮對土壤反硝化細菌a-多樣性指數(shù)無顯著影響。這與Yang等研究結果不一致，這主要是因為其設計的氮肥梯度較大，導致不同施氮量處理土壤環(huán)境因子差異較大，反硝化細菌多樣性隨施氮量的增加而降低。故適量減氮不影響堿性麥玉輪作農(nóng)田土壤反硝化細菌a-多樣性指數(shù)。

土壤細菌群落組成受土壤pH值、土壤類型、土壤含水率、植被類型、土壤養(yǎng)分含量和土壤有機質含量等因素綜合影響。本研究表明，nirS、nirK反硝化細菌主要以Proteobacteria為主，這與前人研究結果一致。另外，減氮對nirS、nirK門水平、nirK綱水平物種組成無顯著影響，但顯著降低了nirS型反硝化細菌Deltaproteobacteria相對豐度；這表明nirS反硝化細菌Deltaproteobacteria可能對減氮響應更敏感。減氮對nirS、nirK屬水平物種組成的影響差異較大，這可能是因為nirS、nirK反硝化細菌屬水平群落具有較高的多樣性和生態(tài)功能。部分nirS、nirK型反硝化菌屬可能對減氮更為敏感，因此減氮后它們在環(huán)境中的豐度可能減少；而其他部分nirS型反硝化菌屬可能具有更高的耐受性和適應性，它們的豐度在減氮后可能相對穩(wěn)定甚至增加。因此，減氮顯著影響反硝化細菌屬水平的物種組成。

3.2減氮對nirS、nirK反硝化細菌群落結構影響機制

施氮量對nirS和nirK反硝化細菌群落結構的影響是復雜的，主要與硝態(tài)氮濃度、C/N、溶解氧濃度、土壤pH值等因素有關。本研究表明，減氮顯著降低了土壤全氮量，但減氮顯著增加了土壤pH值，這與前人研究結果一致，即長期使用化肥或者施氮量高會導致土壤pH值降低。本研究表明，減氮顯著影響nirS、nirK反硝化細菌屬水平群落組成，因此，nirS、nirK反硝化細菌屬水平物種組成對減氮響應較為敏感，適量減氮增加了土壤有機質量、速效磷量、pH值、電導率、銨態(tài)氮量，降低了土壤硝態(tài)氮量、速效鉀量、全氮量、全磷量，土壤環(huán)境因子變化影響了nirS、nirK反硝化細菌活性，改變了nirS、nirK反硝化細菌群落組成；冗余分析表明，硝態(tài)氮、速效磷、pH值是影響3個處理土壤nirS反硝化細菌群落結構的主要環(huán)境因子，pH值是影響3個處理土壤nirK反硝化細菌群落結構的主要環(huán)境因子。結合表2可知，減氮并未顯著影響土壤硝態(tài)氮量和速效磷量，但減氮導致土壤pH值顯著增加，故減氮主要是通過pH值影響nirS、nirK反硝化細菌屬水平群落結構，這與Wang等的研究結果一致；結合相關分析表明，減氮導致土壤pH值增加，顯著降低了nirS反硝化細菌相對豐度；同時，顯著降低了nirK反硝化細菌Ensifer相對豐度，但顯著提高了nirK反硝化細菌Agrobacterium相對豐度，這表明nirS反硝化細菌Sulfurifastis、Thauera，nirK反硝化細菌Ensifer、Agro-bacterium對減氮響應比較敏感，是導致反硝化細菌屬水平群落結構變化的主要菌屬。減氮還會影響土壤酶活性和土壤物理性狀，但本文僅分析了土壤化學性質對反硝化細菌群落結構影響機制，關于減氮對土壤反硝化細菌群落結構影響的具體路徑有待在后續(xù)研究中開展。

4結論

（1）3個處理nirS、nirK反硝化細菌a一多樣性指數(shù)無顯著差異，nirS反硝化細菌a-多樣性高于nirK。減氮增加了nirK反硝化細菌OTUs數(shù)，但降低了nirS反硝化細菌OTUs數(shù)。

（2）減氮對nirS、nirK反硝化細菌門水平物種組成無顯著影響，但顯著降低了nirS反硝化細菌Delta-proteobacteria（8一變形菌綱）相對豐度，但對nirK反硝化細菌綱水平物種組成無顯著影響；減氮顯著影響nirS、nirK屬水平群落組成。

（3）硝態(tài)氮、速效磷、pH值是影響土壤nirS反硝化細菌屬水平群落結構的主要環(huán)境因子；pH值是影響土壤nirK反硝化細菌屬水平群落結構的主要環(huán)境因子。減氮主要是通過增加土壤pH值影響nirS、nirK反硝化細菌群落結構。