纖維素降解菌的篩選、鑒定及其秸稈降解效果

摘要：為加速畜禽糞便和農作物秸稈的快速腐熟，篩選高效纖維素降解菌，為研制適宜寧夏本土堆肥發(fā)酵的有機物料腐熟劑奠定基礎。試驗從寧夏不同區(qū)域牛羊糞堆肥、溝渠、林土采集樣品，通過對樣品中纖維素降解菌的富集、分離、純化，經(jīng)剛果紅染色、纖維素酶活性測定、濾紙條降解及水稻秸稈降解試驗，篩選出本土纖維素降解菌并鑒定。結果表明，經(jīng)過分離篩選得到3株效果最好的菌株，分別命名為X-32、HX-5、G3，纖維素酶活性分別為111.46、74.12和66.23 U/mL。其中，菌株X-32能使濾紙條在60 h內完全降解，通過水稻秸稈降解試驗表明發(fā)酵21 d時，各個菌株對水稻的降解率均顯著高于CK，其中，X-32、HX-5、G3菌株對水稻降解率分別為48.26%、43.01%、23.33%。對2株優(yōu)勢降解菌株X-32、HX-5進行分子生物學鑒定，確定X-32菌株為Paenibacillus polymyxa（多黏類芽孢桿菌），HX-5菌株為Bacillus velezensis（貝萊斯芽孢桿菌），可用于適宜寧夏本土有機物料腐熟劑開發(fā)。

關鍵詞：纖維素降解菌；酶活性；秸稈；堆肥

中圖分類號：S182 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）18-0277-07

收稿日期：2023-07-21

基金項目：寧夏自然科學基金（編號：2022AAC03450）；自治區(qū)農業(yè)科技自主創(chuàng)新專項（編號：NKYJ-22-02）；寧夏回族自治區(qū)農業(yè)高質量發(fā)展和生態(tài)保護科技創(chuàng)新示范項目（編號：NGSB-2021-11-07）。

作者簡介：司海麗（1988—），女，寧夏銀川人，碩士，農藝師，主要從事農業(yè)微生物篩選與應用方面的研究。E-mail：sihaili_0427@163.com。

通信作者：紀立東，博士，副研究員，主要從事農業(yè)廢棄物利用與新型肥料研發(fā)方面的研究。E-mail：jili521010@163.com。

近年來，寧夏回族自治區(qū)畜禽養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，寧夏已成為我國重要的優(yōu)勢畜牧業(yè)生產(chǎn)基地。2020年，寧夏畜禽存欄總量達2 044.4萬頭（萬只、萬羽），折合豬當量1 158.0萬頭（測算依據(jù)《畜禽糞污土地承載力測算技術指南》^［1］），與“十二五末”相比，增加了325.3萬頭?？焖僭黾拥男笄蒺B(yǎng)殖給生態(tài)環(huán)境帶來了嚴重污染，寧夏畜禽養(yǎng)殖污染物產(chǎn)生量和排放量分別占農業(yè)源污染的99.1%和88.3%^［2-3］。“十四五”期間，寧夏畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)能進一步提升，預計在“十四五”末，寧夏奶牛養(yǎng)殖量要達到110萬頭。因此，畜禽糞便產(chǎn)生量將持續(xù)增加，勢必對生態(tài)環(huán)境安全構成極大威脅。

