靈芝育種技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展

關(guān)鍵詞：靈芝；育種技術(shù)；品種改良；食用菌；藥食同源真菌

0 引言

靈芝又稱(chēng)神芝、仙草、瑞草，廣義上指靈芝科（Ganodermataceae）的所有種類(lèi)，狹義上指被《中華人民共和國(guó)藥典》收錄、作為法定中藥材的赤芝（Ganodermalucidum）或紫芝（G.sinense）干燥子實(shí)體，是一類(lèi)大型的藥食同源真菌，被納入按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)目錄[1-2]。靈芝富含多糖、三萜、甾醇等多種活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗病毒、降血壓、保肝護(hù)肝、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等多種功效，已被廣泛應(yīng)用于功能性食品、保健食品和藥品等產(chǎn)業(yè)[3-8]。

隨著健康中國(guó)戰(zhàn)略的深入實(shí)施，我國(guó)大健康產(chǎn)業(yè)進(jìn)入高質(zhì)量發(fā)展階段，人們對(duì)大健康產(chǎn)品的需求越來(lái)越強(qiáng)烈，素有仙草之稱(chēng)的靈芝更是受到大眾青睞[9]。為滿足市場(chǎng)的需求，近年來(lái)，靈芝栽培規(guī)模逐年擴(kuò)大，精深加工產(chǎn)品涉及食品、醫(yī)藥、保健和護(hù)膚等領(lǐng)域，產(chǎn)品附加值不斷提升，對(duì)靈芝的品質(zhì)、產(chǎn)量等提出了更高的要求[10-12]。因此，通過(guò)創(chuàng)造遺傳變異來(lái)改良靈芝品種，培育出品質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量高、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣、易管理且遺傳穩(wěn)定的優(yōu)良新品種，是保障靈芝產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的重要基礎(chǔ)。目前，應(yīng)用于靈芝的主要育種方法有人工馴化栽培、人工選擇育種、誘變育種、雜交育種、細(xì)胞工程育種及基因工程育種等。

1 人工馴化栽培

XoFVv1PTwBn30IP8QH6IiXuvCkH/K63KfImIeuupu+4=靈芝人工馴化栽培是指將采集的野生靈芝，通過(guò)組織分離或孢子分離獲得菌株，再經(jīng)過(guò)人工栽培適應(yīng)性馴化，由野外自然生長(zhǎng)改為人工栽培的方法。20世紀(jì)60年代，我國(guó)首先將野生靈芝馴化栽培成功[13]。通過(guò)人工馴化栽培本地野生靈芝，既便于成功馴化，又可保護(hù)野生靈芝資源種群和生物遺傳多樣性。

王德芝等[14]通過(guò)對(duì)位于信陽(yáng)市南部楚豫交界處，屬大別山脈和桐柏山脈交匯間的雞公山地域的野生靈芝進(jìn)行馴化育種探索，對(duì)比試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，雞公山野生靈芝-1號(hào)菌種與泰山赤芝在形態(tài)色澤方面有差別，在營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件方面差別不大，顯示靈芝物種的多樣性，為靈芝雜交育種提供基因庫(kù)資源。何俊等[15]對(duì)采自云南省楚雄彝族自治州的滇中靈芝和采自云南省文山州的可食靈芝開(kāi)展生物學(xué)特性研究并馴化，研究發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)菌株子實(shí)體總?cè)坪投嗵呛烤哂凇吨腥A人民共和國(guó)藥典》（2020年版）要求，并通過(guò)開(kāi)袋覆土栽培方法，首次成功馴化滇中靈芝和可食靈芝，為靈芝育種研究提供了新的種質(zhì)資源。

2 人工選擇育種

靈芝人工選擇育種是指通過(guò)組織分離、菌種篩選、純化復(fù)壯，篩選出優(yōu)良靈芝菌株，再經(jīng)過(guò)人工栽培試驗(yàn)獲得產(chǎn)量高、抗性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)豐富靈芝品種的方法。人工選擇育種需要在有大量親本的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)一代一代的定向選擇培育，將優(yōu)良性狀不斷擴(kuò)大，耗時(shí)長(zhǎng)，突變率低，是各育種方法的基礎(chǔ)。

