灰霉菌脅迫下番茄葉片cDNA文庫(kù)構(gòu)建及SlbZIP1互作蛋白篩選鑒定

摘要：為篩選番茄在灰霉菌侵染下與bZIP轉(zhuǎn)錄因子SlbZIP1（Solyc01g008730.2.1）互作的蛋白，以感病番茄Moneymaker為材料，提取接種灰霉菌脅迫處理后0、24、48、72、96 h的番茄葉片的總RNA，通過(guò)三框法構(gòu)建cDNA酵母文庫(kù)，計(jì)算文庫(kù)庫(kù)容量、重組效率。同時(shí)，以SlbZIP1為誘餌，利用構(gòu)建的文庫(kù)探索其在灰霉菌侵染過(guò)程中的互作蛋白，并對(duì)其中可能參與病原菌防御反應(yīng)的潛在蛋白在酵母中進(jìn)行互作驗(yàn)證。結(jié)果表明，酵母文庫(kù)庫(kù)容達(dá)到1.5×10⁶ CFU，重組效率為98%。酵母雙雜交共計(jì)篩選到14個(gè)與SlbZIP1互作的潛在蛋白。進(jìn)一步互作驗(yàn)證表明，SlbZIP1與谷氧還蛋白SlGRXC9、SlGRXC6、bZIP轉(zhuǎn)錄因子SlTGA2.2及鈣調(diào)蛋白SlCaM1均存在互作。上述結(jié)果可為進(jìn)一步闡明SlbZIP1對(duì)腐生型真菌病害的抗病分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：番茄；灰霉菌；cDNA文庫(kù)；bZIP轉(zhuǎn)錄因子；互作蛋白

中圖分類號(hào)：S436.412.1⁺3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）18-0035-06

收稿日期：2023-09-06

基金項(xiàng)目：寧夏自然科學(xué)基金（編號(hào)：2023AAC03069）；中央引導(dǎo)地方項(xiàng)目（編號(hào)：2022FRD05040）；寧夏回族自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2023BCF01042）；寧夏大學(xué)人才引進(jìn)科研啟動(dòng)基金。

作者簡(jiǎn)介：馬 燕（1997—），女，寧夏彭陽(yáng)人，碩士研究生，從事番茄分子育種相關(guān)研究。E-mail：15709510297@163.com。

通信作者：楊玉婷，博士，講師，從事蔬菜生物技術(shù)與遺傳育種方向的教學(xué)與科研工作。E-mail：yanyt@nxu.edu.cn。

番茄（Solanum lycopersicum）是我國(guó)重要的果菜之一，含有豐富的維生素和抗氧化成分，具有很高的食用性和商品性^［1］?；移咸焰撸˙otrytis cinerea）是一種廣泛存在的植物病原真菌，典型的腐生型生活模式，能夠感染生長(zhǎng)受損或衰老的植物組織，引起組織腐爛，最終導(dǎo)致植物組織死亡。番茄灰霉病是由灰葡萄孢侵染引起的一種真菌病害，其傳播速度快且危害重，是番茄上發(fā)生較為頻繁且嚴(yán)重的病害之一。該病主要危害番茄的葉片、果實(shí)等組織部位，也可危害莖和花，極大影響了番茄產(chǎn)量，通常造成番茄減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重者高達(dá)50%，甚至絕產(chǎn)，給農(nóng)戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失^［2-3］。

植物遭受病原菌侵染時(shí)，植物體內(nèi)病原菌應(yīng)答基因、次級(jí)代謝物、信號(hào)分子等迅速反應(yīng)以調(diào)控該過(guò)程。在植物病原菌侵染應(yīng)答響應(yīng)中，許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合自身轉(zhuǎn)錄因子或者其他的轉(zhuǎn)錄因子及功能基因共同促使植物適應(yīng)脅迫過(guò)程^［4］。目前，對(duì)于脅迫條件下，與調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子共同參與防御反應(yīng)的基因查找更多的是采用酵母雙雜交技術(shù)。尤其是對(duì)于已知轉(zhuǎn)錄因子相互作用的未知組分的挖掘，需建立高質(zhì)量的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，以便于未知蛋白的篩選。郭振華等構(gòu)建了核桃的酵母cDNA文庫(kù)并通過(guò)文庫(kù)篩選了生長(zhǎng)素響應(yīng)因子4的互作蛋白^［5］。賽靜憶等構(gòu)建了梨幼果FWL1膜系統(tǒng)酵母cDNA文庫(kù)并進(jìn)行了互作蛋白的篩選^［6］。馬登輝等構(gòu)建了山葡萄葉片低溫脅迫下的酵母cDNA文庫(kù)^［7］?，F(xiàn)在番茄上，就番茄不同組織、番茄花柄脫落過(guò)程、番茄分裂泛素、Cf-19介導(dǎo)的抗番茄葉霉病免疫應(yīng)答、干旱脅迫、干旱脅迫與病毒復(fù)合侵染處理、晚疫病誘導(dǎo)等多個(gè)組織及非生物和生物脅迫進(jìn)行了酵母cDNA文庫(kù)構(gòu)建^［8-15］，然而就腐生型真菌灰霉菌侵染下的酵母文庫(kù)的構(gòu)建相對(duì)較少。

