樹生黃單胞菌李致病變種兩種PCR檢測方法的建立

摘要樹生黃單胞菌李致病變種Xanthomonas arboricola pv. pruni （Xap）是桃、李生產(chǎn)中最具毀滅性的病原細菌之一。為了快速準確地檢測Xap，本研究以其編碼基因L1B16_06350的5′端序列（611 bp）為檢測靶標，開發(fā)了常規(guī)PCR和TaqMan實時PCR檢測方法。這兩種方法與樹生黃單胞菌胡桃致病變種X.arboricola pv. juglandis等8個不同屬的11種細菌均沒有交叉反應，其中常規(guī)PCR檢測極限為10-2 ng，TaqMan探針法為10-3 ng，表現(xiàn)高度的靈敏度和特異性。利用田間樣品進行測試，結(jié)果證實兩種檢測方法均可應用于Xap的常規(guī)檢測。

關(guān)鍵詞樹生黃單胞菌李致病變種;常規(guī)PCR;TaqMan探針法;特異性;靈敏度

中圖分類號：S 436.62文獻標識碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023589Two specific PCR assays for detection of Xanthomonas arboricola pv. pruniYANG Wendi MA Yuchao WANG Jinpeng SHEN Jianguo REN Zhengguang YANG Haiqing LI Weimin（1. Department of Plant Protection， Beijing University of Agriculture， Key Laboratory for Northern Urban Agriculture，

Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Beijing102206， China; 2. Fujian Key Laboratory for Technology

Research of Inspection and Quarantine， Technology Center of Fuzhou Customs District， Fuzhou350001， China;

3. Fruit Industry Service Center， Pinggu Bureau of Agriculture and Rural Affairs， Beijing101200， China）AbstractXanthomonas arboricola pv. pruni （Xap） is one of the most devastating bacterial pathogen to peach and plum. To rapidly and accurately detect Xap， we developed a conventional PCR and a TaqMan real-time PCR assay that targets the 5′ end （611 bp） of L1B16_06350， a Xap encoding gene. Both methods had no cross-reaction with 11 tested bacterial species from eight different genera， including X.arboricola pv. juglandis etc.， with a limit of detection of 10-2ng for the conventional PCR and 10-3 ng for the TaqMan method， respectively， showing high sensitivity and specificity. Field sample test proved the reliability of the two methods in routine diagnosis of Xap.

Key wordsXanthomonas arboricola pv. pruni;conventional PCR;TaqMan real-time PCR;specificity;sensitivity

樹生黃單胞菌李致病變種Xanthomonas arboricola pv. pruni （Xap）隸屬于細菌域Bacteria，變形菌門Proteobacteria，假單胞菌科Pseudomonadaceae，黃單胞菌屬Xanthomonas。該菌最適生長溫度為25～28℃，存活能力強，在干燥條件下可存活10～13 d，而在枝條潰瘍組織內(nèi)能夠存活1年以上，是引發(fā)桃細菌性穿孔病的一種重要病原［1］。

桃細菌性穿孔病在1903年首先發(fā)現(xiàn)于北美［2］，目前已遍布世界桃產(chǎn)區(qū)［34］。自20世紀70至80年代以來，該病害在歐美地區(qū)發(fā)生日趨嚴重［5］，因此歐盟、歐洲與地中海植物保護組織將Xap列為檢疫性有害生物［6］。Xap在桃樹葉片、枝條、果實上均可造成危害。葉片發(fā)病時，初期出現(xiàn)灰色水漬狀斑點，隨后逐漸擴展成圓形或多角形褐色斑塊，周圍有黃色暈圈，病斑后期脫落形成穿孔，由此得名為桃細菌性穿孔病;染病枝條的典型癥狀為水漬狀皰疹斑或潰瘍斑，嚴重者枯死［7］。果實在受害初期，表面形成褐色斑點，邊緣水漬狀，后期病斑凹陷、龜裂，甚至出現(xiàn)黃白色黏稠物，嚴重影響果品和價值［8］。除桃樹外，Xap還可侵染李、杏等核果類果樹，以及桂櫻和山楊等觀賞類植物［9］。

我國是桃原產(chǎn)地，也是全球桃生產(chǎn)第一大國，種植面積、產(chǎn)量均居世界首位［10］。桃產(chǎn)業(yè)在促進農(nóng)民就業(yè)增收、助力鄉(xiāng)村振興方面發(fā)揮了重要作用。隨著我國桃種植規(guī)模的擴大，病害問題日益突出［11］。尤其是近十幾年來，桃細菌性穿孔病已經(jīng)成為桃生產(chǎn)上的一種重要病害，在我國南北方桃產(chǎn)區(qū)多次暴發(fā)流行，南至廣西靈川、福建福安，北至山東沂水、北京平谷，都曾造成嚴重的經(jīng)濟損失［12］。因此，有必要針對Xap建立準確、快速、靈敏的檢測方法，以便有效監(jiān)測桃細菌性穿孔病發(fā)生，為科學制定桃細菌性穿孔病防控策略提供數(shù)據(jù)支持。