賀黎銘等[16]采用系統(tǒng)選育法，從野生靈芝菌株中選育出綜合性狀優(yōu)良的靈芝菌株藥赤芝1號(hào)，并對(duì)其進(jìn)行連續(xù)2年的多點(diǎn)品比試驗(yàn)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株具有遺傳性狀穩(wěn)定、適應(yīng)性強(qiáng)、生產(chǎn)周期較短、產(chǎn)量高和內(nèi)在品質(zhì)優(yōu)的特點(diǎn)，并且浸出物、多糖、三萜及甾醇含量關(guān)鍵指標(biāo)均顯著高于對(duì)照。唐明先等[17]通過(guò)采集野生藏靈芝，結(jié)合系統(tǒng)選育，將分離、純化的菌株進(jìn)行出芝篩選試驗(yàn)，篩選出出芝整齊、農(nóng)藝性狀穩(wěn)定且遺傳穩(wěn)定性高的優(yōu)良菌株，經(jīng)鑒定該菌株為白肉靈芝，功能成分含量較高，是靈芝新菌株。

3 誘變育種

靈芝誘變育種是指利用物理或化學(xué)因素誘導(dǎo)靈芝發(fā)生基因突變，產(chǎn)生遺傳變異，然后篩選出有利的變異體并保存育種。但是，并非所有基因突變都會(huì)朝著有利突變，更多的會(huì)是朝負(fù)向突變，因此需要花費(fèi)更多的時(shí)間和精力從所有突變體中篩選出有利的突變菌株[18]。

近年來(lái)，原生質(zhì)體技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食用菌的研究，由于原生質(zhì)體沒(méi)有細(xì)胞壁的障礙，常作為誘變育種的良好材料，可大大提升靈芝的突變效率[19]。

3.1 物理誘變

常見(jiàn)的物理誘變包括紫外線誘變、等離子體誘變、航天誘變等。劉月芹等[20]采用紫外燈照射靈芝原生質(zhì)體的誘變方式，經(jīng)過(guò)多次篩選與純化，篩選出能在37°C高溫下生長(zhǎng)的靈芝新菌株，為靈芝的基礎(chǔ)研究及其他耐高溫菌種的選育提供了一定的參考。李塬等[21]利用常壓室溫等離子體對(duì)靈芝菌株的原生質(zhì)體進(jìn)行誘變處理，經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)、拮抗試驗(yàn)和RAPD分子標(biāo)記分析，從眾多誘變菌株中篩選出高產(chǎn)多糖且遺傳穩(wěn)定性良好的新菌株。

隨著航天技術(shù)的快速發(fā)展，利用太空特殊環(huán)境誘變種子發(fā)生變異的育種方式不斷運(yùn)用于農(nóng)業(yè)微生物產(chǎn)業(yè)中[22-23]。王雪婷等[24]從搭載長(zhǎng)征五號(hào)B運(yùn)載火箭進(jìn)入太空進(jìn)行誘變處理的一號(hào)靈芝中分離純化得到7株誘變菌株，并對(duì)出發(fā)菌株和誘變菌株進(jìn)行拮抗試驗(yàn)、形態(tài)學(xué)特征觀察、出菇試驗(yàn)、分子生物學(xué)鑒定、同源性分析及菌株菌絲體液體發(fā)酵產(chǎn)總?cè)频哪芰y(cè)試，最終獲得1株原種菌絲生長(zhǎng)速度較快，并且具有高產(chǎn)總?cè)颇芰Φ恼T變菌株。

3.2 化學(xué)誘變

常見(jiàn)的化學(xué)誘變主要有氯化鋰、甲基磺酸乙酯（EMS）[25]、亞硝酸誘變。氯化鋰作為一種高效、低毒的化學(xué)誘變劑，經(jīng)常被用作誘變育種。董玉瑋等[26]采用化學(xué)誘變劑氯化鋰誘變赤靈芝原生質(zhì)體，篩選出高產(chǎn)三萜類(lèi)的菌株，經(jīng)繼代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)誘變菌株遺傳性狀穩(wěn)定性良好。QUANLY等[27]采用濃度0.1mol/L的亞硝酸作為化學(xué)誘變劑，對(duì)靈芝菌絲體進(jìn)行誘變處理5min，獲得比原菌絲生長(zhǎng)能力更強(qiáng)的菌株。