因此，本研究首先構(gòu)建灰霉菌侵染感病番茄葉片全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。以響應(yīng)灰霉菌侵染的番茄轉(zhuǎn)錄因子SlbZIP1為誘餌，利用酵母雙雜交技術(shù)，對(duì)灰霉菌侵染番茄過(guò)程中與SlbZIP1互作的蛋白進(jìn)行篩選，分析篩選結(jié)果，確定SlbZIP1的潛在互作蛋白，并通過(guò)酵母一對(duì)一驗(yàn)證試驗(yàn)進(jìn)一步確定SlbZIP1的互作組分，為進(jìn)一步研究SlbZIP1參與番茄灰霉病防御反應(yīng)分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄材料Moneymaker（MM）由寧夏大學(xué)葡萄酒與園藝學(xué)院分子遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供，為實(shí)驗(yàn)室保留的高度純合自交系，對(duì)病原菌侵染表現(xiàn)為感病性。挑選籽粒飽滿的番茄種子催芽后播種于填充有草炭土和蛭石（體積比為3 ∶1）基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中。播種后置于光照培養(yǎng)箱（GDN-400G-3，陜西華屹儀器有限公司，陜西楊凌）內(nèi)生長(zhǎng)。光照培養(yǎng)箱溫度為22～28 ℃，光—暗周期為16 h—8 h，光照條件2 000 lx，相對(duì)濕度80％～90％。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至3葉1心時(shí)進(jìn)行灰霉菌接種處理。

1.2 方法

1.2.1 灰霉菌的獲得及灰霉孢子懸浮液的制備

供試灰霉菌采自于寧夏自治區(qū)銀川市周邊設(shè)施發(fā)病初期的番茄。參考董友磊的方法從病原體上分離灰霉菌置于PDA培養(yǎng)基上^［16］。參考Nielsen等的方法將分離到的病原菌進(jìn)行鑒定^［17］。挑取鑒定后的灰霉菌菌絲于無(wú)菌水，參考Yang等的方法添加2%蔗糖、0.8%KH₂PO₄制備孢子懸浮液，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板記錄孢子懸浮液濃度，將孢子懸浮液濃度調(diào)整為1.0×10⁵ CFU/mL待用^［18］。

1.2.2 番茄灰霉菌接種處理

參照Yang等的方法在寧夏大學(xué)科技樓分子遺傳育種實(shí)驗(yàn)室于2023年3月1日至8月20日對(duì)番茄葉片進(jìn)行灰霉菌接種處理^［18］。用噴壺將含有灰霉孢子的懸浮液均勻噴灑至3葉1心番茄充分展開(kāi)葉片的正面，直至有水滴滴落。接種后，將幼苗培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱中，透明罩保濕，溫度為（26±2） ℃，光—暗周期為16 h—8 h，保持相對(duì)濕度在90％以上。分別在接種后0、24、48、72、96 h統(tǒng)一采集地上部，快速用液氮速凍并保存在-80 ℃冰箱備用。每個(gè)處理5株幼苗，3次重復(fù)。

1.2.3 總RNA的提取與cDNA合成

將采集的植物樣品等量混合，使用植物RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取植物總RNA。使用cDNA合成試劑盒（寶生物工程有限公司，大連）進(jìn)行cDNA合成反應(yīng)。使用cDNA均一化TRIMMER DIRECT cDNA Normalization Kit和純化試劑盒TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit獲得均一化后純化的cDNA。

