乳酸菌接種發(fā)酵對(duì)耿馬酸肉品質(zhì)的影響

摘 要：為提高耿馬酸肉的品質(zhì)和安全性，將植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）GMSR-4、戊糖乳桿菌（Lactiplantibacillus pentosus）GMSR-20和植物乳植桿菌GMSR-35按體積比1∶2∶2、接種量3%接種到耿馬酸肉中，同時(shí)設(shè)置對(duì)照（control check，CK）組，在25 ℃發(fā)酵6 d，測(cè)定2 組樣品理化指標(biāo)、微生物數(shù)量和感官品質(zhì)的變化。結(jié)果表明，接種發(fā)酵（inoculated fermentation，IF）組的亞硝酸鹽殘留量、水分含量、pH值、生物胺總量、腐胺、尸胺、亞精胺、酪胺、苯乙胺和色胺含量顯著低于CK組（P＜0.05），菌落總數(shù)和乳酸菌數(shù)顯著高于CK組

（P＜0.05），大腸菌群數(shù)顯著低于CK組（P＜0.05），IF組的各個(gè)感官指標(biāo)評(píng)分均高于CK組。綜上，人工接種發(fā)酵可提高耿馬酸肉的食用品質(zhì)和安全性。

關(guān)鍵詞：耿馬酸肉；乳酸菌；微生物；生物胺；安全性

Effects of Inoculated Fermentation with Lactic Acid Bacteria on the Quality of Gengma Sour Meat

WU Chunxia1， SHI Youquan2， YANG Yan1，3， WANG Qi1，4， SHI Lifen1， NIAN Xuruo1， PENG Tingting1， CHEN Tao1，*

（1. College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China; 2. Yunnan Provincial Light & Textile Design Institute Co. Ltd.， Kunming 650041， China; 3. School of Tourism， Kunming University， Kunming 650214， China;

4. College of Wuliangye Technology and Food Engineering， Yibin Vocational and Technical College， Yibin 644003， China）

Abstract： To improve the quality and safety of Gengma sour meat， Lactiplantibacillus plantarum GMSR-4， Lactiplantibacillus pentosus GMSR-20 and L. plantarum GMSR-35 with a ratio of 1：2：2 （V/V） were inoculated at an inoculum size of 3%. Uninoculated samples were used as a control. After 6 days of fermentation at 25 ℃， changes in physicochemical indexes， microbial load and sensory quality were measured between the inoculated fermentation （IF） and control groups. The results indicated that the levels of residualhKU4BLX7qjDb1iTgTWfs6nTOq/1GC2PXGv8Qj3ZYlKU= nitrite， moisture， pH， total biogenic amines， putrescine， cadaverine， spermidine， tyramine， phenethylamine and tryptamine were significantly lower and the counts of total bacteria and lactic acid bacteria were significantly higher in the IF group than in the control group （P < 0.05）. Moreover， the number of coliforms was significantly lower （P < 0.05） and sensory scores for various attributes were higher in the IF group than in the control group. In conclusion， inoculated fermentation can improve the eating quality and safety of

Gengma sour meat.

Keywords： Gengma sour meat; lactaria acid bacteria; microorganism; biogenic amines; safety

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240806-201

中圖分類號(hào)：TS251.5＋1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2024）11-0018-05

引文格式：

吳春霞， 石有權(quán)， 楊雁， 等. 乳酸菌接種發(fā)酵對(duì)耿馬酸肉品質(zhì)的影響[J]. 肉類研究， 2024， 38（11）： 18-22. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240806-201. http：//www.rlyj.net.cn

WU Chunxia， SHI Youquan， YANG Yan， et al. Effects of inoculated fermentation with lactic acid bacteria on the quality of gengma sour meat[J]. Meat Research， 2024， 38（11）： 18-22. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240806-201. http：//www.rlyj.net.cn

