火焰處理對(duì)巫山植煙土壤微生物多樣性及代謝特征的影響

摘要：通過火焰消毒機(jī)械在旋耕的過程中利用燃燒燃料的方式把深度15 cm土壤旋起來(lái)與400 ℃的火焰直接接觸且維持2～3 s，以探明火焰處理對(duì)巫山植煙土壤微生物多樣性及代謝特征的影響。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共設(shè)置3個(gè)處理：CK為對(duì)照，不對(duì)土壤作任何處理；T1處理為火焰處理1次；T2處理為火焰處理連續(xù)2次；重復(fù)6次。結(jié)果表明：（1）各樣本間細(xì)菌和真菌特有ASV（amplicon sequence variant）個(gè)數(shù)均具有明顯差異；（2）與對(duì)照相比，火焰處理對(duì)土壤細(xì)菌和真菌的豐度和多樣性影響均不顯著，但隨著火焰處理次數(shù)的增加樣本會(huì)出現(xiàn)分離；（3）T1處理增加了變形菌門細(xì)菌、鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌和擔(dān)子菌門、壺菌門、球囊菌門、白環(huán)蘑屬、粗糙孔菌屬及斜蓋傘屬真菌的相對(duì)豐度，降低了酸桿菌門細(xì)菌和子囊菌門、被孢霉門真菌及被孢霉屬、腐質(zhì)霉屬、小脆柄菇屬真菌的相對(duì)豐度；（4）T2處理增加了擬桿菌門細(xì)菌、黃桿菌屬細(xì)菌和子囊菌門、擔(dān)子菌門、壺菌門及白環(huán)蘑屬、Echria屬、奈瑟氏菌屬真菌的相對(duì)豐度，降低了芽單胞菌門細(xì)菌、被孢霉門真菌和被孢霉屬、鐮刀菌屬、小脆柄菇屬真菌的相對(duì)豐度；（5）不同處理土壤細(xì)菌在目水平到屬水平上，分別有5、8、14組差異物種出現(xiàn)顯著差異（P<0.05），不同處理土壤真菌在綱水平到屬水平上，分別有1、1、3、3組差異物種出現(xiàn)顯著差異（P<0.05）；（6）T2處理土壤伯克氏菌屬、黏菌屬、全噬菌屬細(xì)菌相對(duì)豐度較高或顯著較高，T1處理和T2處理土壤真菌重要性前2的附球菌屬、裂殼菌屬的相對(duì)豐度均較高，其中T2處理均顯著較高（P<0.05）；（7）T1 vs. CK、T2 vs. CK、T2 vs. T1比對(duì)組的差異代謝物分別有77、52、33種；（8）T1 vs. CK 的比對(duì)組中有4種顯著差異代謝物及7條顯著差異代謝通路，T2 vs. CK、T2 vs. T1和T2 vs. T1 vs. CK 的比對(duì)組中均有6種顯著差異代謝物，顯著差異代謝通路分別有19、15、17條。綜合而言，火焰處理能顯著影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成、差異物種和物種重要性，同時(shí)隨著火焰處理次數(shù)的增加差異代謝物數(shù)量減少，而顯著差異代謝物數(shù)量及代謝通路條數(shù)增加。

關(guān)鍵詞：火焰處理；微生物群落結(jié)構(gòu)；差異物種；差異代謝物；代謝通路

中圖分類號(hào)：S572.04；S572.061 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）18-0232-19

收稿日期：2023-11-13

基金項(xiàng)目：中國(guó)煙草總公司重慶市公司科技計(jì)劃（編號(hào)：B2021NY1309）。

作者簡(jiǎn)介：劉建軍（1986—），男，重慶巫山人，碩士，農(nóng)藝師，主要從事煙草栽培工作。E-mail：ljjun86@163.com。

通信作者：薛 剛，博士，講師，主要從事煙草栽培、烘烤及分級(jí)工作。E-mail：xuegangyan2009@sina.corn。

巫山作為全國(guó)烤煙八大香型之一醇甜香的代表產(chǎn)地、全國(guó)核心產(chǎn)區(qū)，巫山烤煙入選《中國(guó)大百科全書》第2版網(wǎng)絡(luò)版中國(guó)原產(chǎn)地物產(chǎn)目錄。而由于巫山地形復(fù)雜，土地資源有限，烤煙常年連作加之施肥、種植制度、耕作模式等不合理，導(dǎo)致煙田土壤板結(jié)、酸化，土傳病害嚴(yán)重，特別是青枯病和黑脛病，進(jìn)而導(dǎo)致煙葉生長(zhǎng)發(fā)育受到限制，尤其是在烤煙后期上部葉采烤時(shí)發(fā)生嚴(yán)重，葉片枯萎，為減低煙農(nóng)損失，采取上部葉搶采的緊急措施，但由于葉片成熟不夠，烤后煙葉易烤青、掛灰，影響煙葉品質(zhì)，同時(shí)，產(chǎn)量降低，煙農(nóng)收入減少，限制了巫山地區(qū)煙草產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)與生態(tài)環(huán)境和土壤相關(guān)，同時(shí)還受土壤微生物和土壤代謝物的影響。土bd218bdb3f51f775948dccc2ccd249c836c6da1eb3c55ab8822511c8a8390246壤的重要組成包括微生物^［1-5］，它是土壤中最活躍的份子^［6］，土壤微生物群落的組成和相對(duì)豐度對(duì)土壤中有機(jī)殘?bào)w及有機(jī)質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化起著積極的作用。土壤中同時(shí)存在有益和有害微生物，它們相互影響，當(dāng)土壤有益微生物相對(duì)豐度降低處于閾值以下時(shí)，作物生長(zhǎng)受到影響。因此，前人對(duì)土壤消毒進(jìn)行了大量研究。目前廣泛采用的土壤消毒技術(shù)有生物方法^［7-12］、化學(xué)方法^［13-21］和物理方法^［22-29］。其中物理消毒技術(shù)對(duì)土壤生態(tài)破壞最小，同時(shí)減少農(nóng)藥的施用，有利于降低作物農(nóng)殘，對(duì)環(huán)境和食品安全有顯著優(yōu)勢(shì)。其中火焰燃燒和我國(guó)焚燒秸稈效果相似，都是通過物理燃燒釋放大量的熱，將田間土壤中的有害微生物、草籽、害蟲和揮發(fā)性有害物質(zhì)消除，達(dá)到土壤生態(tài)重構(gòu)的目的，以適應(yīng)煙草種植。

