12種中藥材浸提物對蘋果主要病害病原的毒力及防效

摘要為探索中藥材防治5種蘋果主要真菌病害的應(yīng)用價值，采用菌絲生長速率法，對供試的12種中藥材浸提物進行室內(nèi)毒力測定，并開展強抑菌作用的中藥材浸提物的病害田間防治試驗。結(jié)果表明，土荊皮Pseudolarix amabilis浸提物對蘋果輪紋病菌Botryosphaeria dothidea、霉心病菌Trichothecium roseum、炭疽病菌Glomerella ciningularia、斑點落葉病菌Alternaria alternata、蘋果樹腐爛病菌Valsa mali的抑菌活性較強，EC50分別為0.91、1.98、0.65、0.81、0.95 g/L?；炫浜螅?2種中藥材等量混配浸提物對蘋果樹腐爛病菌、輪紋病菌、霉心病菌增效作用最強，增效系數(shù)分別為2.71、4.43、16.21。田間防治試驗中，土荊皮浸提物對蘋果斑點落葉病防效為54.10%;刮除蘋果枝干輪紋病瘤后，土荊皮浸提物對蘋果輪紋病防效達54.78%。本研究明確了土荊皮及其與其他中藥材混配的浸提物對蘋果主要病害病原具有良好的室內(nèi)抑菌作用，土荊皮浸提物在田間也表現(xiàn)出進一步開發(fā)為植物源殺菌劑的潛力。

關(guān)鍵詞蘋果;致病真菌;中藥材;毒力;防效

中圖分類號：S 436.611文獻標識碼：BDOI：10.16688/j.zwbh.2023632Toxicity and efficacy of 12 Chinese herbal medicine extracts on the main

pathogens of apple diseasesZHANG Ziran CHEN Ping ZHANG Wei CHE Xiaozhi ZHOU Huafei ZHAO Jiqiang

ZHANG Zhihan WANG Shaoli LIU Baoyou（1. College of Life Sciences， Yantai University， Yantai264005， China; 2. Yantai Academy of Agricultural

Sciences， Shandong Province， Yantai265500， China; 3. Agricultural Comprehensive Service Center，

Longwangzhuang Subdistrict Office， Laiyang City， Shandong Province， Laiyang265200， China）AbstractIn order to explore the application value of Chinese herbal medicines in prevention of five major pathogenic fungal diseases of apple， extracts of 12 Chinese herbal medicines were subjected to toxicity measurement by using the mycelial growth rate method， and field effects were measured using herb extracts with high inhibitory effects. The results showed water extract of Pseudolarix amabilis presented strong antifungal activity against Botryosphaeria dothidea， Trichothecium roseum， Glomerella ciningularia， Alternaria alternata and Valsa mali， with EC50 values of 0.91， 1.98， 0.65， 0.81 and 0.95 g/L， respectively. The extract of 12 Chinese herbal medicines by equal mixing had the strongest synergistic effect on V.mali， B.dothidea and T.roseum， with synergic ratio of 2.71， 4.43， and 16.21， respectively. In the field experiments， the control efficacy of P.amabilis extract to apple Alternaria blotch was 54.10%， and reached 54.78% after scraping disease spots of apple ring rot. The above results demonstrated that the extracts of P.amabilis and its mixture with other Chinese herbal medicines had good indoor inhibitory effect on the pathogens of main apple diseases， and the extract of P.amabilis also presented the potential to be further developed as a botanical fungicide in the field.

Key wordsapple;pathogenic fungi;Chinese herbal medicine;toxicity;prevention effect

中國蘋果種植面積和總產(chǎn)量均位居世界前列［1］，但因生長周期長，蘋果常受多種病害的侵染與為害，影響蘋果產(chǎn)量和質(zhì)量［23］。胡清玉等對50種蘋果病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蘋果樹腐爛病（病原菌Valsa mali）、輪紋?。ú≡鶥otryosphaeria dothidea）、斑點落葉?。ú≡鶤lternaria alternata）等病害發(fā)生最為嚴重，其中蘋果樹腐爛病主要發(fā)生于樹體主干及主枝部位，嚴重發(fā)生時侵害果實［45］;輪紋病主要危害枝干和果實，果實在近成熟期和貯藏期呈現(xiàn)癥狀，具有潛伏侵染特點［6］;斑點落葉病發(fā)生于春秋梢，主要危害葉片、葉柄、枝條和果實，嚴重時葉片大量脫落［7］;霉心?。ú≡鶷richothecium roseum）、炭疽?。ú≡鶪lomerella ciningularia）在我國發(fā)生較為普遍，造成大量爛果和經(jīng)濟損失［8］。