根據(jù)GenBank公共數(shù)據(jù)庫，科學家迄今完成了西班牙CITA33 （NZ_CP076701）、IVIA2626.1（GCA_023375015.1）、15-088 （NZ_CP044334）、美國Xcp1 （NZ_CP090954）、T1（GCA_020043425.2）、R1（GCA_020002335.2）共6個Xap菌株的全基因組序列測定，明確Xap基因組約為5.2 Mb，編碼大約4 150個基因，為準確開展病原分子檢測提供了必要的核酸序列信息。本研究利用生物信息學技術(shù)，分析比對Xap Xcp1菌株基因組與公共核酸序列數(shù)據(jù)庫，篩選獲得了一條大約600 bp的Xap特異核酸序列，以此建立了常規(guī)PCR和TaqMan探針法實時定量PCR檢測方法，可用于Xap分子鑒定和桃細菌性穿孔病田間樣品檢測。

1材料與方法

1.1材料

供試菌株包括樹生黃單胞菌李致病變種Xanthomonas arboricola pv. pruni、樹生黃單胞菌胡桃致病變種X.arboricola pv. juglandis、稻黃單胞菌水稻致病變種X.oryzae pv. oryzae、野油菜黃單胞菌野油菜致病變種X.campestris pv. campestris、丁香假單胞菌斑點致病變種Pseudomonas syringae pv. maculicola、丁香假單胞菌番茄致病變種P.syringae pv. tomato、西瓜嗜酸菌Acidovorax citrulli、茄科雷爾氏菌Ralstonia solanacearum、考氏科薩克氏菌Kosakonia cowanii、成團泛菌Pantoea agglomerans、根瘤農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens、大腸桿菌Escherichia coli 共12株細菌，均由北京農(nóng)學院植物保護系原核生物研究室保存。供試田間樣品采集于北京平谷松棚村和正大集團基地的‘奧油’‘中油蟠9’‘瑞光’3個桃樹品種，分別為穿孔葉片、發(fā)生黑色壞死的主葉脈、表現(xiàn)潰瘍的當年生枝條韌皮部。

1.2DNA制備

細菌DNA：取-80℃冰箱中保存的細菌菌株，在LB固體培養(yǎng)基上劃線，28℃培養(yǎng)1～2 d;挑取單菌落，加入5 mL LB至15 mL 離心管中，28℃ 220 r/min過夜培養(yǎng);10 000 g 離心收集菌體，利用細菌基因組DNA提取試劑盒（諾唯贊生物科技有限公司，南京），參照說明書提取細菌基因組DNA。

植物DNA：從穿孔葉片、黑色壞死主葉脈、潰瘍韌皮部的病健交界處，取樣品100 mg，加入液氮速凍研磨，參照植物基因組DNA提取試劑盒（全式金生物技術(shù)有限公司，北京）說明書提取植物基因組DNA。用紫外分光光度計（NanoDrop 2000，美國）測定DNA濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3Xap特異核酸序列篩選及引物與探針設計

利用NCBI BLASTn在線程序篩選Xap特異序列，將候選核酸序列與NR/NT公共數(shù)據(jù)庫比對，設置算法參數(shù)為“somewhat similar sequences”。篩選結(jié)果使用Clustal X軟件進行同源保守性對比，使用GeneDoc軟件作圖。根據(jù)篩選的Xap特異序列，利用 Primer 5設計PCR引物與TaqMan探針，并用DNAstar軟件的primer select模塊進一步評估，確定引物與探針（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其中，F(xiàn)1、R1、F2、R2為“4件套”引物，用于常規(guī)PCR 檢測，F(xiàn)1/R1、F1/R2、F2/R2可以分別配對，在一個反應體系中完成擴增;兩組引物與探針組合（766XapF/766XapR+766XapP、766XapF1/766XapR1+766XapP1）用于TaqMan探針法實時定量PCR檢測。