3.3 復(fù)合誘變

近年來(lái)，越來(lái)越多研究人員采用物理誘變與物理誘變、化學(xué)誘變與物理誘變相結(jié)合的方式進(jìn)行復(fù)合誘變，提高正突變率[28]。李塬[29]利用紫外和ARTP誘變技術(shù)，對(duì)出發(fā)菌株的原生質(zhì)體進(jìn)行誘變處理，獲得高多糖的誘變菌株。劉曉丹等[30]利用紫外線和硫酸二乙酯逐級(jí)誘變處理1株產(chǎn)漆酶樹(shù)舌靈芝的菌絲片段，最終誘變獲得1株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)漆酶突變菌株，與原始菌株相比，漆酶活性提高63.3％，同時(shí)發(fā)酵周期縮短1d。

4 雜交育種

靈芝雜交育種是指以兩個(gè)或多個(gè)不同基因型的靈芝菌株作為親本，通過(guò)擔(dān)孢子雜交將親本基因結(jié)合，從而獲得兼具雙親優(yōu)勢(shì)并能穩(wěn)定遺傳的新菌株。靈芝的交配系統(tǒng)為四極性異宗結(jié)合，同核體種間交配不相容，自交不孕，雜交可孕[31]。雜交育種的關(guān)鍵是對(duì)優(yōu)勢(shì)親本進(jìn)行篩選，通常將野生菌株與地方栽培品種作為來(lái)源不同的親本，雜交培育出更多適合當(dāng)?shù)卦耘嗟膬?yōu)良靈芝菌株[32-33]。通過(guò)在人工條件下誘發(fā)靈芝孢子萌發(fā)，再?gòu)闹泻Y選出雜交育種所需的單核菌株，該方法育種時(shí)間較長(zhǎng)，工作量大，育種過(guò)程比較復(fù)雜，不易操作[34-35]。近年來(lái)，越來(lái)越多研究人員采用原生質(zhì)體單核化技術(shù)將雙核靈芝菌株單核化，用作雜交育種的親本材料[36]。靈芝雜交育種中常見(jiàn)的方式為單孢雜交和雙單雜交。

4.1 單孢雜交

單孢雜交是指將可親和的兩株不同遺傳背景的單核體作為親本進(jìn)行雜交的方式。LIUS等[37]從兩個(gè)商業(yè)品種靈芝JC和AL菌株的擔(dān)孢子中各成功分離獲得19個(gè)和12個(gè)單核體，兩個(gè)菌株的228個(gè)（19×12）單核體雜交中，有83個(gè)成功（性相容）從中分離出68個(gè)雜交種，選擇32個(gè)菌絲長(zhǎng)勢(shì)較好的雜交種培養(yǎng)成子實(shí)體，最終篩選出1株多糖（16.63mg/g干質(zhì)量）和三萜含量均高（10.50mg/g干質(zhì)量）的雜交菌株H-23。吳芳等[38]以赤芝與中華靈芝為親本，將從兩個(gè)親本的擔(dān)孢子中分離的單核體進(jìn)行雜交，得到39個(gè)雜交菌株，通過(guò)篩選獲得生物學(xué)特性與產(chǎn)量較優(yōu)的兩個(gè)雜交菌株GH07和GH09，均具有菌柄較短、正品率高、生物轉(zhuǎn)化率高和產(chǎn)孢量高等特點(diǎn)，成功選育了赤芝與中華靈芝的雜交菌株。叢倩倩等[39]以國(guó)家認(rèn)定品種泰山赤靈芝1號(hào)（TL-1）和野生靈芝菌株4895為親本，通過(guò)原生質(zhì)體單核化雜交育種技術(shù)選育出一株比親本TL-1具有更大優(yōu)勢(shì)的靈芝新品種TL-3，其平均單產(chǎn)提高12.23％、生物學(xué)效率提高12.37％，子實(shí)體多糖和三萜含量分別提高1.87％和37.5％。