中國(guó)傳統(tǒng)酸肉是一種熟食、發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)的發(fā)酵肉制品。耿馬酸肉是云南省臨滄市耿馬縣當(dāng)?shù)靥厣陌l(fā)酵肉制品，當(dāng)?shù)鼐用裰饕陨碁橹?，也可蒸熟后食用。耿馬酸肉是由剁碎的豬瘦肉、熟豬皮條及輔料混勻后，用新鮮柊葉包裹發(fā)酵2～6 d而成。據(jù)報(bào)道，一些即食發(fā)酵肉制品可能存在生物胺中毒和致病菌致病的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]，某些傳統(tǒng)酸肉中也檢出較高含量的生物胺和較多數(shù)量的致病菌[3-5]。目前，接種發(fā)酵是提高酸肉食用品質(zhì)和安全性常見的方法之一，如Zhang Yunlong等[6]研究表明，湘西酸肉接種彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）可減少成品中的大腸菌群數(shù)、生物胺和總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量。牦牛酸肉接種植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）M1和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y26可提高氨基酸含量，同時(shí)降低大腸菌群數(shù)、TVB-N含量和亞硝酸鹽殘留量[7]。上述研究結(jié)果均表明，人工接種發(fā)酵可提高酸肉的食用品質(zhì)和安全性，而目前關(guān)于乳酸菌對(duì)耿馬酸肉的食用品質(zhì)和安全性的影響相關(guān)報(bào)道較少。因此，本研究選用從傳統(tǒng)耿馬酸肉中篩選出的3 株乳酸菌經(jīng)復(fù)配后接種于耿馬酸肉中進(jìn)行發(fā)酵，并以自然發(fā)酵的耿馬酸肉為對(duì)照，通過分析其理化指標(biāo)、微生物和感官品質(zhì)的變化，探究人工接種發(fā)酵對(duì)耿馬酸肉品質(zhì)和安全性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬瘦肉、豬皮、味精、食鹽購(gòu)于云南省昆明市朗悅灣尚購(gòu)超市；糯米、新鮮柊葉購(gòu)于耿馬縣農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。本研究所采用的菌株（植物乳植桿菌GMSR-4、戊糖乳桿菌（Lactiplantibacillus pentosus）GMSR-20、植物乳植桿菌GMSR-35）由實(shí)驗(yàn)室前期從傳統(tǒng)耿馬酸肉中篩選所得。

8 種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 南通飛宇生物科技有限公司；17 種游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；衍生試劑盒 美國(guó)沃特世科技有限公司；乙腈、甲醇、甲酸、磺基水楊酸、檸檬酸三鈉（均為分析純） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基、亞硒酸鹽胱氨酸增菌培養(yǎng)基、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、賴氨酸脫酸酶肉湯培養(yǎng)基、李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基、煌綠乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基、MRS肉湯、MRS培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Vanquish超高壓液相色譜儀、Q Exactive質(zhì)譜儀

美國(guó)賽默飛世爾科技公司；5430R低溫高速離心機(jī)

德國(guó)艾本德公司；Tissuelyser-48組織破碎儀 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SHP-350生化培養(yǎng)箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；Biochrom 30＋氨基酸自動(dòng)分析儀 英國(guó)柏楉有限公司；HD-3A智能水分活度測(cè)定儀 無錫市華科儀器儀表有限公司；U-2910紫外-可見分光光度計(jì) 日本日立公司；TA-2XJP細(xì)菌濁度計(jì) 北京天安聯(lián)合科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與制備

將3 株乳酸菌從－80 ℃冰箱取出，在無菌條件下，取200 μL菌液接入MRS肉湯中活化，連續(xù)培養(yǎng)3 代，將第3代菌液在4 ℃、10 000×g下離心15 min，沉淀物用無菌生理鹽水洗滌3 次，再用無菌生理鹽水和細(xì)菌濁度計(jì)將菌液的濃度調(diào)整為107 CFU/mL，備用[8]。

1.3.2 耿馬酸肉的制作

耿馬酸肉基本配方：剁碎的豬瘦肉、熟豬皮條質(zhì)量比7∶3，5%食鹽、5%糯米飯、0.01%亞硝酸鈉、0.05%味精，均以剁碎的豬瘦肉和熟豬皮條總質(zhì)量計(jì)，新鮮柊葉若干，制作流程見圖1。