1.4常規(guī)PCR反應體系與程序

反應體系（20 μL）：10×Ex PCR Buffer 2 μL， 10×dNTP Mix 2 μL， F1、R1引物（10 μmol/L）各0.4 μL，F(xiàn)2、R2引物（10 μmol/L）各0.2 μL，Ex Taq Polymerase （5 U/μL）0.3 μL，模板DNA 1 μL （1， 10-1， 10-2， 10-3， 10-4 ng/μL或10-5 ng/μL），ddH2O 補足至20 μL。PCR反應程序：95℃預變性3 min;95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s，30個循環(huán);72℃延伸5 min。反應結(jié)束后，取5 μL反應產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5TaqMan探針法實時定量PCR反應體系與程序反應體系（20 μL）：Premix Ex Taq （Probe qPCR） （2×） 10 μL，ROX ReferenceⅡ （50×） 0.4 μL（均購于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司），上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，探針（10 μmol/L）0.4 μL，模板DNA 1 μL （1， 10-1， 10-2， 10-3， 10-4 ng/μL或10-5 ng/μL），ddH2O補足至20 μL。利用StepOneTM實時PCR擴增儀（賽默飛世爾科技有限公司，美國）進行反應，程序如下：95℃ 20 s;95℃ 1 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。60℃時采集熒光信號。

2結(jié)果與分析

2.1樹生黃單胞菌李致病變種特異性檢測靶標序列的篩選根據(jù)Effective DB （http：∥effectors.org/）預測，Xap Xcp1株系編碼的一個包含2 084個氨基酸殘基的假定蛋白（UJY95693.2）為Ⅲ型分泌蛋白。利用NCBI BLAST檢索NR/NT數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)該假定蛋白的編碼基因L1B16_06350在其余5個已完成全基因組測定的Xap菌株（15-008、 IVIA2626.1、CITA33、T1、R1） 中保守存在。特別值得關(guān)注的是L1B16_06350基因5′端611 bp核酸序列（以下命名為X6350-611），除了Xap菌株基因組，該DNA片段僅與Xanthomonas sp. SI （CP051261.1）部分基因組序列（958 631-959 136 bp）有大約64%的相似性，此外與NR/NT數(shù)據(jù)庫中其他DNA序列均無明顯相似性。由此推測，X6350-611可作為Xap特異性靶標，用于其分子檢測。

2.2常規(guī)PCR檢測體系的建立

2.2.1“4件套”引物設計思路與驗證

以X6350-611為靶標，設計Xap的PCR檢測體系。為了提高檢測結(jié)果的準確性，根據(jù)靶標序列設計“4件套”引物F1、R1、F2、R2（表1），在一個反應體系中進行PCR，其中F1/R1、F1/R2、F2/R2分別配對，預期產(chǎn)生286、579、218 bp 3種PCR產(chǎn)物（圖1a）。

為了驗證設計思路的可行性，以1 ng Xap基因組DNA為模板，利用上述引物進行PCR反應。結(jié)果顯示：在一個反應體系中同時擴增產(chǎn)生了3種PCR產(chǎn)物，大小與預期相符（圖1b）。

2.2.2特異性分析

為了評價“4件套”引物（F1、R1、F2、R2）的特異性，選取3種黃單胞菌屬細菌（樹生黃單胞菌胡桃致病變種、野油菜黃單胞菌野油菜致病變種、稻黃單胞菌水稻致病變種）、8種其他科屬細菌（丁香假單胞菌斑點致病變種、西瓜嗜酸菌、茄科雷爾氏菌、丁香假單胞菌番茄致病變種、根瘤農(nóng)桿菌、大腸桿菌、科薩克氏菌、成團泛菌），分別以1 ng基因組DNA為模板，應用“4件套”引物進行PCR擴增。結(jié)果顯示：除樹生黃單胞菌李致病變種外均未擴增出任何PCR產(chǎn)物（圖2）。

2.2.3靈敏度分析

分別取1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 ng Xap基因組DNA作為模板，利用“4件套”引物進行PCR檢測。結(jié)果顯示：在模板量為1、10-1、10-2 ng時，均能夠成功擴增3條目標條帶，而在模板量為10-3 ng時，僅出現(xiàn)極微弱的目標條帶。因此，該PCR反應的檢測極限為10-2 ng（圖3）。

2.3TaqMan探針法實時定量PCR檢測體系的建立2.3.1引物與探針的篩選

以1 ng Xap基因組DNA為模板，測試表1所列的兩組TaqMan引物與探針：組合1 （766XapF/766XapR+766XapP）、組合2 （766XapF1/766XapR1+766XapP1）。結(jié)果顯示：兩種組合均出現(xiàn)典型擴增曲線，但是組合1的CT值約為23，而組合2的CT值約為24（圖4）。由此表明，組合1擴增效率優(yōu)于組合2，故后續(xù)試驗選用“766XapF/766XapR+766XapP”組合。

2.3.2特異性分析

分別取樹生黃單胞菌核桃致病變種等3種黃單胞菌屬細菌，以及丁香假單胞菌斑點致病變種等8種其他科屬細菌的基因組DNA （1 ng）為模板，評價“766XapF/766XapR+766XapP”組合的特異性。結(jié)果顯示：只有Xap DNA出現(xiàn)典型擴增曲線，CT值為22，而其他11株對照菌株在CT值為15～35區(qū)間均無典型擴增曲線（圖5）。