化學防治仍是目前防治蘋果病害的主要手段，但化學農(nóng)藥的不合理使用導(dǎo)致了環(huán)境污染、殺傷天敵、破壞自然生態(tài)平衡等一系列問題［910］。天然植物源農(nóng)藥對人畜安全、環(huán)境友好，因此尋找可部分替代化學農(nóng)藥的生物活性物質(zhì)或直接開發(fā)植物源農(nóng)藥成為當今農(nóng)藥研究領(lǐng)域的熱點之一［1112］。中國有豐富的中藥植物資源，且許多中藥材被發(fā)現(xiàn)具有抑菌活性。在醫(yī)學上，徐云輝等對土荊皮Pseudolarix amabilis抗真菌活性成分進行研究，表明其醋酸乙酯部位分離的化合物對白色念珠菌Candida albicans有顯著的抑制作用［13］。百部Stemona sessilifolia、苦參Sophora flavescens、石菖蒲Acorus gramineus等中藥材的乙醇浸提物對蘋果樹腐爛病菌、輪紋病菌、斑點落葉病菌和炭疽病菌有不同程度的抑菌作用［1416］。紫杉Taxus cuspidata、洋甘菊Matricaria chamommilla等植物的提取物通過損壞生物膜系統(tǒng)，降低真菌穩(wěn)定性，抑制病原真菌生長［1719］。但中藥材對蘋果霉心病菌抑制作用的研究較少，關(guān)于土荊皮浸提物對作物病原真菌抑制作用的報道更是缺乏。

在果樹間套種中藥材已有廣泛報道［2021］，中藥材收獲后即可采用安全、環(huán)保的水提法［22］進行浸提，噴浸提物進行病害防控，降低化學農(nóng)藥投入量，為農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展提供新思路［23］。本研究選取了土荊皮等12種中藥材的浸提物對蘋果主要病原真菌進行室內(nèi)毒力測定，并通過田間藥效評價，篩選對蘋果真菌病害有綜合防治效果的中藥材，為將其開發(fā)為植物源農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試中藥材

供試中藥材共12種，即虎杖Reynoutria japonica、黃芩Scutellaria baicalensis、苦參、地膚子Bassia scoparia、土荊皮、黃柏Phellodendron chinense、藿香Agastache rugosa、百部、川椒Zanthoxylum bungeanum、丁香Eugenia caryophllata、黃連Coptis chinensis和石菖蒲，均購自安徽亳州千翁堂。

1.1.2培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 000 mL。

1.1.3供試菌株

蘋果輪紋病、霉心病、炭疽病、斑點落葉病和蘋果樹腐爛病典型樣本均采集于山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學研究院植環(huán)所紅富士蘋果園（37°29′N，121°16′E）。采用組織分離法對病原菌進行分離，經(jīng)形態(tài)學和分子生物學鑒定后保存于4℃冰箱備用。

1.2毒力測定試驗方法

1.2.1單味中藥材浸提物制備

將中藥材置于干燥箱中60℃烘干，粉碎后制成干粉。分別稱取6 g，放入盛有150 mL純凈水的試管中，加熱至沸騰，沸水浴60 min，轉(zhuǎn)文火煎煮30 min，過濾NnRC10D6PkwowOmM9vHd5Py0G8m4V8TlpTyAPxQo7rw=藥渣獲得第1次浸提物，重復(fù)上述蒸煮過程，獲得第2次浸提物，10 000 r/min離心2 min，將上清液加熱濃縮定容至20 mL，121℃高溫滅菌后，分別得到終濃度300 g/L的中藥材浸提物（即每升水中含有300 g中藥材干粉的浸提物），置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2混配中藥材浸提物制備