煙草連作致使土傳病害發(fā)生，一方面是因?yàn)檫B作導(dǎo)致土壤病原菌大量富集，使其相對(duì)豐度顯著升高，另一方面是因?yàn)檫B作導(dǎo)致土壤代謝物異常，使其化感自毒作用發(fā)揮主要作用。有機(jī)酸、直鏈醇、酚酸、萜類和生物堿等代謝物多數(shù)屬于自毒物質(zhì)^［30］，其中萜類和酚酸類物質(zhì)是導(dǎo)致土壤化感自毒作用的關(guān)鍵代謝物^［31］。作物長(zhǎng)期連作后土壤代謝物苯甲酸、羥基苯甲酸和肉桂酸等酚酸類物質(zhì)與土壤微生物互作而不斷富集，嚴(yán)重影響土壤有機(jī)質(zhì)的分解礦化^［32-35］，導(dǎo)致化感自毒作用加劇。

為緩解連作對(duì)烤煙產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，前人通過生物方法和化學(xué)方法研究較多，但對(duì)于物理方法的火焰處理鮮有報(bào)道?；鹧嫣幚碓谖覈?guó)的芹菜^［36］、水稻^［37］、黃瓜^［38］、草莓^［39］、甘薯^［40］等作物已有應(yīng)用?；鹧嫣幚硎峭ㄟ^高溫使生物蛋白質(zhì)發(fā)生變性，進(jìn)而致使生物細(xì)胞失活，最終導(dǎo)致生物死亡。因此，火焰處理可為煙草綠色優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。本試驗(yàn)通過火焰處理研究其對(duì)巫山植煙土壤微生物多樣性和代謝特征的影響，為減輕巫山土傳病害和烤煙優(yōu)質(zhì)綠色生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2023 年4月16日在重慶市巫山縣三溪鄉(xiāng)月池村開展。試驗(yàn)地位于110.14°E、31.15°N，海拔977 m，地貌地形為山地平地，土壤為黃壤土，耕層深度為30 cm，煙草連作年限16年。試驗(yàn)田集中連片、肥力中等，土壤pH值為6.6，有機(jī)質(zhì)含量為19.40 g/kg，全氮含量為1.38 g/kg，堿解氮含量為85.80 mg/kg，有效磷含量為 16.00 mg/kg，速效鉀含量為208.00 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)材料

火焰消毒機(jī)械（實(shí)用新型專利：一種土壤高溫消毒裝置，專利號(hào)：ZL202222878061.0）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共設(shè)置3個(gè)處理：CK，作為對(duì)照，不對(duì)土壤作任何處理；T1處理，火焰處理1次；T2處理，火焰處理連續(xù)2次。重復(fù)6次，每重復(fù)3行，每行面積為20.70 m²。

火焰消毒機(jī)械在旋耕的過程中利用燃燒燃料的方式把深度15 cm土壤旋起來(lái)與400 ℃的火焰直接接觸且維持2～3 s。

1.4 土壤樣品的采集與處理

火焰消毒機(jī)械處理后30 min時(shí)取土樣。每個(gè)處理取6個(gè)點(diǎn)，用取土器取15 cm土層土壤樣品，過 0.85 mm孔徑的篩，取 5 g土壤裝入10 mL離心管，并立即放入盛有20 kg干冰的干冰桶中，并于當(dāng)天郵寄到上海歐易生物科技有限公司和上海鹿明生物科技有限公司，分別測(cè)定土壤微生物和土壤代謝物，公司收到土壤樣品時(shí)，干冰有大量剩余，土壤中微生物不受后續(xù)檢測(cè)影響。

1.5 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.5.1 土壤微生物群落高通量測(cè)序

采用16S進(jìn)行細(xì)菌測(cè)序，測(cè)序區(qū)域?yàn)?6S V3～V4區(qū)，343F-798R為測(cè)序引物^［41］；采用ITS進(jìn)行真菌測(cè)序，測(cè)序區(qū)域?yàn)镮TS1區(qū)，ITS1F-ITS2R作為測(cè)序引物^［42］。

1.5.2 非靶向代謝組學(xué)測(cè)定土壤代謝物

采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）對(duì)土壤生物進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)研究。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 8.505448fee051e56138dfbefd1fe15162c、QIIME2 2020.11、PyNAST 0.1、R 3.5.1、PICRUSt 2 2.3.0b0、KronaTools 2.7.1、LEfSe 1.0.0等軟件進(jìn)行土壤微生物的聚類分析、多樣性分析、NMDS分析、差異分析和隨機(jī)森林分析并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 火焰處理對(duì)植煙土壤微生物的影響

2.1.1 火焰處理對(duì)土壤微生物測(cè)序數(shù)據(jù)和ASV聚類分析的影響

統(tǒng)計(jì)各樣本的序列數(shù)、序列長(zhǎng)度等參數(shù)并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于細(xì)菌，高通量測(cè)序得到78 108～81 654對(duì)原始序列，44 845～62 213條高質(zhì)量序列，41 617～56 170 條有效序列，平均產(chǎn)生52 737.5條有序序列，各樣本ASV數(shù)量分布在 449～1 607之間。對(duì)于真菌，高通量測(cè)序得到78 363～81 960對(duì)原始測(cè)序列，42 531～77 432條高質(zhì)量序列，42 524～77 222 條有效序列，平均產(chǎn)生70 237.5條有序序列，各樣本 ASV 數(shù)量分布在65～337之間。根據(jù)ASV聚類分析結(jié)果繪制成花瓣圖（flower plot）（圖1），細(xì)菌和真菌群落花瓣圖的中心Core為所有樣本共有ASV個(gè)數(shù)。