4.2 雙單雜交

雙單雜交是指將一株單核菌絲和另一株雙核菌絲作為親本進(jìn)行雜交的方式，又稱(chēng)單核體×雙核體雜交育種。雙單雜交與單單雜交在親本的選擇上雖然不同，但兩者雜交本質(zhì)均為單單雜交[33]。仇昊等[40]以赤芝和白肉靈芝（G.leucocontextum）為親本，采用亮蓋靈芝異核體雙核菌絲與通過(guò)原生質(zhì)體單核化獲得的白肉靈芝單核體進(jìn)行雙單雜交，最終獲得34株雜交子；采用ISSR技術(shù)對(duì)34株雜交子及親本進(jìn)行DNA多態(tài)性聚類(lèi)分析，雜交子主要分為兩個(gè)類(lèi)群；對(duì)雜交子進(jìn)行生長(zhǎng)速度和靈芝酸含量對(duì)比，篩選到4株優(yōu)質(zhì)雜交子；繼而進(jìn)行雜交子及親本間HPLC指紋圖譜對(duì)比，發(fā)現(xiàn)4株雜交子中有3株HPLC指紋圖譜在具備兩個(gè)親本特征靈芝酸的同時(shí)，還有低極性靈芝酸的產(chǎn)生。

5 細(xì)胞工程育種

靈芝細(xì)胞工程育種是指將兩個(gè)或多個(gè)來(lái)源不同的靈芝原生質(zhì)體，采用自發(fā)融合或者人工誘導(dǎo)融合，克服細(xì)胞不親和的障礙，獲得具有重組基因的優(yōu)勢(shì)雜種菌株。常見(jiàn)的人工誘導(dǎo)方法有物理誘導(dǎo)融合和化學(xué)誘導(dǎo)融合。

5.1 物理誘導(dǎo)融合

常見(jiàn)的物理誘導(dǎo)融合方法主要是電融合法。高明俠等[41]采用靈芝原生質(zhì)體電融合技術(shù)選育高產(chǎn)多糖菌株，通過(guò)電融合方法對(duì)紫芝和赤芝原生質(zhì)體電融合條件進(jìn)行了研究，表明靈芝原生質(zhì)體電融合的最佳條件為脈沖強(qiáng)度10kV、脈沖間隙24μs、脈沖次數(shù)3次/s，最高融合率0.038%。發(fā)酵結(jié)果顯示，選育的融合菌株GL-18的生物量和多糖含量均高于親本菌株。陳合等[42]通過(guò)電融合法對(duì)白芝（Ganodermaapplanatum）和赤芝原生質(zhì)體融合條件進(jìn)行了研究，表明靈芝原生質(zhì)體電融合的最佳條件為交變電流頻率2MHz、電壓40V、直流脈沖脈幅10kV/cm、脈寬25μs及直流電壓500V，融合率可達(dá)40%。

5.2 化學(xué)誘導(dǎo)融合

化學(xué)誘導(dǎo)融合方法中常用的融合劑主要有聚乙二醇（PEG）、甲基磺酸乙酯（EMS）。陳小紅等[43]以茯苓和靈芝為親本菌株，PEG作為原生質(zhì)體融合劑，研究茯苓與靈芝原生質(zhì)體的融合育種條件和構(gòu)建茯苓育種的漆酶轉(zhuǎn)化體系，研究發(fā)現(xiàn)，原生質(zhì)體融合的最佳條件為25%PEG4000、pH值8.5、35°C和20min，篩選獲得了具有茯苓遺傳性狀、與靈芝的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)但具備部分靈芝遺傳性狀的穩(wěn)定融合菌株，并且測(cè)定表明親本靈芝的產(chǎn)漆酶性狀轉(zhuǎn)移到了融合菌株中。馬欣燕[44]采用原生質(zhì)體融合育種技術(shù)，對(duì)印度塊菌和赤芝的原生質(zhì)體制備、再生及融合條件進(jìn)行了研究，其最佳融合條件為30%PEG6000、40mmol/LCa2+、30°C和pH值8.0融合25min，融合率達(dá)8.43×10?7；經(jīng)菌落表型、菌絲形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)速度的對(duì)比及結(jié)合RAPD、ERIC分子標(biāo)記等方法進(jìn)行鑒定，兩融合子是親本的融合產(chǎn)物，融合子Ra與印度塊菌親緣關(guān)系最近，融合子Rb則與赤芝的親緣關(guān)系更近。

6 基因工程育種

靈芝基因工程育種是指將特定的基因片段通過(guò)載體導(dǎo)入到靈芝細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過(guò)復(fù)制、表達(dá)，獲得具有特定遺傳性狀的靈芝新品種。CRISPR/Cas9具有介導(dǎo)高效、高精度基因組修飾的能力，是分子育種的有力工具，已成功應(yīng)用于多種食用菌，不僅比傳統(tǒng)育種方法更方便，而且效率更高[45-46]。利用基因工程育種，不僅可以提高靈芝中多糖、靈芝酸等含量，還可以將腫瘤壞死因子、自介素-2等基因?qū)腱`芝中并使之高效表達(dá)，以進(jìn)一步提高靈芝的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤方面的功效[47]。