分別稱取12種中藥材各0.5 g，混勻得到混配藥材6 g;根據(jù)單味藥材的抑菌效果，選取效果最好的單味藥材分別與其他11種中藥材按照1∶1混合，各得到混配藥材6 g。上述兩種混配方式的藥材煎制方法同1.2.1，得到終濃度為300 g/L混配中藥浸提物，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3毒力測定

將PDA培養(yǎng)基121℃高溫滅菌，在無菌操作條件下將中藥材浸提物與培養(yǎng)基按照一定比例混合，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果依次稀釋至所需的濃度（表1），每種藥液設(shè)置6個濃度，以不加藥的培養(yǎng)基作為對照，每個處理3個重復(fù)。用6 mm打孔器打取菌餅，接種于90 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，25℃培養(yǎng)，待對照組菌落直徑達培養(yǎng)皿直徑的3/4時，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率，求出毒力回歸方程和EC50。

抑菌率=（對照菌落擴展直徑-處理菌落擴展直徑）/對照菌落擴展直徑×100%。

1.2.4混配增效評價方法

1.3田間藥效試驗

蘋果輪紋病田間藥效試驗在山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學研究院植環(huán)所紅富士蘋果園（37°29′N，121°16′E）中進行。選取15株樹齡、樹勢基本一致，輪紋病瘤大小相近的3年生蘋果樹作為試驗對象。在每株樹病瘤處，用紅色油漆標記出30～50 cm2區(qū)域，每株樹標出4個區(qū)域，處理前對每個區(qū)域病瘤數(shù)進行統(tǒng)計，4個區(qū)域處理方法：涂無菌水作為對照，涂土荊皮浸提物，刮除病瘤（病瘤刮除較輕，未刮到健皮處）后涂無菌水和刮除病瘤后涂土荊皮浸提物。每隔10 d涂1次，共涂3次。每個區(qū)域均勻刷涂2遍，保證區(qū)域內(nèi)全部覆蓋無菌水或浸提物。第3次刷涂后30 d，觀察記錄病瘤數(shù)量，計算防治效果［25］。

病瘤增長率=（藥后總瘤數(shù)-藥前總瘤數(shù)）/藥前總瘤數(shù)×100%；

直接涂藥防治效果=（對照區(qū)病瘤增長率-處理區(qū)病瘤增長率）/對照區(qū)病瘤增長率×100%；

刮除病瘤后涂藥防治效果=（涂水區(qū)病瘤數(shù)-涂藥區(qū)病瘤數(shù)）/涂水區(qū)病瘤數(shù)×100%。

蘋果斑點落葉病田間藥效試驗開展于‘新紅星’蘋果春梢期。設(shè)置2個處理，分別為噴施土荊皮浸提物，噴施無菌水（對照組），每處理3次重復(fù)，共6個小區(qū)，每個小區(qū)5株樹。在發(fā)病初期進行第1次噴施，每隔10 d噴1次，共噴3次。末次噴施后10 d調(diào)查防治效果。每株果樹在東、南、西、北、中5個方位各固定2個新梢，記錄總?cè)~片數(shù)和各級病葉數(shù)。葉部病害分級標準為：0級，無病斑;1級，病斑面積占整個葉面積的11%以下;3級，病斑面積占整個葉面積的11%～25%;5級，病斑面積占整個葉面積的26%～40%;7級，病斑面積占整個葉面積的41%～65%;9級，病斑面積占整個葉面積的65%以上。根據(jù)調(diào)查結(jié)果計算各處理的病情指數(shù)和防治效果［26］。

病葉率=病葉數(shù)/調(diào)查總?cè)~數(shù)×100%；

病情指數(shù)=∑（各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×9）×100；

防治效果=（對照區(qū)病情指數(shù)-處tNkF8N7woZI1juzLEbebHzEHuKP/ihv9DBQ2BR7Shbs=理區(qū)病情指數(shù)）/對照區(qū)病情指數(shù)×100%。