由圖1-a可以看出，各樣本間細(xì)菌特有ASV個(gè)數(shù)具有明顯差異，18個(gè)樣本共有ASV數(shù)為2個(gè)，其中T1_1特有ASV個(gè)數(shù)最多，為1 605個(gè)，T2_6特有ASV個(gè)數(shù)最少，為447個(gè)。由圖1-b可以看出，各樣本間真菌特有ASV個(gè)數(shù)具有明顯差異，18個(gè)樣本共有ASV數(shù)為4個(gè)，其中T1_1特有ASV個(gè)數(shù)最多，為333個(gè)，T1_3特有ASV個(gè)數(shù)最少，為61個(gè)。由圖1-c可以看出，與對(duì)照相比，火焰處理1次的土壤細(xì)菌和真菌的ASV數(shù)量均增加，而火焰處理連續(xù)2次的土壤細(xì)菌和真菌的ASV數(shù)量均減少。

2.1.2 火焰處理對(duì)土壤微生物豐度和多樣性的影響

經(jīng)過高通量測(cè)序，根據(jù)100%的相似度閾值對(duì)細(xì)菌和真菌群落進(jìn)行聚類判定與物種注釋，共計(jì)得到9 196個(gè)細(xì)菌ASV和1 565個(gè)真菌ASV。其中，細(xì)菌隸屬于36門86綱200目313科601屬1 216 種；真菌隸屬于15門37綱78目148科252屬268種。

由表1可以看出，細(xì)菌和真菌不同處理的測(cè)序深度指數(shù)均高于0.99，說(shuō)明所有處理的測(cè)序數(shù)據(jù)能反映樣本中細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性。與對(duì)照相比，不同火焰處理的辛普森指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Observed_species指數(shù)等均無(wú)顯著差異，說(shuō)明所有處理土壤細(xì)菌和真菌豐度、多樣性無(wú)顯著變化，火焰處理對(duì)土壤細(xì)菌和真菌的豐度和多樣性影響不顯著。

2.1.3 火焰處理下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的NMDS分析

由圖2-a和圖2-b可以看出，土壤細(xì)菌和真菌的Stress（應(yīng)力值）分別為0.031、0.019，說(shuō)明樣品對(duì)火焰處理下土壤細(xì)菌和真菌具有實(shí)際解釋意義，且具有很好的代表性。與對(duì)照相比，對(duì)于細(xì)菌，火焰處理1次的T1處理所有樣本會(huì)富集到一起，隨著火焰處理次數(shù)的增加樣本會(huì)出現(xiàn)分離的情況；對(duì)于真菌，隨著火焰處理次數(shù)的增加，樣本出現(xiàn)分離的情況更加明顯。

2.1.4 火焰處理對(duì)土壤微生物門水平群落組成的影響

由圖3-a可以看出，不同處理土壤細(xì)菌門水平群落組成相對(duì)豐度大于1.00%的有變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門、黏菌門、硝化螺旋菌門7種，其中變形菌門、酸桿菌門是CK和T1處理土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門（相對(duì)豐度＞10.00%），兩者相對(duì)豐度之和分別占到了總測(cè)序豐度的 66.18%和64.96%；T2處理土壤中變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，三者相對(duì)豐度之和占到了總測(cè)序豐度的 77.74%。與對(duì)照相比，T1處理土壤中酸桿菌門細(xì)菌相對(duì)豐度降低，變形菌門細(xì)菌相對(duì)豐度增加，T2處理土壤中芽單胞菌門細(xì)菌相對(duì)豐度降低，擬桿菌門細(xì)菌相對(duì)豐度增加。

由圖3-b可以看出，CK、T2處理土壤真菌門水平群落組成相對(duì)豐度大于1.00%的有子囊菌門、擔(dān)子菌門、被孢霉門、未分類真菌門、壺菌門5種，T1處理有6種，增加了球囊菌門；其中子囊菌門、擔(dān)子菌門、被孢霉門為CK和T1處理的優(yōu)勢(shì)真菌門（相對(duì)豐度＞10.00%），三者相對(duì)豐度之和分別占到了總測(cè)序豐度的 89.97%和86.74%，而子囊菌門、擔(dān)子菌門、被孢霉門、未分類真菌門為T2處理土壤中優(yōu)勢(shì)真菌門，四者相對(duì)豐度之和占到了總測(cè)序豐度的 95.49%。與對(duì)照相比，T1處理子囊菌門、被孢霉門和未分類真菌門真菌相對(duì)豐度降低，擔(dān)子菌門、壺菌門和球囊菌門真菌相對(duì)豐度增加；T2處理土壤中被孢霉門的相對(duì)豐度降低，子囊菌門、擔(dān)子菌門、未分類真菌門和壺菌門真菌相對(duì)豐度增加。

2.1.5 火焰處理對(duì)土壤微生物屬水平群落組成的影響

由圖4-a可以看出，不同處理土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬（相對(duì)豐度＞5.00%）為Subgroup_2和鞘氨醇單胞菌屬。與對(duì)照相比，不同火焰處理Subgroup_2的相對(duì)豐度均降低，T1處理土壤中鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌相對(duì)豐度升高，T2處理土壤中黃桿菌屬細(xì)菌相對(duì)豐度升高。

由圖4-b可以看出，與對(duì)照相比，T1處理土壤中白環(huán)蘑屬、粗糙孔菌屬和斜蓋傘屬真菌相對(duì)豐度明顯增加，被孢霉屬、鐮刀菌屬、腐質(zhì)霉屬、小脆柄菇屬、莖點(diǎn)霉屬和青霉菌屬真菌相對(duì)豐度明顯降低；T2處理土壤中白環(huán)蘑屬、Echria和奈瑟氏菌屬的相對(duì)豐度明顯增加，被孢霉屬、鐮刀菌屬、小脆柄菇屬和青霉菌屬真菌的相對(duì)豐度明顯降低。