秦浩[48]首次在靈芝中建立了CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)，使得靈芝ura3基因產(chǎn)生雙鏈斷裂，并誘導(dǎo)兩株靈芝菌株中產(chǎn)生了ura3中斷菌株，同現(xiàn)有應(yīng)用的基因中斷技術(shù)相比，具有操作便捷、適用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以在通過(guò)傳統(tǒng)的同源重組方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)的菌株中進(jìn)行基因中斷。TANY等[49]利用靈芝栽培品種滬農(nóng)靈芝1號(hào)的單核菌株L1構(gòu)建并優(yōu)化了一種RNP介導(dǎo)的靈芝菌株CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)，揭示了核酸內(nèi)切酶Cas9誘導(dǎo)修復(fù)DNA雙鏈斷裂的特性：大部分通過(guò)非同源末端連接修復(fù)，少部分通過(guò)微同源末端連接修復(fù)，并利用該系統(tǒng)編輯了兩個(gè)靈芝菌株基因cyp512a3和cyp5359n1，對(duì)靈芝的定向育種和合成代謝調(diào)控具有重要意義。WANGPA等[50]在靈芝中構(gòu)建了三萜類(lèi)靈芝酸生物合成功能基因的CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)，建立的系統(tǒng)用于細(xì)胞色素P450基因cyp515018，測(cè)序確認(rèn)獲得了精確編輯的cyp515018突變體，并對(duì)野生型（WT）和突變體的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)與WT相比，突變體中鑒定的4種三萜類(lèi)靈芝酸的濃度顯著降低；利用已建立的基于CRISPRCas9的G.lucidum基因編輯平臺(tái)，22，23-角鯊烯二氧化素cyp505d13也被破壞，為靈芝菌種分子選育及其他擔(dān)子菌菌種的生物技術(shù)應(yīng)用提供參考。

7 結(jié)束語(yǔ)

目前，靈芝育種技術(shù)不斷改進(jìn)，育種方法多樣。傳統(tǒng)的靈芝育種技術(shù)如馴化栽培、人工選育、誘變育種和雜交育種，雖然方法簡(jiǎn)單，但獲得的正向突變菌株少，需要篩選大量菌株，耗時(shí)長(zhǎng)、效率低。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多研究人員將新技術(shù)與傳統(tǒng)育種方法相結(jié)合，采用多種育種方法交叉結(jié)合，將分子標(biāo)記、基因編輯等技術(shù)應(yīng)用在靈芝育種中，實(shí)現(xiàn)靶向育種，大大提高了目標(biāo)菌株的育種效率，但因其技術(shù)難度大，體系尚不成熟。盡管靈芝育種方法日趨豐富，育種環(huán)節(jié)仍然是整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈的薄弱環(huán)節(jié)，靈芝生理代謝機(jī)制研究不夠深入、品種分類(lèi)不清晰和命名較亂、缺乏新品種審定機(jī)制和平臺(tái)、育種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)不足等問(wèn)題制約著靈芝種業(yè)發(fā)展。

未來(lái)靈芝市場(chǎng)對(duì)靈芝品種的選育基于農(nóng)藝性狀、栽培繁育等方面，其具有的藥用活性成分如多糖、三萜等含量逐漸成為選育的重要方向。要建立成熟的靈芝育種體系，保障靈芝產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展，需著力加強(qiáng)如下3方面工作。一是要持續(xù)加強(qiáng)育種技術(shù)的研究。改良傳統(tǒng)育種方法，將新型物理、化學(xué)、生物技術(shù)與傳統(tǒng)育種方法相結(jié)合，建立高通量篩選方法，提高育種效率。二是拓展靈芝研究領(lǐng)域，如靈芝生長(zhǎng)機(jī)制及遺傳特性的基礎(chǔ)研究、影響農(nóng)藝性狀的分子機(jī)制研究、靈芝栽培品種分類(lèi)等方面的研究，提高育種精準(zhǔn)度。三是完善靈芝新品種保護(hù)和品種審定、登記等管理制度，引導(dǎo)靈芝育種市場(chǎng)化、產(chǎn)業(yè)化、規(guī)范化和高質(zhì)化發(fā)展。