2.3.3靈敏度分析

分別取1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 ng Xap基因組DNA作為模板，檢測“766XapF/766XapR+766XapP”組合的靈敏度。結(jié)果顯示：模板量1、10-1、10-2、10-3 ng對應的檢測CT值均在15～35區(qū)間，而模板量為10-4 ng時，CT值為38（圖6）。因此，該體系檢測極限為10-3ng。

2.4應用常規(guī)PCR和TaqMan探針法檢測田間樣品為了驗證上述常規(guī)PCR與TaqMan探針法兩種檢測體系是否適用于桃細菌性穿孔病田間樣品的檢測，本研究從北京平谷桃產(chǎn)區(qū)采集 ‘奧油’ ‘中油蟠9’ ‘瑞光’的發(fā)病葉片、主葉脈、枝條韌皮部，共計7個樣品，提取DNA進行測試。

利用常規(guī)PCR檢測‘奧油’葉片，以及‘奧油’‘中油蟠9’‘瑞光’的主葉脈，均擴增出579、286、218 bp的PCR產(chǎn)物，但從‘奧油’‘中油蟠9’‘瑞光’的枝條韌皮部均未獲得任何擴增產(chǎn)物（圖7a）。TaqMan探針法檢測結(jié)果顯示：所有供試樣品均產(chǎn)生典型擴增曲線，其中‘奧油’葉片，以及‘奧油’‘中油蟠9’‘瑞光’主脈的CT值在23～25左右，而‘奧油’‘中油蟠9’‘瑞光枝條’枝條韌皮部的CT值約為32（圖7b）。由此可見，本研究建立的常規(guī)PCR與TaqMan探針法均可應用于田間樣品的Xap檢測，但后者靈敏度明顯高于前者。

3結(jié)論與討論

在田間自然環(huán)境中，多種細菌或真菌侵染桃樹均可能造成葉片穿孔，或枝條韌皮部壞死，與Xap引發(fā)的癥狀極為相似。因此，準確、快速鑒定病原菌是科學防控桃細菌性穿孔病的基礎。目前，科學家針對Xap先后建立了常規(guī)PCR［13］、TaqMan探針法實時熒光定量PCR［14］、環(huán)介導等溫擴增［15］等分子檢測體系，為桃細菌性穿孔病快速診斷提供了重要的技術(shù)平臺。但是，現(xiàn)有這些技術(shù)體系均以hrp［13］或ftsX［16］基因為檢測靶標，鑒于二者均為細菌保守基因，據(jù)此設計的引物在應用于田間復雜樣本的檢測中，其特異性難以保證。本研究利用生物信息學技術(shù)預測，篩選獲得了一個Xap Ⅲ型分泌蛋白基因（L1B16_06350），其5′端611 bp核酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中無任何同源序列。根據(jù)此序列設計引物及探針，分別建立常規(guī)PCR和TaqMan探針法實時定量PCR檢測體系，并對樹生黃單胞菌胡桃致病變種等隸屬于8個不同屬的11種細菌進行檢測，結(jié)果均未獲得典型擴增產(chǎn)物。由此，確證L1B16_06350基因5′端611 bp核酸序列為Xap的特有序列，而以其為靶標建立的2種檢測方法具有良好的特異性。

除了特異性，靈敏度是分子檢測的另一核心要素。本研究建立的常規(guī)PCR檢測極限為10-2 ng，而TaqMan探針法實時定量PCR檢測極限可達10-3 ng，與此前報道的以hrp為靶標的常規(guī)PCR［13］，及以Xap保守ABC轉(zhuǎn)運ATP結(jié)合蛋白編碼基因為靶標的TaqMan探針法［14］的檢測極限相一致，表現(xiàn)較高的靈敏度。

病原菌侵染寄主植物后，其在不同組織器官中的含量常存在較為明顯的差異。在本研究中，利用常規(guī)PCR和TaqMan探針法檢測桃細菌性穿孔病田間樣品，結(jié)果顯示葉片、主葉脈中的病原菌豐度高于枝條韌皮部。這一數(shù)據(jù)對桃細菌性穿孔病田間病樣的采集、病原分離、檢測等都具有一定的指導意義。此外，田間樣品的大批量檢測不僅要求檢測方法的特異性和靈敏度，同時也需要考慮檢測成本。與TaqMan探針法相比，常規(guī)PCR的靈敏度較低，但無需昂貴的儀器設備和試劑，具有經(jīng)濟、操作簡便等優(yōu)勢［17］。因此，在桃細菌性穿孔病檢測的實際操作中，可根據(jù)病樣組織類型和檢測需求，合理選擇本研究建立的2種不同檢測方法。

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（責任編輯：田喆）