高溫好氧堆肥是畜禽糞便肥料化利用的重要方式。堆肥是在一定條件下，通過微生物的發(fā)酵作用，將有機固體廢棄物轉變成有機肥料的生物化學處理過程^［4］。堆肥過程中的物質轉化主要是由不穩(wěn)定的有機物質向穩(wěn)定的無機物質或有機物質-腐殖質轉化的過程。但纖維素作為糞便的主要成分，在畜禽糞便中結構復雜、含量豐富、微生物降解效果受限，嚴重阻礙堆肥化進程^［5］，因此如何加速纖維素的降解是提高堆肥效率的關鍵。微生物作為堆肥過程的工作主體，其代謝活動直接影響物質轉化速率，而且微生物對木質纖維素的降解效果也是堆肥充分腐熟的關鍵^［6-7］，因此，篩選適宜的纖維素降解菌用于堆肥快速高效發(fā)酵十分必要。纖維素降解菌在自然環(huán)境中分布廣泛，主要有真菌、細菌和假單胞菌、鏈霉菌等放線菌^［8］。真菌具有很強的產(chǎn)纖維素酶的能力^［9］，而細菌對環(huán)境適應性更強，生長較快，能夠產(chǎn)生特異性更高的多酶復合物^［10］。Liu等從堆肥中篩選到1株纖維素分解真菌Aspergillus fumigatus Z5，最適分解溫度為50 ℃，能夠分泌完整的纖維素酶系，對玉米秸稈的降解效果比較明顯^［11］。江高飛等研究了在55～65 ℃和75 ℃條件下依舊能夠在高溫好氧堆肥中保持高度熱穩(wěn)定性并降解纖維素的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus） B-7和Geobacillus stearo-thermophilusB-11^［12］；吳翔等從稻草堆肥高溫期中分離到1株可在45 ℃下高效降解纖維素的放線菌（Streptomyces sp.）CN9^［13］。張必周等篩選出能夠在低溫條件下高效降解纖維素的復配菌，在15 ℃模擬環(huán)境培養(yǎng)下濾紙酶活性（FPA）為32.96 U/mL^［14］，因此，開展高效纖維素降解菌篩選及應用潛力巨大。

高效纖維素降解菌的篩選已成為有機固體廢棄物高效腐解的新途徑之一^［15］。但由于寧夏畜禽養(yǎng)殖結構及飼料供給的差異，畜禽糞便纖維含量及糞便的理化性狀和寧夏區(qū)外會有很大區(qū)別，而常用的有機物料腐熟劑多是從寧夏區(qū)外采購而來，這些菌劑是否適應寧夏的氣候特點，能否在堆肥發(fā)酵中發(fā)揮作用就不得而知。因此，針對寧夏特殊的生態(tài)環(huán)境，從寧夏本地篩選出適宜本土的高效纖維素降解菌，為開發(fā)有機物料腐熟菌劑十分必要。本研究以寧夏不同區(qū)域牛羊糞堆肥、溝渠、林土為分離纖維素降解菌的樣品，通過對樣品中纖維素降解菌的富集、分離、純化，經(jīng)剛果紅染色、纖維素酶活性測定、濾紙條崩解及水稻秸稈降解試驗，篩選出適宜本土生長的纖維素降解菌并鑒定，以期為開發(fā)本土高效纖維素降解菌劑的優(yōu)質菌源提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2022年3月至12月在寧夏農林科學院農業(yè)資源與環(huán)境研究所微生物實驗室開展。

土壤樣品：采集寧夏銀川市掌政鎮(zhèn)日光溫室菜園土壤，平羅、永寧、吳忠等地區(qū)玉米地土壤、溝渠、樹林、農田等富含纖維素較高的土壤樣品各約1 kg，用自封袋裝好并做好標記后放置4 ℃冰箱備用，樣品采集完7 d之內完成纖維素降解菌的分離。

堆肥樣品：采集平羅縣寶豐鎮(zhèn)牛糞堆肥發(fā)酵高溫期堆肥樣品及吳忠市利原村牛羊糞便堆肥發(fā)酵高溫期堆肥樣品各約1 kg，用自封袋裝好并做好標記后放置4 ℃冰箱備用，樣品采集完7 d之內完成纖維素降解菌的富集。

腐爛秸稈樣品：采集平羅縣寶豐鎮(zhèn)，并置4 ℃冰箱備用，樣品采集完7 d之內完成纖維素降解菌的富集。

完好秸稈樣品：水稻秸稈采自寧夏銀川市永寧縣望洪基地。將水稻表面的灰塵清洗干凈，晾干，剪成2 cm的小段，121 ℃滅菌30 min備用。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

（1）富集培養(yǎng)基：KH₂PO₄ 0.34 g、K₂HPO₄1.20 g、MgSO₄·7H₂O 0.25 g、NH₄NO₃ 0.60 g、CMC-Na10.00 g、CaCl₂·2H₂O 0.07 g、MnSO₄·H₂O 0.025 mg。

（2）CMC-Na篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g、酵母膏1 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0～7.5。

（3）CMC-Na鑒別培養(yǎng)基：CMC-Na 5.5 g、NH₄NO₃ 0.6 g、MgSO₄·7H₂O 0.2 g、KH₂PO₄0.34 g、酵母提取物0.5 g、NaCl 0.5 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.2～7.4。