鐮刀菌屬真菌是煙草根腐病致病菌，亦是自然界中常見的與作物的生長(zhǎng)密切相關(guān)的病原菌，在生產(chǎn)上煙草根腐病與黑脛病常?；旌习l(fā)生。由圖4-b可以看出，鐮刀菌屬真菌相對(duì)豐度隨火焰處理次數(shù)的增加而快速降低，說(shuō)明火焰處理可以降低土壤根腐病致病菌相對(duì)豐度，尤其是T2處理更為明顯。

2.1.6 火焰處理對(duì)土壤微生物差異物種的影響

微生物多元變量統(tǒng)計(jì)分析采用Kruskal Wallis算法進(jìn)行，并進(jìn)行Lefse多級(jí)物種差異判別分析（圖 5），比較從門到屬水平微生物種類的顯著性。由圖5-a可以看出，不同處理土壤細(xì)菌從門水平到綱水平差異物種均不顯著，在目水平到屬水平上，分別有5、8、14組差異物種出現(xiàn)顯著差異（P<0.05），其中CK的差異物種顯著較高的有1目2科2屬，T1處理的差異物種顯著較高的有2目1科3屬，T2處理的差異物種顯著較高的有2目5科9屬。由圖5-b可以看出，不同處理土壤真菌在門水平差異物種均不顯著，在綱水平到屬水平上，分別有1、1、3、3組差異物種出現(xiàn)顯著差異（P<0.05），其中CK的差異物種顯著較高的有1綱1目1科1屬，T1處理的差異物種與其他2個(gè)處理差異均不顯著，T2處理的差異物種顯著較高的有2科2屬。

2.1.7 火焰處理對(duì)土壤微生物物種重要性的影響

采用隨機(jī)森林機(jī)器學(xué)習(xí)算法找出組間差異物種，取相對(duì)豐度前30的屬繪制物種重要性點(diǎn)圖（圖6）。由圖6-a可以看出，土壤細(xì)菌中前5的重要物種依次是伯克氏菌屬、黏菌屬、黃桿菌屬、布氏桿菌屬和全噬菌屬。由圖6-b可以看出，土壤真菌中前5的重要物種依次是附球菌屬、裂殼菌屬、莖點(diǎn)霉屬、被孢霉屬和鐮刀菌屬。

由圖7-a可以看出，與對(duì)照相比，火焰處理連續(xù)2次的T2處理土壤細(xì)菌第1重要的伯克氏菌屬相對(duì)豐度顯著較高（P<0.05），第2重要的黏菌屬較高但差異不顯著，第3重要的黃桿菌屬細(xì)菌差異不大，第4重要的布氏桿菌屬細(xì)菌相對(duì)豐度差異不顯著，第5重要的全噬菌屬細(xì)菌相對(duì)豐度差異不顯著且高于其他2處理。由圖7-b可以看出，與對(duì)照相比，火焰處理（T1和T2處理）土壤真菌重要性前2的附球菌屬、裂殼菌屬真菌相對(duì)豐度均較高，其中T2處理均顯著較高（P<0.05）；隨火焰處理次數(shù)的增加，土壤真菌重要性第3至第5的莖點(diǎn)霉屬、被孢霉屬和鐮刀菌屬真菌相對(duì)豐度均逐漸降低，其中T2處理莖點(diǎn)霉屬、被孢霉屬真菌相對(duì)豐度均顯著低于對(duì)照（P<0.05）且T1與T2處理間差異不顯著，T2處理鐮刀菌屬真菌相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照和T1處理（P<0.05），而T1與CK間差異不顯著。

2.2 火焰處理對(duì)植煙土壤代謝物的影響

2.2.1 火焰處理對(duì)土壤差異代謝物數(shù)量的影響

不同處理篩選出的代謝物種類共2 943種，其中正離子模式下有1 808種，負(fù)離子模式下有1 135種。

由圖8可知，T1 vs. CK比對(duì)組的差異代謝物有77種，其中上調(diào)即T1處理代謝物含量高于CK的有25種，下調(diào)即T1處理代謝物含量低于CK的有52種；T2 vs. CK比對(duì)組的差異代謝物有45種，其中上調(diào)即T2處理代謝物含量高于CK的有20種，下調(diào)即T2處理代謝物含量低于CK的有25種；T2 vs. T1比對(duì)組的差異代謝物有33種，其中上調(diào)即T2處理代謝物含量高于T1處理的有11種，下調(diào)即T2處理代謝物含量低于T1處理的有22種；不同處理間差異代謝物上調(diào)和下調(diào)的數(shù)量趨勢(shì)一致，均表現(xiàn)為T1 vs. CK＞T2 vs. CK＞T2 vs. T1。