1.3.3 耿馬酸肉的分組與采樣

實(shí)驗(yàn)分組：1）接種發(fā)酵（inoculation fermentation，IF）組：接種3% 107 CFU/mL的復(fù)配菌液（植物乳植桿菌GMSR-4、戊糖乳桿菌GMSR-20、植物乳植桿菌GMSR-35

菌液體積比1∶2∶2，該比例由前期實(shí)驗(yàn)篩選得出，在此比例下，耿馬酸肉的品質(zhì)和安全性最高）；2）對(duì)照（control check，CK）組：不接種菌液。2 組均在25 ℃下發(fā)酵6 d。

樣品采集：選取發(fā)酵結(jié)束后的耿馬酸肉樣品進(jìn)行采樣。感官評(píng)分和pH值在取樣后1 h內(nèi)測(cè)定；用于測(cè)定微生物的樣品在無菌操作臺(tái)上取樣并置于－80 ℃貯藏，用于其他理化指標(biāo)、游離氨基酸和生物胺含量測(cè)定的樣品置于－20 ℃貯藏，備用，所有指標(biāo)的樣品重復(fù)數(shù)為4。

1.3.4 耿馬酸肉理化指標(biāo)測(cè)定

pH值：參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測(cè)定》；水分含量：參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》；亞硝酸鹽殘留量：參照GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》；TVB-N含量：參照GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》。

1.3.5 耿馬酸肉中游離氨基酸含量測(cè)定

游離氨基酸：參考Zhong Aiai等[9]的方法，稍作修改。準(zhǔn)確稱取2.0 g耿馬酸肉樣品，加20 mL純水均質(zhì)后移至50 mL容量瓶，定容至刻度，混勻，4 ℃放置24 h。取20 mL上清液于100 mL離心管中，加入20 mL 5 g/100 mL磺基水楊酸溶液，混勻，4 ℃、6 000×g離心10 min，取20 mL上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干，加入1 mL 0.2 mol/L檸檬酸鈉緩沖液溶解后用0.45 μm濾膜過濾，濾液用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。

1.3.6 耿馬酸肉中微生物測(cè)定

菌落總數(shù)：參照GB 4789.2—2022《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》；乳酸菌：參照GB 4789.35—2023《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》；大腸菌群：參照GB 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》；沙門氏菌：參照GB 4789.4—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（以下簡(jiǎn)稱李斯特菌）：參照GB 4789.30—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》；金黃色葡萄球菌：參照GB 4789.10—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》。

1.3.7 耿馬酸肉中生物胺含量測(cè)定

參考Guba[10]、Armenta[11]等的方法，稍作修改。取0.1 g耿馬酸肉于離心管中，加入0.5 mL 0.1 mol/L鹽酸，渦旋混勻，室溫提取1 h；在4 ℃、12 000 r/min下離心10 min，上清液稀釋3 倍；取10 μL稀釋液到2 mL EP管中，加入70 uL AccQ·Tag Ultra Borate緩沖液和20 μL AccQ·Tag試劑，混勻；將混合物于55 ℃金屬加熱器上加熱10 min，冷卻至室溫，用超高壓液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。儀器參數(shù)：Water BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫55 ℃；進(jìn)樣量1 μL，流速0.5 mL/min，流動(dòng)相A：超純水（含0.1%甲酸）；流動(dòng)相B：乙腈（含0.1%甲酸）。洗脫程序：0 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)95%，0～5.5 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)由95%降至90%，5.5～7.5 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)由90%降至75%，7.5～8 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)由75%降至40%，8～8.5 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)由40%升至95%，8.5～9.5 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)95%。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源；鞘氣壓力40 arb；輔助氣壓力10 arb；離子噴霧電壓3 000 V；溫度350 ℃；離子傳輸管溫度320 ℃；掃描模式為全掃描模式，掃描方式為正離子，掃描范圍150～700 Da。