（4）濾紙條崩解培養(yǎng)基：（NH₄）₂SO₄ 1.0 g、MgSO₄·7H₂O 0.5 g、KaHPO₄ 1.0 g、酵母膏0.1 g、濾紙條（1 cm×6 cm）3條/三角瓶（500 mL）、蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0～7.2。

（5）產(chǎn)酶培養(yǎng)基：（NH₄）SO₄ 2.0 g、KH₂PO₄3.0 g、CaCl₂ 0.5 g、MgSO₄ 0.5 g、CoCl₂ 3.0 mg、FeSO₄·7H₂O 7.5 mg、ZnSO₄·7H₂O 2.0 mg、MnSO₄Wm9N+Z+1kQ0L2tGPuQPYNBr+ivn7JwmeC11kMLcbLfY=·H₂O2.5 mg、蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌20 min后使用。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的富集培養(yǎng)

將取回來的土壤、堆肥、腐爛秸稈等樣品混勻后分別稱取100 g于1 000 mL磷酸緩沖液中，每個樣品中滴加吐溫-80 4滴，采用玻璃棒充分攪勻后去掉液體中明顯的雜質，通過2 000 r/min離心5 min后保留上清液，上清液再通過8 000 r/min離心10 min后保留離心管底部菌體，將菌體用無菌磷酸緩沖液洗下后放置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。分別量取備用菌液10 mL于250 mL富集培養(yǎng)基中，30 ℃ 180 r/min振蕩恒溫培養(yǎng)7～10 d。

1.3.2 纖維素降解菌初篩

將富集菌液采用無菌水稀釋至10^-3、10^-4倍，各吸取0.1 mL均勻涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，置30 ℃倒置培養(yǎng)約7 d，觀察并記錄菌落生長情況。挑取不同形態(tài)菌落，接種斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后于4 ℃低溫保存。

1.3.3 纖維素降解菌復篩

將初篩分離菌株活化后，點種法接種于鑒別培養(yǎng)基上，每株菌進行2個重復，在30 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2～3 d，采用0.1%剛果紅染色15 min后，再用1 mol/L NaCI溶液進行脫色，通過透明圈D_c值的大?。―_c-水解圈直徑（D，cm）/菌落直徑（d，cm），初步判斷菌株的纖維素降解能力。初選得到的菌株標記保存，用于后期試驗。

1.3.4 濾紙條崩解試驗

將酶活性試驗確定的優(yōu)勢菌株分別接種在牛肉蛋白陳培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后制備菌懸液。每種菌液分別取1 mL接種于盛有100 mL無菌濾紙條崩解培養(yǎng)基的三角瓶中，并放入3條1 cm×6 cm的無菌waterman #1濾紙條。28 ℃、100 r/min培養(yǎng)，定期觀察濾紙條崩解情況。每個菌株3次重復。根據(jù)濾紙條崩解程度初步判斷菌株降解纖維素能力?！?”表示濾紙邊緣己膨脹、“++”表示濾紙整體膨脹并己下彎、“+++”表示濾紙呈不定塊狀、“++++”表示濾紙呈糊狀。

1.3.5 纖維素酶活性測定

粗纖維素酶液的制備：以2%接種量接入濾紙條崩解能力較強菌株的菌懸液于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)7 d后，4 000 r/min離心10 min，上清液作為粗酶液。每個菌株3次重復。

纖維素酶活性單位定義：在50 ℃條件下，1 mL酶液于60 min內水解相應的底物，產(chǎn)出相當于1 mg葡萄糖的還原糖量，定義為1個酶活性單位，表示為U/mL。

CMC酶活性=Bn×測定前酶液定容體積（mL）/［0.5 mL×時間（h）］，式中：B表示從標準曲線中查得的凈葡萄糖量（mg）；n表示酶液稀釋倍數(shù)；0.5表示測定時吸取稀釋酶液量（mL）。

1.3.6 水稻秸稈降解試驗

將濾紙條崩解試驗確定的優(yōu)勢菌株懸液分別吸取1 mL接種至水稻秸稈為唯一碳源的培養(yǎng)基中，28 ℃、60 r/min培養(yǎng)7 d后，采用無菌水將不同處理中的秸稈殘渣全部清洗出來，然后65 ℃烘干至恒重并稱重。