1.4數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2019進行試驗數(shù)據(jù)的匯總處理，利用DPS（Version 9.01）和SPSS 27.0（IBM）回歸分析求出EC50、95%置信區(qū)間、卡方、自由度等數(shù)據(jù)，并用Duncan氏新復(fù)極差法進行顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1中藥材浸提物對蘋果輪紋病菌的抑菌作用

單味中藥材浸提物中，土荊皮、百部、黃芩、苦參、地膚子、藿香、丁香的浸提物對蘋果輪紋病菌的EC50均小于20.00 g/L，其中土荊皮抑菌效果最強，EC50為0.91 g/L;其次為百部，EC50為4.36 g/L。但黃連、川椒、石菖蒲的抑菌效果較差，EC50均大于50.00 g/L。土荊皮與其他中藥材混配浸提物均可有效抑制病菌生長，EC50在1.11～1.70 g/L之間，但其抑菌效果低于單味土荊皮浸提物（表2）。

2.2中藥材浸提物對蘋果霉心病菌的抑菌作用

單味中藥材浸提物中，土荊皮對蘋果霉心病菌的抑菌效果最強，EC50為1.98 g/L;其次是黃芩、黃連、黃柏、虎杖，EC50分別為6.46、6.64、16.53、23.74 g/L;百部的抑菌效果較差，EC50為80.64 g/L。中藥材混配浸提物的抑菌效果優(yōu)于土荊皮，EC50均小于2.00 g/L;土荊皮+川椒和土荊皮+丁香的抑菌效果最好，EC50均為0.58 g/L（表3）。

2.3中藥材浸提物對蘋果炭疽病菌的抑菌作用

土荊皮、虎杖、地膚子、黃柏、藿香、百部、川椒、黃連浸提物對蘋果炭疽病菌的抑菌效果較好，EC50均小于20.00 g/L，其中土荊皮抑菌效果最好，EC50僅為0.65 g/L;虎杖、地膚子、藿香、川椒、黃連的EC50均小于10.00 g/L;丁香和石菖蒲的抑菌作用差，EC50大于70.00 g/L?；炫浣M合抑菌效果的EC50在0.88～1.81 g/L之間（表4）。

2.4中藥材浸提物對蘋果斑點落葉病菌的抑菌作用土荊皮、川椒、百部、黃芩浸提物對蘋果斑點落葉病菌具有一定的抑菌作用，EC50小于30.00 g/L，其中土荊皮的抑菌作用最強，EC50為0.81 g/L;其次川椒EC50為2.67 g/L;藿香、黃連抑菌效果較差，EC50大于90.00 g/L?；炫浣M合抑菌效果的EC50在1.34～8.42 g/L之間（表5）。

2.5中藥材浸提物對蘋果樹腐爛病菌的抑菌作用

單味中藥材浸提物中，土荊皮對蘋果樹腐爛病菌的抑菌效果最好，EC50為0.95 g/L;其次川椒EC50為12.65 g/L;虎杖、黃芩等其他中藥材的EC50在18.33～43.27 g/L之間。土荊皮與其他中藥材的混配組合EC50在0.83～3.15 g/L之間，其中土荊皮分別與黃芩、石菖蒲（1∶1）混配的抑菌效果優(yōu)于單味土荊皮浸提物，EC50分別為0.83、0.92 g/L（表6）。

2.6土荊皮與其他中藥材浸提物混配增效作用評價結(jié)果不同混配浸提物對5種蘋果病原真菌抑制效果存在相加或增效作用（表7）。其中，12種中藥材等量混配浸提物對蘋果輪紋病菌、霉心病菌、炭疽病菌和蘋果樹腐爛病菌抑菌效果的增效作用最好，增效系數(shù)分別為4.43、16.21、2.67和2.71;對蘋果斑點落葉病菌抑制效果中，不同中藥材混配組合均表現(xiàn)為相加作用，增效系數(shù)在0.59～1.21之間。