1.3.8 耿馬酸肉感官評(píng)定

2 組樣品用蒸汽鍋蒸煮30 min，剝開柊葉切成薄片。評(píng)分人員由15 名食品專業(yè)在讀碩士研究生組成，在進(jìn)行感官評(píng)分時(shí)不得相互交談，更換樣品時(shí)用礦泉水漱口，滿分為10 分，評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 25.0進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)，Origin 2021進(jìn)行繪圖，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 人工接種發(fā)酵對(duì)耿馬酸肉理化指標(biāo)的影響

由表2可知，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，CK組耿馬酸肉的pH值顯著高于IF組（P＜0.05）。CK組中的微生物來源于原料和環(huán)境中，發(fā)酵較為緩慢，而IF組一開始就接種了大量的乳酸菌，乳酸菌利用碳水化合物快速產(chǎn)生有機(jī)酸，因此發(fā)酵快，pH值較低。Lü Jing等[12]在發(fā)酵的侗族酸肉中接種釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）LXPSC1，導(dǎo)致pH值顯著高于自然發(fā)酵，與本研究結(jié)果不一致，可能是與所接種的菌不同有關(guān)。IF組耿馬酸肉的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于CK組（P＜0.05），可能與IF組的pH值顯著低于CK組有關(guān)。據(jù)報(bào)道，新鮮豬肉中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由氫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用及二硫鍵組成，在發(fā)酵過程中，較低的pH值使這幾種作用力對(duì)蛋白三維結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)比例發(fā)生變化，從而改變蛋白質(zhì)與水的結(jié)合能力[13]，使耿馬酸肉中的水分減少。小鼠實(shí)驗(yàn)表明，高劑量的亞硝酸鹽可造成胎兒腦損傷、胎兒缺氧和流產(chǎn)等不可逆影響[14]。CK組和IF組耿馬酸肉的亞硝酸鹽殘留量均低于GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中發(fā)酵肉制品最大殘留量（30 mg/kg），CK組耿馬酸肉的亞硝酸鹽殘留量是IF組的2.38 倍，表明接種乳酸菌可減少亞硝酸鹽在耿馬酸肉中的積累，這與Hu Xinyu等[15]在發(fā)酵泡菜中的研究結(jié)果一致。TVB-N含量是評(píng)價(jià)肉制品新鮮度的指標(biāo)之一，TVB-N含量越高，表明動(dòng)物性食品的腐敗程度越高[16]。IF組耿馬酸肉的TVB-N含量顯著低于CK組（P＜0.05），較低的pH值和水分含量可抑制腐敗菌的生長(zhǎng)，從而減少胺和氨類物質(zhì)的生成量。

2.2 人工接種發(fā)酵對(duì)耿馬酸肉游離氨基酸含量的影響

由表3可知，CK組和IF組耿馬酸肉均檢出17 種游離氨基酸，其中僅CK組中的精氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和游離氨基酸總量顯著低于IF組（P＜0.05），其余游離氨基酸含量差異不顯著。2 組間大部分游離氨基酸含量差異不顯著，可能是發(fā)酵時(shí)間較短（僅為6 d）所致。一般而言，發(fā)酵食品的發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)品中的游離氨基酸含量越高，如發(fā)酵300 d的三川火腿中的游離氨基酸含量遠(yuǎn)高于發(fā)酵0 d的樣品[17]。

2.3 人工接種發(fā)酵對(duì)耿馬酸肉中微生物的影響

耿馬酸肉富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而引發(fā)腐敗，因此微生物指標(biāo)是衡量耿馬酸肉安全性的主要指標(biāo)之一。由表4可知，CK組耿馬酸肉的菌落總數(shù)和乳酸菌數(shù)顯著低于IF組（P＜0.05），與Hongthong等[18]接種植物乳桿菌發(fā)酵Isan（一種發(fā)酵香腸）的結(jié)果一致。CK組和IF組均未檢測(cè)到沙門氏菌和李斯特菌；CK組中檢出＜10 CFU/g的金黃色葡萄球菌，IF組中未檢測(cè)到。IF組的大腸菌群數(shù)顯著低于CK組