1.2.4 cDNA三框表達(dá)文庫(kù)構(gòu)建

純化的cDNA使用限制性內(nèi)切酶SfiI進(jìn)行酶切處理，去除短片段的cDNA，使用DNA ligation Kit將其連接至pGADT7三框載體，得到初級(jí)cDNA文庫(kù)。取少量初級(jí)文庫(kù)連接液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 HST08，液涂布Amp+抗性LB平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。通過(guò)平板上生長(zhǎng)的菌落個(gè)數(shù)，計(jì)算初級(jí)文庫(kù)庫(kù)容。使用NucleoBond Xtra Midi EF試劑盒進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)粒提取。

1.2.5 酵母表達(dá)載體構(gòu)建

利用一步克隆法構(gòu)建酵母表達(dá)載體。根據(jù)SlbZIP1、SlGRXC9、SlGRXC6、SlTGA2.2、SlCaM1的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)帶接頭的特異性擴(kuò)增引物（表1）。用高保真HS聚合酶（寶生物工程有限公司，大連）擴(kuò)增SlbZIP1、SlGRXC9、SlGRXC6、SlTGA2.2、SlCaM1的編碼區(qū)序列，回收PCR產(chǎn)物，參考許銅碩等的方法^［19］進(jìn)行連接。挑取單克隆進(jìn)行檢測(cè)并送奧科測(cè)序部（北京鼎盛生物科技有限公司）進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒保存留用。

1.2.6 誘餌酵母自激活檢測(cè)

參照Clontech的Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual說(shuō)明書(shū)將誘餌載體轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞，采用PEG/LiAc轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞Y2H中。涂布于SDO、SDO/X及SDO/X/A缺陷選擇培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察培養(yǎng)基上單克隆的生長(zhǎng)情況以檢測(cè)誘餌質(zhì)粒的自激活活性。

1.2.7 酵母雙雜交篩選

挑取誘餌菌落制作含有誘餌質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞，將20 μg文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞。取少量懸浮液進(jìn)行1/100、1/1 000稀釋，涂布于DDO培養(yǎng)基，檢測(cè)篩選覆蓋效果。剩余的懸浮液全部涂布到DDO/X/A（200 μg/mL）培養(yǎng)基上進(jìn)行初篩。初篩到的菌落于QDO/X/A培養(yǎng)基上進(jìn)一步篩選。

1.2.8 陽(yáng)性克隆測(cè)序及BLAST分析

對(duì)篩選到的菌落，使用T7和3′Ad引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，產(chǎn)生特異條帶的菌落送奧科測(cè)序部（北京鼎盛生物科技有限公司）進(jìn)行測(cè)序。分析測(cè)序所得序列，選擇匹配度高的序列，查rStQMIVIC+xXIAySVEIddlSYz3ZSacnz1fWACebvipk=看基因序列及功能。

1.2.9 酵母雙雜交驗(yàn)證篩選結(jié)果

將構(gòu)建正確的酵母表達(dá)載體pGBKT7-SlbZIP1和pGADT7-SlGRXC9、pGADT7-SlGRXC6、pGADT7-SlTGA 2.2、pGADT7-SlCaM1參照俞沁含等的方法共轉(zhuǎn)化酵母Y2H菌株^［20］，以pGBKT7-53 +pGADT7-T為陽(yáng)性對(duì)照，以pGBKT7-Lam+pGADT7-T為陰性對(duì)照，定量于DDO、DDO/X/A（200 ng/mL）、QDO、QDO/X/A（200 ng/mL）酵母培養(yǎng)基上，觀察單菌落生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄葉片灰霉菌脅迫下酵母雙雜交核三框cDNA文庫(kù)構(gòu)建及鑒定

選取處理后的番茄葉片均一混合后提取總RNA，檢測(cè)D_{260 nm}/D_280nm為2.08，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1-A所示，有清晰的條帶出現(xiàn)，分別為28S和18S的RNA條帶，表明提取到正確且完整的RNA。利用SMART法合成cDNA，對(duì)其在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，檢測(cè)其合成效果，結(jié)果如圖1-B所示，條帶沉陷彌散狀態(tài)，分布在500～4 000 bp之間。經(jīng)過(guò)均一化處理后，無(wú)特異性明亮條帶產(chǎn)生，條帶彌散范圍縮?。▓D1-C）。進(jìn)一步使用限制性內(nèi)切酶SfiI對(duì)cDNA進(jìn)行酶切處理，去除短片段，獲得可用于后續(xù)建庫(kù)的cDNA（圖1-D）。