2.7土荊皮浸提物對蘋果輪紋病的田間防效

根據(jù)室內(nèi)毒力測定結(jié)果，選取4 g/L的土荊皮浸提物進行田間藥效試驗。從表8可以看出，刮除病瘤涂土荊皮浸提物處理，處理后病瘤總數(shù)量為2.20個，而刮除病瘤涂無菌水處理病瘤總數(shù)量顯著高于涂土荊皮浸提物處理，處理后病瘤總數(shù)量為5.07個，土荊皮浸提物防效為54.78%。不刮除病瘤直接涂藥處理，病瘤增長率為11.61%，對照組為20.17%，土荊皮浸提物處理的防效顯著高于對照組，防效為44.35%。

2.8土荊皮浸提物對蘋果斑點落葉病的田間防效

從表9中可以看出，土荊皮浸提物處理后，病葉率為16.89%，顯著低于對照組，防效為54.10%。

3結(jié)論與討論

中國有豐富的中藥材資源，中醫(yī)藥理論博大精深，研究發(fā)現(xiàn)對人體致病菌有抑制作用的中藥材中，有些對植物病菌和食品霉菌也有很好的抑制作用，如土荊皮浸提物對青霉Penicillium和脈孢霉Neurospora孢子抑制性能較好;對棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum和小麥紋枯病菌Rhizotonia cerealis也表現(xiàn)出較強的抗菌活性［2728］。雖然目前不乏土荊皮提取物對真菌抑制作用的報道，但未見其對蘋果病原真菌抑制作用的研究。本研究證實土荊皮浸提物在12種中藥材浸提物中對5種蘋果病原真菌的抑菌效果最佳，擴大了土荊皮的抑菌譜。

本研究發(fā)現(xiàn)土荊皮對蘋果病原菌抑制效果不同，依次為蘋果炭疽病菌>斑點落葉病菌>輪紋病菌>蘋果樹腐爛病菌>蘋果霉心病菌。同一物質(zhì)對不同病原菌的抑制作用差異也同樣存在于其他報道中，例如黃柏對尖孢鐮刀菌基本沒有抑制作用，但對桃褐腐病菌Monilinia fructicola、荔枝霜疫霉Peronophythora litchi等病菌均有抑制作用［2931］。我們推測土荊皮對不同病原菌抑制作用的差異可能是由于對不同病原菌的作用方式導(dǎo)致，如有研究發(fā)現(xiàn)丁香提取物可破壞大腸桿菌Escherichia coli的細胞膜導(dǎo)致其死亡，而對于枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis，僅使其菌體出現(xiàn)變形，抑制作用較差［32］。

不同中藥材之間具有協(xié)同作用，混配后可增強藥效。如土荊皮與苦楝皮Melia azedarach等中藥材復(fù)配使用時對菊小長管蚜Macrosiphoniella sanborni殺滅活性優(yōu)于單獨使用［33］;土荊皮與丁香等中藥材復(fù)配對黃瓜黑斑病Alternaria cucumerina的抑菌作用優(yōu)于化學農(nóng)藥多菌靈［34］。本研究中土荊皮與其他中藥材混配的抑制效果也存在相加或增效作用。

據(jù)報道，以川烏Aconitum carmichaelii、防風Saposhnikovia divaricata等中藥材為主要成分的中草藥源殺菌劑“輪紋一掃光”對蘋果枝干輪紋病有較好的防治作用;“F-粉劑”為白頭翁Pulsatilla chinensis、厚樸Houpoea officinalis等多種中藥材復(fù)配的植物源農(nóng)藥，對蘋果樹腐爛病有一定的鏟除作用［3536］。本研究進一步對土荊皮田間防效進行了測定，發(fā)現(xiàn)土荊皮浸提物對蘋果輪紋病和斑點落葉病都具有一定的防效，證實了土荊皮等中藥材具有開發(fā)為植物源殺菌劑的前景，后續(xù)對其核心活性物質(zhì)鑒定及作用機制的研究將進一步提高其抑菌活性及應(yīng)用價值。實際應(yīng)用中，還可以通過在果樹間科學合理地套種中藥材，降低病害防治成本的同時形成多功能、多效益的生態(tài)種植群落，實現(xiàn)果樹和中藥材產(chǎn)業(yè)協(xié)同發(fā)展。

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（責任編輯：田喆）