2.2.2 火焰處理對(duì)土壤差異代謝物種類的影響

層次聚類結(jié)果表明，處理之間差異代謝物均聚為2類，一類為上調(diào)，一類為下調(diào)。由圖9-a及表2可知，在T1 vs. CK 中25種上調(diào)的差異代謝物有11種脂質(zhì)和類脂分子、4種苯環(huán)化合物、4種有機(jī)氧化物、3種有機(jī)酸及其衍生物、1種有機(jī)氮化合物、1種苯丙素類和聚酮類化合物和1種未分類化合物，52種下調(diào)的差異代謝物有26種脂質(zhì)和類脂分子、4種苯環(huán)化合物、5種有機(jī)氧化物、4種有機(jī)酸及其衍生物、7種有機(jī)雜環(huán)化合物、4種苯丙素類和聚酮類化合物和2種未分類化合物。由圖9-b及表2可知，在T2 vs. CK 中20種上調(diào)的差異代謝物有9種脂質(zhì)和類脂分子、1種苯環(huán)化合物、5種機(jī)氧化物、3種有機(jī)酸及其衍生物、1種有機(jī)氮化合物和1種未分類化合物，25種下調(diào)的差異代謝物有12種脂質(zhì)和類脂分子、5種苯環(huán)化合物、1種有機(jī)氧化物、2種有機(jī)酸及其衍生物、2種有機(jī)雜環(huán)化合物、2種苯丙素類和聚酮類化合物和1種未分類化合物。由圖9-c及表2可知，在T2 vs. T1 中11種上調(diào)的差異代謝物有6種脂質(zhì)和類脂分子、2種苯環(huán)化合物、1種有機(jī)氧化物、1種有機(jī)酸及其衍生物、1種有機(jī)雜環(huán)化合物，22種下調(diào)的差異代謝物有11種脂質(zhì)和類脂分子，4種苯環(huán)化合物，2種有機(jī)雜環(huán)化合物，1種有機(jī)酸及其衍生物，1種核苷、核苷酸及類似物和3種未分類化合物。由圖9-d及表2可知，在T2 vs. T1 vs. CK 中15種上調(diào)的差異代謝物有5種脂質(zhì)和類脂分子、3種有機(jī)氧化物、3種有機(jī)酸及其衍生物、2種有機(jī)雜環(huán)化合物、1種苯環(huán)化合物和1種未分類化合物，25種下調(diào)的差異代謝物有11種脂質(zhì)和類脂分子、4種苯環(huán)化合物、3種有機(jī)酸及其衍生物、3種有機(jī)雜環(huán)化合物、1種有機(jī)氧化物、1種苯丙素類和聚酮類化合物、2種未分類化合物。

2.2.3 火焰處理對(duì)土壤差異代謝物代謝通路及富集的影響

基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)不同處理差異代謝物以P≤0.05為閾值進(jìn)行代謝通路富集分析。代謝通路中P表示該代謝通路富集的顯著性，且P越小，該代謝通路差異越顯著。

由圖10-a和表3可知，T1 vs. CK 的比對(duì)組中，顯著差異代謝物共有4種且均為上調(diào)即T1處理差異代謝物含量高于CK，分別為N-琥珀酰-L，L-2，6-二氨基庚二酸酯、山梨醇、4-硝基苯酚和5，6-二氫一氧化睪酮，這4種顯著差異代謝物分別參與1、5、1、2條共9條代謝通路，其中有7條代謝通路具有顯著差異，分別為賴氨酸生物合成代謝、糖尿病心肌病代謝、5-羥色胺能突觸代謝、半乳糖代謝、果糖和甘露糖代謝、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)代謝和花生四烯酸代謝。

由圖10-b和表3可知，T2 vs. CK 的比對(duì)組中，顯著差異代謝物共有6種且5種上調(diào)1種下調(diào)，5種上調(diào)的代謝物分別為甘油磷酸膽堿、硫酸膽堿、半乳糖醇、山梨醇和左旋谷氨酰胺，1種下調(diào)的代謝物為4-氟苯甲酸，這6種顯著差異代謝物共參與25條代謝通路，其中有19條代謝通路具有顯著差異，甘油磷酸膽堿參與了癌癥膽堿代謝和醚脂代謝2條代謝通路，硫酸膽堿參與了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器代謝1條代謝通路，半乳糖醇參與了半乳糖代謝和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)代謝2條代謝通路，山梨醇參與了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器代謝、半乳糖代謝、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)代謝、糖尿病心肌病代謝和果糖和甘露糖代謝5條代謝通路，4-氟苯甲酸參與了氟苯甲酸降解代謝1條代謝通路，左旋谷氨酰胺參與了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器代謝、谷氨酸能突觸代謝、γ-氨基丁酸能突觸代謝、近曲小管碳酸氫鹽再生代謝、氮代謝、精氨酸生物合成代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、維生素B₆代謝、礦物質(zhì)吸收代謝、癌癥糖尿病中心碳代謝、蛋白質(zhì)消化吸收代謝和氨基酰-tRNA 生物合成代謝12天代謝通路。

由圖10-c和表3可知，T2 vs. T1 的比對(duì)組中，顯著差異代謝物共有6種且3種上調(diào)3種下調(diào)，3種上調(diào)的代謝物分別為半乳糖醇、梅利比多醇和左旋谷氨酰胺，3種下調(diào)的代謝物分別為溶血磷脂酰膽堿［18∶4（6Z，9Z，12Z，15Z）/0∶0］、N-琥珀酰-L，L-2，6-二氨基庚二酸酯和4-氟苯甲酸，這6種顯著差異代謝物共參與23條代謝通路，其中有15條代謝通路具有顯著差異，半乳糖醇和梅利比多醇均參與了半乳糖代謝且均為1條代謝通路，左旋谷氨酰胺參與了谷氨酸能突觸代謝、γ-氨基丁酸能突觸代謝、近曲小管碳酸氫鹽再生代謝、氮代謝、精氨酸生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、維生素B₆代謝、礦物質(zhì)吸收代謝、癌癥糖尿病中心碳代謝、蛋白質(zhì)消化吸收代謝和氨基酰-tRNA 生物合成代謝11條代謝通路，溶血磷脂酰膽堿［18∶4（6Z，9Z，12Z，15Z）/0∶0］參與了癌癥膽堿代謝1條代謝通路，N-琥珀酰-L，L-2，6-二氨基庚二酸酯參與了賴氨酸生物合成代謝1條代謝通路，4-氟苯甲酸參與了氟苯甲酸降解代謝1條代謝通路。