將純化后的cDNA連接至pGADT7三框載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞HST08，涂布于Amp+抗性LB培養(yǎng)基平板上，獲得初級(jí)文庫(kù)（圖2-A）。檢測(cè)培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的菌落個(gè)數(shù)，計(jì)算初級(jí)文庫(kù)庫(kù)容，得到讀碼框1、2、3文庫(kù)庫(kù)容均大于1.5×10⁶ CFU/mL。進(jìn)一步對(duì)文庫(kù)中插入片段進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2-B所示，3個(gè)讀碼框內(nèi)插入片段長(zhǎng)度分布范圍為500～2 000 bp，平均長(zhǎng)度約為1 kbp，重組率約98%，表明初級(jí)的cDNA文庫(kù)構(gòu)建完成。

進(jìn)一步將3個(gè)讀碼框內(nèi)的450萬(wàn)單克隆混合轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞HST08中，涂布于LB培養(yǎng)基平板進(jìn)行擴(kuò)增并提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，在5 000 bp左右有清晰且明亮的條帶出現(xiàn)，符合預(yù)期大小。

2.2 pGBKT7-SlbZIP1誘餌載體構(gòu)建及自激活檢測(cè)

構(gòu)建誘餌質(zhì)粒載體，如圖4-A所示，獲得清晰且大小為1 000 bp的條帶，符合預(yù)期大小，表明誘餌質(zhì)粒構(gòu)建正確。將構(gòu)建正確的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-SlbZIP1轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞檢測(cè)自激活活性。由圖4-B可知，酵母缺陷型培養(yǎng)基SDO平板上有白色單克隆產(chǎn)生，而酵母缺陷型培養(yǎng)基SDO/X/A平板上無(wú)單克隆出現(xiàn)，這表明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-SlbZIP1不存在自激活活性。

2.3 文庫(kù)篩選

對(duì)沒(méi)有自激活活性的誘餌質(zhì)粒進(jìn)行文庫(kù)篩選，在添加有DDO/X/A的平板上共計(jì)篩選到藍(lán)色單克隆108個(gè)。將其進(jìn)一步在QDO/X/A的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，共計(jì)篩選到藍(lán)色克隆98個(gè)（圖5-A）。陽(yáng)性克隆PCR擴(kuò)增后在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5-B所示，擴(kuò)增得到500～2 000 bp大小不等的條帶，表明獲得陽(yáng)性克隆。

將陽(yáng)性克隆PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果如表2所示，獲得14個(gè)候選互作蛋白，包括1個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子SlTGA2.2（NM_001309871.1）、2個(gè)谷氧還蛋白SlGRXC9（XM_010325453.3）和SlGRXC6（XM_004245039.4）、1個(gè)鈣調(diào)蛋白（XM_004230236.4）、1個(gè)羧酸脂酶（XM_004250202.4）、1個(gè)應(yīng)激蛋白（XM_004237396.4）和其他蛋白。其中，bZIP轉(zhuǎn)錄因子、谷氧還蛋白被報(bào)道積極參與灰霉菌防御反應(yīng)，鈣調(diào)蛋白積極參與白粉病抗性防御反應(yīng)。

2.4 pGBKT7-SlbZIP1與互作蛋白酵母雙雜交驗(yàn)證

為驗(yàn)證SlbZIP1潛在的互作組分，從14個(gè)候選互作蛋白中選取與病原菌侵染相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子SlTGA2.2（NM_001309871.1）、谷氧還蛋白SlGRXC9（XM_010325453.3）和SlGRXC6（XM_004245039.4）及鈣調(diào)蛋白（XM_004230236.4）在番茄中進(jìn)行同源克隆，將其連接至pGADT7載體，分別獲得pGADT7-SlTGA2.2、pGADT7-SlGRXC9、pGADT7-SlGRXC6、pGADT7-SlCaM1。與誘餌載體共同轉(zhuǎn)化于酵母菌株Y2H中，以組合pGBKT7-53和pGADT7-T為陽(yáng)性對(duì)照，以組合pGBKT7-Lam和pGADT7-T為陰性對(duì)照，結(jié)果如圖6所示，SlbZIP1與SlGRXC9、SlGRXC6、SlTGA2.2、SlCaM1共轉(zhuǎn)化的酵母菌株以及陽(yáng)性對(duì)照可以正常生長(zhǎng)，菌落飽滿，且在含有X-α-gal和Aba的缺陷型培養(yǎng)基上變藍(lán)，表明SlbZIP1與SlGRXC9、SlGRXC6、SlTGA2.2、SlCaM1均存在互作。