計算秸稈相對降解率（RDE）：RDE=（W₀-W）/W₀×100%；

其中，W₀為對照秸稈殘渣干重，W為目標菌降解的秸稈殘渣干重。相對降解率高表示目標菌株降解水稻秸稈的效果好，每株菌3次重復。

1.3.7 優(yōu)勢菌株鑒定

提取優(yōu)勢菌株DNA，通過PCR擴增得到測序結果，將16S rDNA 基因序列于NCBI網(wǎng)站進行BLAST比對，并找出其同源序列，進行相似性分析。選相性>99.5%的序列在MEGA 11軟件基于Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌的初篩及菌落形態(tài)

通過樣品富集及平板篩選法，由表1、表2可知，篩選出不同形態(tài)及不同顏色的纖維素降解細菌共計132株，再經(jīng)過多次剛果紅染色篩選確定9株菌在CMC-Na平板上具有比較穩(wěn)定且明顯的降解圈，且D/d的值在2.5以上的菌株有5株，分別是JYX-1、HX-3、HX-5、G3、X-32（圖1）。降解圈直徑和菌落直徑比（D/d）從大到小依次為菌株HX-3、JYX-1、HX-5、G3、X-32，其中HX-3菌株染色試驗D/d值最高，為4.93，其次是JYX-1菌株，D/d值為3.30。D/d越大說明該菌株產(chǎn)生的纖維素酶活性越高，但不能完全表示菌株產(chǎn)纖維素酶的能力和降解纖維素的效果。

2.2 纖維素降解菌株酶活性測定

對初篩所得9株菌的纖維素酶活性的檢測結果見圖2，所檢測的9株菌的纖維素酶活性均>CK，其中，纖維素酶活性>50 U/mL的菌株有3株，分別是HX-5、G3、X-32；其中X-32菌株的纖維素酶活性最高，達到111.46 U/mL，顯著高于其他菌株，其次為HX-5菌株和G3菌株，纖維素酶活性分別為74.12、66.23 U/mL。

2.3 濾紙條降解試驗

將初篩選出具有降解纖維素效果的9株優(yōu)勢細菌進行濾紙條降解試驗，由表3可知，在28 h時，除CK和F3菌株處理下濾紙條呈彎曲狀，其他菌株處理下濾紙條均為不定狀，隨著時間推移至32 h時，9株菌處理下的濾紙條均呈現(xiàn)不定塊狀。但在培養(yǎng)60 h時，由圖3可知，X-32菌株在降解速度和效率上均高于其他菌株，濾紙條已經(jīng)完全分解為糊狀，因此，初步判斷X-32具有較強的纖維素分解能力。

2.4 水稻秸稈降解試驗

通過纖維素酶活性檢測篩選出3株優(yōu)勢菌株，分別為菌株HX-5、G3、X-32，研究優(yōu)勢菌株對水稻秸稈降解試驗結果。 由圖4可知，不同菌株對水稻秸稈的降解效果有明顯差異，降解率均高于CK。在培養(yǎng)7 d時，菌株HX-5和菌株X-32的降解率顯著高于CK和G3。待發(fā)酵21 d時，各處理均表現(xiàn)出明顯差異，且各菌株對水稻的降解率均顯著高于CK，其中，X-32>HX-5>G3，降解率分別為48.26%、43.01%、23.33%。不同菌株對水稻秸稈降解效果見圖5、圖6。

2.5 優(yōu)勢菌株的鑒定

將優(yōu)勢菌株X-32和HX-5送至北京睿博興科生物技術有限公司測序，所得測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，并找出其同源序列，進行相似性分析。選相似性最高的15個序列在MEGA 11軟件基于 Neighbor-Joining 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖7可知，X-32菌株與Paenibacillus polymyxa同源性最高，判定為多黏類芽孢桿菌。HX-5菌株與Bacillus velezensis同源性最高，判定為貝萊斯芽孢桿菌。

3 討論與結論

本研究從寧夏本地采集堆肥、土壤樣品，篩選得到2株高效降解秸稈的細菌，分別為多黏類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa）X-32 和貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）HX-5，其中X-32具有較高的纖維素酶活性，對濾紙條和水稻秸稈有明顯的降解效果，HX-5雖然也具有較強的纖維素降解能力，總體效果不及X-32，但是HX-5易培養(yǎng)，菌數(shù)較高，且和X-32不拮抗，可作為復合菌劑用于堆肥發(fā)酵。多黏類芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌均屬于芽孢桿菌科的革蘭氏陽性細菌，是自然界分布極廣的一類細菌，因其具有芽孢，能夠抵御外界有害因子，對溫度有很強的耐受性，并且適應能力較強^［16-17］，因此，廣泛應用于堆肥中，芽孢桿菌成為目前研究產(chǎn)纖維素酶微生物的一個重要方向^［18］。