由圖10-d和表3可知，T2 vs. T1 vs. CK 的比對(duì)組中，顯著差異代謝物共有6種，分別為硫酸膽堿、半乳糖醇、N-琥珀酰-L，L-2，6-二氨基庚二酸酯、山梨醇、4-硝基苯酚和左旋谷氨酰胺，這6種顯著差異代謝物共參與23條代謝通路，其中有17條代謝通路具有顯著差異，硫酸膽堿參與了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器代謝1條代謝通路，半乳糖醇參與了半乳糖代謝和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)代謝2條代謝通路，N-琥珀酰-L，L-2，6-二氨基庚二酸酯參與了賴氨酸生物合成代謝1條代謝通路，山梨醇參與了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器代謝、半乳糖代謝、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)代謝、糖尿病心肌病代謝和果糖和甘露糖代謝5條代謝通路，左旋谷氨酰胺參與了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器代謝、谷氨酸能突觸代謝、γ-氨基丁酸能突觸代謝、近曲小管碳酸氫鹽再生代謝、氮代謝、精氨酸生物合成代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，維生素B₆代謝，礦物質(zhì)吸收代謝，癌癥糖尿病中心碳代謝，蛋白質(zhì)消化吸收代謝和氨基酰-tRNA生物合成代謝12條代謝通路，而4-硝基苯酚代謝通路差異不顯著。

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

土壤微生物多樣性越高，土壤生態(tài)系統(tǒng)越穩(wěn)定，土壤越健康^［43］。婁俊鑫等研究表明，火焰處理對(duì)土壤真菌α多樣性指數(shù)無(wú)影響不顯著，但對(duì)真菌豐度和真菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響^［28］。本試驗(yàn)研究表明，各樣本間細(xì)菌和真菌特有ASV個(gè)數(shù)均具有明顯差異，而火焰處理對(duì)土壤細(xì)菌和真菌的豐度和α多樣性影響均不顯著，這說(shuō)明雖然火焰與土壤直接接觸，但并沒有破壞土壤微生物多樣性，不會(huì)打破土壤生態(tài)平衡。火焰處理下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的NMDS分析表明，隨著火焰處理次數(shù)的增加，樣本會(huì)出現(xiàn)分離的情況，這說(shuō)明火焰處理對(duì)土壤細(xì)菌和真菌群落組成有顯著影響。這可能是因?yàn)榛鹧嫣幚硎刮⑸锶郝鋬?nèi)部種群發(fā)生了變化，打破原有平衡，種群豐度改變，從而造成群落差異。

與對(duì)照相比，火焰處理1次的T1處理變形菌門細(xì)菌的相對(duì)豐度增加，酸桿菌門細(xì)菌的相對(duì)豐度降低；火焰處理連續(xù)2次的T2處理擬桿菌門細(xì)菌的相對(duì)豐度增加，芽單胞菌門細(xì)菌的相對(duì)豐度降低。變形菌門細(xì)菌主要參與復(fù)合降解^［44］；酸桿菌門細(xì)菌對(duì)植物殘?bào)w降解有重要作用^［45］，屬寡營(yíng)養(yǎng)類群，在低營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中的豐度反而更高^［46］，且具有嗜酸性，其豐度與土壤pH值呈顯著負(fù)相關(guān)^［47］；擬桿菌門細(xì)菌屬于富營(yíng)養(yǎng)類群且對(duì)碳源非常敏感，可以利用土壤中的速效碳源快速生長(zhǎng)^［48］；芽單胞菌門細(xì)菌對(duì)土壤質(zhì)量和環(huán)境穩(wěn)定性具有重要影響。這說(shuō)明火焰處理促進(jìn)有機(jī)物質(zhì)分解，增加土壤中碳源，增強(qiáng)土壤肥力，富營(yíng)養(yǎng)型擬桿菌門細(xì)菌豐度升高，而寡營(yíng)養(yǎng)型酸桿菌門細(xì)菌相對(duì)豐度降低，同時(shí)變形菌門細(xì)菌相對(duì)豐度升高，土壤復(fù)合降解能力增強(qiáng)，由于火焰與土壤直接接觸，芽單胞菌門細(xì)菌相對(duì)豐度降低，對(duì)土壤生態(tài)穩(wěn)定性有一定影響。

與對(duì)照相比，T1處理子囊菌門、被孢霉菌門真菌的相對(duì)豐度降低，擔(dān)子菌門、壺菌門和球囊菌門真菌的相對(duì)豐度增加；T2處理被孢霉門真菌的相對(duì)豐度降低，子囊菌門、擔(dān)子菌門、壺菌門真菌的相對(duì)豐度增加。子囊菌門真菌能加快有機(jī)物代謝，促進(jìn)土壤碳循環(huán)^［49］，隨著火焰處理次數(shù)的增加，土壤中碳源增加，促進(jìn)土壤子囊菌門真菌繁殖，加速土壤碳循環(huán)；被孢霉菌門真菌中較多的屬為植物病害的主要屬^［50］，火焰處理降低了被孢霉菌門真菌相對(duì)豐度降低且隨火焰處理的增加其豐度顯著降低；擔(dān)子菌門真菌能與植物共生形成菌根，有利于作物根系發(fā)育，壺菌門真菌能釋放酵素分解土壤中的腐爛的有機(jī)物，本試驗(yàn)中火焰處理增加了擔(dān)子菌門真菌和壺菌門真菌的相對(duì)豐度，有利于增加土壤養(yǎng)分和后期煙草根系發(fā)育；球囊菌門真菌通過與作物根系共生形成叢枝菌根，有助于作物根系吸收無(wú)機(jī)鹽，尤其是磷，火焰處理1次的T1處理增加了土壤球囊菌門真菌相對(duì)豐度，有利于后期煙草根系吸收土壤養(yǎng)分。

與對(duì)照相比，火焰處理1次的T1處理鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的相對(duì)豐度升高，火焰處理2次的T2處理黃桿菌屬細(xì)菌的相對(duì)豐度升高。鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌可降解芳香化合物^［51］，有利于降解除草劑和農(nóng)藥等有毒物質(zhì)^［52］；黃桿菌屬有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型好氧菌，具有降解復(fù)合有機(jī)物和生物聚合物的能力^［53］。說(shuō)明火焰處理能增加鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌和黃桿菌屬細(xì)菌的相對(duì)豐度，增強(qiáng)土壤對(duì)有毒物質(zhì)的降解能力。