3 討論

利用酵母雙雜交系統(tǒng)從cDNA文庫(kù)篩選與已知蛋白互作的新蛋白，從而構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，對(duì)研究基因功能及分子機(jī)制具有重要意義^［21］。番茄灰霉侵染過(guò)程是由多因子調(diào)控的抗性反應(yīng)，構(gòu)建酵母文庫(kù)，通過(guò)篩選，有利于獲得與灰霉菌侵染相關(guān)的目標(biāo)蛋白。因此，構(gòu)建的酵母文庫(kù)的質(zhì)量直接影響篩選的結(jié)果。目前，對(duì)于酵母文庫(kù)質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)主要是文庫(kù)的庫(kù)容和重組率^［22］。本研究通過(guò)對(duì)番茄葉片進(jìn)行灰霉菌侵染，對(duì)侵染后的葉片采用三框法構(gòu)建cDNA文庫(kù)，文庫(kù)庫(kù)容為1.5×10⁶ CFU，文庫(kù)插入片段大小在500～2 000 bp，重組率為98%。上述指標(biāo)表明本研究構(gòu)建的文庫(kù)符合酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的要求^［22］，且文庫(kù)構(gòu)建完整，可用于后續(xù)篩庫(kù)。

bZIP轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中分布最廣的轉(zhuǎn)錄因子，已有研究表明該轉(zhuǎn)錄因子參與病原菌防御響應(yīng)，尤其是腐生型真菌灰霉菌。其中，擬南芥中的轉(zhuǎn)錄因子TGA2、TGA5、TGA6不僅調(diào)節(jié)活體型病原菌引起的系統(tǒng)性獲得性抗性，而且對(duì)于腐生型病原菌的激活至關(guān)重要。tga256的缺失突變體表現(xiàn)灰霉感病性^［23］。bZIP轉(zhuǎn)錄因子vip1突變體及SRDX抑制株均表現(xiàn)為灰霉感病性^［24］。番茄中的bZIP轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)菌和病毒侵染脅迫條件下表現(xiàn)出不同程度的被誘導(dǎo)表達(dá)，表明該類轉(zhuǎn)錄因子可能參與了調(diào)控番茄逆境脅迫條件下的防御應(yīng)答反應(yīng)^［25］。此外，番茄bZIP轉(zhuǎn)錄因子SlbZIP1在灰霉菌脅迫下表達(dá)上調(diào)，并且筆者在前期感病番茄Moneymaker灰霉菌侵染轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)該基因轉(zhuǎn)錄水平的確在灰霉菌侵后升高。因此，本研究以受灰霉菌誘導(dǎo)表達(dá)的SlbZIP1為誘餌，篩選到了與之互作的bZIP轉(zhuǎn)錄因子、氧化還原蛋白、鈣調(diào)蛋白、膜脂蛋白等。

由誘餌SlbZIP1篩選到的小分子的氧化還原蛋白谷氧還蛋白GRX普遍參與灰霉菌防御反應(yīng)，眾多研究報(bào)道了bZIP轉(zhuǎn)錄因子與谷氧還蛋白間的互作。Ruan等研究發(fā)現(xiàn)，木薯中的bZIP轉(zhuǎn)錄因子MeTGA074與MeGRXC15相互作用^［26］。艾蒿中分離出的bZIP轉(zhuǎn)錄因子MpTGA與谷氧還蛋白MpROXY1/2相互作用^［27］。擬南芥中的TGA2是GRX480的互作伴侶^［28］。以上眾多的證據(jù)均是通過(guò)在酵母或者植物體內(nèi)直接驗(yàn)證了bZIP轉(zhuǎn)錄因子與谷氧還蛋白的互作，而本研究是在番茄灰霉菌侵染下通過(guò)篩庫(kù)篩選到谷氧還蛋白，并且在酵母體內(nèi)再次驗(yàn)證了兩者之間的互作，表明SlbZIP1轉(zhuǎn)錄因子的確與谷氧還蛋白互作參與灰霉菌防御反應(yīng)。此外，還篩選到bZIP的轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子極易與自身或者其他的轉(zhuǎn)錄因子形成同源或者異源二聚體共同參與防御過(guò)程^［29］。鈣調(diào)蛋白作為潛在的互作蛋白，更多的是參與活體型真菌白粉菌的防御反應(yīng)^［30］，但是在酵母驗(yàn)證試驗(yàn)中，bZIP與鈣調(diào)蛋白也是存在較弱的互作，但這種互作并未在植物體中進(jìn)行驗(yàn)證，有待于后續(xù)研究。

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