多黏類芽孢桿菌是一類兼具生物防治和促生長作用的植物根際細菌，1993年由Ash等將其歸為類芽孢桿菌屬之前又名多黏芽孢桿菌^［19］，在農業(yè)、工業(yè)及醫(yī)藥等領域廣泛應用，并對人和動植物沒有致病性^［20-22］，但其在纖維素降解或堆肥發(fā)酵上的研究很少。程愛芳等對多黏類芽孢桿菌HD-1產(chǎn)纖維素酶活性進行測定發(fā)現(xiàn)其最大酶活性為88.3 U/mL^［23］，本研究測定X-32纖維素酶活性達111.46 U/mL，但發(fā)酵條件均需要進一步研究。纖維素作為自然界最廣泛的碳源，受到各國政府的高度重視，β-葡萄糖苷酶作為纖維素降解過程中的一個重要酶組分具有十分重要的研究價值，王艷等研究了1株多黏類芽孢桿菌β-葡萄糖苷酶2個亞基bglA和bglB在大腸桿菌C41中共表達后，其酶活性比單一酶組分及混合表達的酶活性提高了4倍^［24］，這研究結果為多黏類芽孢桿菌對纖維素降解及基因的共表達提供了試驗依據(jù)。本試驗雖然研究了X-32菌株對纖維素酶活性及秸稈的直接降解，但關于β-葡萄糖苷酶的研究還有欠缺，需在今后的試驗中繼續(xù)研究，有望開發(fā)一款具有生防、促生的有機物料腐熟劑。

貝萊斯芽孢桿菌2005年被首次報道，是芽孢桿菌屬的一個新種^［25］，能夠產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物，并且具有潛在的抑菌活性和促進植物生長的作用，在植物病害的生物防治方面被廣泛應用^［26-27］，關于貝萊斯芽孢桿菌對纖維素降解的研究鮮有報道。余梅霞等研究1株FIB-3的貝萊斯芽孢桿菌在培養(yǎng)5 d時濾紙酶活性達最高8.436 U/mL^［28］，但沒有更深一步研究對秸稈降解或堆肥發(fā)酵的效果。Bafana等報道B. velezensis AB具有對偶氮染料Direct Red 28（DR28）的脫色能力^［29］，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其具有染料解毒活性和偶氮還原酶（60 ku）活性。陳龍等研究一株貝萊斯芽孢桿菌157 CMCase具有產(chǎn)酶量高，耐受pH值范圍廣的特點^［30］，可在洗滌劑、飼料添加劑、造紙領域中應用，但該研究沒有對纖維素酶活性、濾紙及秸稈降解效果進行研究。本研究中篩選到的貝萊斯芽孢桿菌HX-5纖維素酶活性為74.12 U/mL，對濾紙條和水稻秸稈有明顯的降解能力，在發(fā)酵21 d時對水稻秸稈的降解率達43.01%，但其代謝途徑尚不清楚，今后應需在CMCase酶活性、次級代謝產(chǎn)物上加強研究，為研發(fā)功能生物有機肥提供菌源支撐。

從不同土壤樣本及糞便發(fā)酵樣中分離篩選得到3株效果最好的菌株，分別是X-32、HX-5、G3，纖維素酶活性分別為111.46、74.12、66.23 U/mL。

以篩選所得最佳菌株X-32、HX-5、G3為目標菌株開展濾紙條降解試驗和水稻秸稈降解試驗，菌株X-32在培養(yǎng)60 h可將濾紙條完全崩解，待秸稈發(fā)酵21 d時，各個菌株對水稻的降解率均顯著高于CK，其中，X-32、HX-5、G3菌株對水稻降解率分別為48.26%、43.01%、23.33%。

對優(yōu)勢菌株X-32、HX-5進行分子生物學鑒定，確定X-32菌株為多黏類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa），HX-5菌株為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），具有堆肥發(fā)酵有機物料腐熟劑的研究潛力。

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