與對(duì)照相比，T1處理白環(huán)蘑屬、粗糙孔菌屬和斜蓋傘屬真菌的相對(duì)豐度增加，被孢霉屬、腐質(zhì)霉屬和小脆柄菇屬真菌的相對(duì)豐度降低；T2處理的白環(huán)蘑屬、Echria和奈瑟氏菌屬真菌的相對(duì)豐度增加，被孢霉屬、鐮刀菌屬和小脆柄菇屬真菌的相對(duì)豐度降低。白環(huán)蘑屬真菌可與植物形成外生菌根^［54］，本試驗(yàn)中火焰處理增加了白環(huán)蘑屬真菌的相對(duì)豐度，利于后期煙株根系對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收；粗糙孔菌屬真菌是有益菌，具有免疫調(diào)節(jié)生物學(xué)活性，本試驗(yàn)中火焰處理1次增加了土壤粗糙孔菌屬真菌相對(duì)豐度，能增加植物抗病性；斜蓋傘屬真菌能與植株建立共生關(guān)系，有助于植株更好地吸收和利用營(yíng)養(yǎng)，特別是鉀元素，促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)斜蓋傘屬真菌的子實(shí)體對(duì)某些癌癥具有抑制作用，本試驗(yàn)火焰處理1次的T1處理能促進(jìn)斜蓋傘屬真菌相對(duì)豐度增加，說(shuō)明短時(shí)間的高溫處理有利于斜蓋傘屬真菌生長(zhǎng)繁殖；被孢霉屬真菌可促進(jìn)土壤碳循環(huán)，通過釋放有機(jī)酸來(lái)溶解難利用的磷，并且可以加強(qiáng)植物對(duì)病原體的抵抗能力，促進(jìn)植物生長(zhǎng)^［55］，J6VvfdyPJfjEKSmPjvy05Q==本試驗(yàn)中被孢霉屬真菌相對(duì)豐度均降低，且隨火焰處理次數(shù)的增加，其相對(duì)豐度依次降低，這與婁俊鑫等研究的中檔火力火焰處理能顯著提高被孢霉屬真菌相對(duì)豐度^［28］的結(jié)論不一致，而與高檔火力火焰處理能顯著降低被孢霉屬真菌相對(duì)豐度的結(jié)論一致，可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)的火焰處理溫度和婁俊鑫等研究的高檔火力火焰溫度相近所致。小脆柄菇屬真菌是一種與植物密切共生的微生物，增強(qiáng)植物免疫能力和抗病性，腐質(zhì)霉屬真菌能分解有機(jī)物質(zhì)，產(chǎn)生生物堿、腐殖酸、脂肪酸等有用化合物，對(duì)土壤肥力的提高和植物的生長(zhǎng)具有重要作用，火焰處理后有機(jī)殘?bào)w炭化減少，土壤中含糖物質(zhì)降低，不利于被孢霉屬真菌、小脆柄菇屬真菌和腐質(zhì)霉屬真菌繁殖，他們相對(duì)豐度均降低；鐮刀菌屬真菌是土壤主要病原菌之一，可侵染多種作物，導(dǎo)致作物嚴(yán)重減產(chǎn)^［56］，提高土壤有機(jī)質(zhì)含量能降低鐮刀菌屬豐度^［57］，本試驗(yàn)中火焰處理2次土壤中由于有機(jī)殘?bào)w炭化致使有機(jī)質(zhì)含量提高，土壤鐮刀菌屬真菌相對(duì)豐度降低，從而降低煙草土傳病害的發(fā)生。

與對(duì)照相比，火焰處理連續(xù)2次的T2處理細(xì)菌差異物種在科水平和屬水平上顯著較多，而真菌差異物種在綱水平至屬水平各有一種物種顯著差異?；鹧嫣幚磉B續(xù)2次的T2處理土壤細(xì)菌第1重要的伯克氏菌屬相對(duì)豐度顯著較高（P<0.05），第2重要的黏菌屬較高但差異不顯著，第3重要的黃桿菌屬細(xì)菌差異不大，第4重要的布氏桿菌屬細(xì)菌相對(duì)豐度差異不顯著（P>0.05），第5重要的全噬菌屬的相對(duì)豐度差異不顯著且相對(duì)豐度高于其他2個(gè)處理?；鹧嫣幚淼腡1和T2處理土壤真菌重要性前2的附球菌屬和裂殼菌屬的相對(duì)豐度均較高，其中T2處理均顯著較高（P<0.05）；隨火焰處理次數(shù)的增加，T1和T2處理土壤真菌重要性第3至第5的莖點(diǎn)霉屬、被孢霉屬和鐮刀菌屬的相對(duì)豐度均逐漸降低，其中T2處理莖點(diǎn)霉屬和被孢霉屬的相對(duì)豐度均顯著低于對(duì)照（P<0.05），鐮刀菌屬的相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照和T1處理（P<0.05）。伯克氏菌屬細(xì)菌具有生物固氮和解磷作用，有利于作物吸收氮和磷，同時(shí)可產(chǎn)生植物激素如吲哚乙酸和分泌抗菌物質(zhì)^［58］；黏菌屬細(xì)菌是革蘭氏陰性菌，具有降解土壤污染物的作用；黃桿菌屬細(xì)菌有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用^［59］；全噬菌屬細(xì)菌是酸桿菌門細(xì)菌，具有嗜酸性，在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用；附球菌屬真菌能促進(jìn)真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生；布氏桿菌屬細(xì)菌、莖點(diǎn)霉屬真菌和鐮刀菌屬真菌均為致病菌。說(shuō)明火焰處理連續(xù)2次能提高伯克氏菌屬細(xì)菌、黏菌屬細(xì)菌、全噬菌屬細(xì)菌和附球菌屬真菌、裂殼菌屬真菌的相對(duì)豐度，降低布氏桿菌屬細(xì)菌和莖點(diǎn)霉屬、被孢霉屬、鐮刀菌屬真菌的相對(duì)豐度，有利于降低土壤致病菌富集，提高土壤抗病性，促進(jìn)后期作物生長(zhǎng)發(fā)育。