（P＜0.05），其中，CK組中大腸菌群數(shù)是IF組的

1.47 倍。其原因可能是：1）適當(dāng)?shù)乃趾亢蚿H值是致病菌生長(zhǎng)繁殖的重要條件，IF組的水分含量和pH值顯著低于CK組（表2），而較低的水分含量和pH值不利于金黃色葡萄球菌和大腸菌群的增殖；2）IF組中的乳酸菌數(shù)顯著高于CK組，乳酸菌對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸菌群具有抑制作用。李廷任等[4]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接種發(fā)酵可有效抑制酸肉中大腸菌群的數(shù)量。Tangwatcharin等[19]在接種植物乳桿菌發(fā)酵的Moo Som中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。

2.4 人工接種發(fā)酵對(duì)耿馬酸肉生物胺含量的影響

由表5可知，CK組耿馬酸肉可檢出組胺、精胺、腐胺、尸胺、亞精胺、酪胺、苯乙胺、色胺8 種生物胺，IF組中可檢出7 種生物胺，未檢測(cè)到組胺。2 組間除精胺外，所有生物胺含量均具有顯著差異（P＜0.05）。據(jù)報(bào)道，精胺是發(fā)酵肉制品中天然存在的生物胺，其含量不會(huì)隨環(huán)境的變化而變化[20]。CK組的生物胺總量顯著高于IF組（P＜0.05），大約是IF組的2.6 倍。其原因有二：一是CK組中的乳酸菌數(shù)顯著低于IF組（P＜0.05），乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素和有機(jī)酸可抑制產(chǎn)胺微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而抑制氨基酸脫羧酶的活性，使生物胺的生成量

減少[21]；二是據(jù)報(bào)道，金黃色葡萄球菌和大腸菌群可產(chǎn)生多種生物胺[22-23]，而CK組的大腸菌群數(shù)和金黃色葡萄球菌數(shù)顯著高于IF組（P＜0.05），表明接種發(fā)酵可以減少生物胺的積累，這與接種發(fā)酵可減少泰國(guó)發(fā)酵肉Moo Som[24]、Nham[25-26]等中生物胺積累的報(bào)道結(jié)果一致。

2.5 人工接種發(fā)酵對(duì)耿馬酸肉感官品質(zhì)的影響

由圖2可知，IF組耿馬酸肉的外觀、組織形態(tài)、色澤、氣味、口感、滋味和整體接受度評(píng)分均高于CK組。在接種解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）的侗族酸肉中也得出類似的結(jié)果，接種發(fā)酵的侗族酸肉色澤、組織形態(tài)、滋味和總體接受度等感官指標(biāo)評(píng)分均高于自然發(fā)酵組[27]。

3 結(jié) 論

IF組耿馬酸肉產(chǎn)品的pH值、水分含量、亞硝酸鹽殘留量和TVB-N含量均顯著低于CK組（P＜0.05）；菌落總數(shù)和乳酸菌數(shù)顯著高于CK組（P＜0.05），大腸菌群數(shù)顯著低于CK組（P＜0.05），沙門氏菌和李斯特菌在IF組和CK組均未檢測(cè)到；接種發(fā)酵對(duì)大多數(shù)游離氨基酸含量影響不顯著（P＜0.05），可明顯減少生物胺的含量。綜上，人工接種發(fā)酵可抑制致病菌的生長(zhǎng)，減少生物胺的積累，提高耿馬酸肉的食用品質(zhì)和安全。

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收稿日期：2024-08-06

基金項(xiàng)目：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)科研發(fā)展基金項(xiàng)目（KX900127000）

第一作者簡(jiǎn)介：吳春霞（1998—）（ORCID： 0009-0009-3503-5725），女，碩士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。

E-mail： 3124346853@qq.com

*通信作者簡(jiǎn)介：陳韜（1963—）（ORCID： 0000-0002-2066-0001），男，教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。

E-mail： chentao63@163.com