土壤微生物通過礦化、硝化、氨化作用影響土壤養(yǎng)分釋放和吸收，同時(shí)不同土壤微生物的功能不同，從而影響土壤微生物代謝特征。

與對(duì)照相比，火焰處理1次的T1處理有77種差異代謝物，其中上調(diào)即T1處理代謝物含量較高的有25種，下調(diào)即T1處理代謝物含量較低的有52種；火焰處理連續(xù)2次的T2處理有45種差異代謝物，其中上調(diào)的有20種，下調(diào)的有25種；T2 vs. T1比對(duì)組的差異代謝物有33種，其中上調(diào)的有11種，下調(diào)的有22種；不同比對(duì)組中土壤代謝物均以脂質(zhì)和類脂分子最多。說(shuō)明隨著火焰處理次數(shù)的增加，土壤差異代謝物種類數(shù)量降低，且下調(diào)的種類多于上調(diào)的種類，這可能是因?yàn)榛鹧嫣幚頊囟容^高，不利于土壤代謝物的產(chǎn)生。

與對(duì)照相比，T1處理顯著差異代謝物共有4種且均為上調(diào)，分別為N-琥珀酰-L，L-2，6-二氨基庚二酸酯、山梨醇、4-硝基苯酚和5，6-二氫一氧化睪酮，這4種顯著差異代謝物有7條顯著差異的代謝通路；T2處理顯著差異代謝物共有6種且5種上調(diào)1種下調(diào)，分別為甘油磷酸膽堿、硫酸膽堿、半乳糖醇、山梨醇、左旋谷氨酰胺和4-氟苯甲酸，這6種顯著差異代謝物有19條顯著差異的代謝通路。T2 vs. T1 的比對(duì)組中，顯著差異代謝物共有6種，分別為半乳糖醇、梅利比多醇、左旋谷氨酰胺、溶血磷脂酰膽堿［18∶4（6Z，9Z，12Z，15Z）/0∶0］、N-琥珀酰-L，L-2，6-二氨基庚二酸酯和4-氟苯甲酸，這6種顯著差異代謝物有15條顯著差異的代謝通路。T2 vs. T1 vs. CK 的比對(duì)組中，有6種差異代謝物顯著，分別為硫酸膽堿、半乳糖醇、N-琥珀酰-L，L-2，6-二氨基庚二酸酯、山梨醇、4-硝基苯酚和左旋谷氨酰胺，這6種顯著差異代謝物有17條顯著差異的代謝通路。隨著火焰處理次數(shù)的增加，土壤顯著差異代謝物種類和代謝通路均增多，且除山梨醇外，其他代謝物種類均不同，說(shuō)明火焰處理在改變土壤微生物群落組成的同時(shí)也改變了土壤代謝物，且除4-氟苯甲酸下調(diào)外，其他9種代謝物均上調(diào)。

3.2 結(jié)論

火焰處理1次的T1處理增加了變形菌門細(xì)菌、鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌和擔(dān)子菌門、壺菌門、球囊菌門、白環(huán)蘑屬、粗糙孔菌屬及斜蓋傘屬真菌的相對(duì)豐度，降低了酸桿菌門細(xì)菌和子囊菌門、被孢霉菌門真菌及被孢霉屬、腐質(zhì)霉屬、小脆柄菇屬真菌的相對(duì)豐度；火焰處理連續(xù)2次的T2處理增加了擬桿菌門細(xì)菌、黃桿菌屬細(xì)菌和子囊菌門、擔(dān)子菌門、壺菌門及白環(huán)蘑屬、Echria、奈瑟氏菌屬真菌的相對(duì)豐度，降低了芽單胞菌門細(xì)菌、被孢霉菌門真菌和被孢霉屬、鐮刀菌屬、小脆柄菇屬真菌的相對(duì)豐度。

火焰處理連續(xù)2次的T2處理土壤伯克氏菌屬、黏菌屬、全噬菌屬細(xì)菌相對(duì)豐度較高或顯著較高，火焰處理的T1和T2處理土壤附球菌屬、裂殼菌屬真菌相對(duì)豐度均較高，其中T2處理均顯著較高，隨火焰處理次數(shù)的增加，土壤莖點(diǎn)霉屬、被孢霉屬和鐮刀菌屬真菌相對(duì)豐度均逐漸降低，其中T2處理莖點(diǎn)霉屬、被孢霉屬真菌相對(duì)豐度均顯著低于對(duì)照，鐮刀菌屬真菌相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照和T1處理?；鹧嫣幚?次的T2處理細(xì)菌差異物種在科水平和屬水平上顯著較多，而真菌差異物種在綱水平至屬水平各有一種物種顯著差異。不同比對(duì)組中土壤代謝物均以脂質(zhì)和類脂分子最多?；鹧嫣幚?次的T1處理土壤差異代謝物有77種，火焰處理連續(xù)2次的T2處理土壤差異代謝物有45種；T2 vs. T1比對(duì)組的差異代謝物有33種。T1處理有4種顯著差異代謝物和7條顯著差異的代謝通路；T2處理有6種顯著差異代謝物和19條顯著差異的代謝通路。T2 vs. T1 的比對(duì)組中，有6種顯著差異代謝物和15條顯著差異的代謝通路。T2 vs. T1 vs. CK 的比對(duì)組中，有6種顯著差異代謝物和17條顯著差異的代謝通路。

火焰處理是火焰消毒、生物防治的物理方法，通過火焰與土壤直接接觸，促進(jìn)有機(jī)物質(zhì)分解，改變土壤微環(huán)境，在土壤微生物多樣性保持相對(duì)穩(wěn)定的前提下改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，差異代謝物增多，代謝通路增加，進(jìn)而降低土傳病害致病菌尤其是鐮刀菌屬真菌相對(duì)豐度，增加有益菌相對(duì)豐度，增強(qiáng)土壤降解能力，促進(jìn)后期作物生長(zhǎng)發(fā)育。

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