4種方法脫除太子參BBWV和TuMV病毒的效果比較

摘要以太子參‘柘參1號’品種為試驗(yàn)材料，比較微莖尖培養(yǎng)、低溫處理（2～4℃）結(jié)合微莖尖培養(yǎng)、超低溫（-196℃）培養(yǎng)、種胚培養(yǎng)等4種方法對蠶豆萎蔫病毒（broad bean wilt virus，BBWV）和蕪菁花葉病毒（turnip mosaic virus，TuMV）的脫除效果，結(jié)果顯示采用低溫處理結(jié)合微莖尖培養(yǎng)，太子參成活率為64.7%，BBWV和TuMV的脫毒率分別為63.6%和31.8%;采用種胚培養(yǎng)的成活率為56.7%，對BBWV和TuMV的脫毒率均可達(dá)100%。病毒TuMV相較BBWV更難脫除。

關(guān)鍵詞太子參;花葉病毒;脫病毒方法;病毒檢測

中圖分類號：S 435.675文獻(xiàn)標(biāo)識碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023562Comparision of effect of four methods for the virus-free of BBWV and

TuMV viruses in Pseudostellaria heterophyllaBU Hongsong WANG Ding ZHANG Xinyue ZHOU Dan ZHENG Shengwen KUANG Yunbo YE Zuyun（1. College of Life Sciences， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou350002， China; 2. The Engineering

Technology Research Center of Characteristic Medicinal Plants of Fujian，College of Life Sciences，Ningde Normal

University， Ningde352100， China; 3. Fujian Zheshen Biotechnology Research Co.， Ltd.， Ningde355300， China）AbstractThe effects of four methods， including microstem tip culture， low temperature （2-4℃） treatment combined with microstem tip culture， ultra-low temperature （-196℃） culture and embryo culture， on the virus-free of broad bean wilt virus （BBWV） and turnip mosaic virus （TuMV） from Pseudostellaria heterophylla ‘Zheshen No.1’ were compared. The results showed that the survival rate of P.heterophylla was 64.7%， and the virus-free rates of BBWV and TuMV were 63.6% and 31.8%， respectively， using low temperature treatment combined with micro-stem tip culture. The survival rate of embryo culture was 56.7%， and the virus-free rate of BBWV and TuMV was 100%. P.heterophylla mosaic virus TuMV is more difficult to remove than BBWV.

Key wordsPseudostellaria heterophylla;mosaic virus;virus-free method;virus detection

太子參Pseudostellaria heterophylla （Miq.） Pax為石竹科孩兒參屬多年生草本藥用植物，以塊根入藥，富含多糖、皂苷、氨基酸、環(huán)肽等活性成分，具有益氣健脾，生津潤肺之功效［1］。太子參主要栽培產(chǎn)區(qū)在福建、貴州、安徽等地［2］，是福建省道地藥材。太子參多以塊根進(jìn)行無性繁殖，其種根容易受到病毒的侵染，使葉片出現(xiàn)褪綠斑、黃化斑，呈現(xiàn)葉片卷縮、植株矮小、塊根小等癥狀，導(dǎo)致產(chǎn)量低、品質(zhì)差，通常造成減產(chǎn)15%～50%［34］，嚴(yán)重者可達(dá)到90%。感染病毒的太子參植株弱小，抗病性下降，易發(fā)生真菌類病害，種植戶噴施農(nóng)藥防治，使農(nóng)藥殘留和重金屬超標(biāo)的可能性增加。因此，培育太子參脫病毒的健康種苗，是太子參藥材產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。

已報道的侵染太子參的病毒有4種，分別為蕪菁花葉病毒（turnip mosaic virus，TuMV），蠶豆萎蔫病毒（broad bean wilt virus，BBWV），黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）和煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）［5］。在太子參道地產(chǎn)區(qū)福建柘榮縣，侵染太子參的病毒主要是BBWV和TuMV，也是對太子參影響最大的兩種病毒，染病率高達(dá)100%［67］，只有極少部分的植株感染CMV，未檢測出TMV［6］。

目前，已報道的太子參脫病毒的方法有微莖尖培養(yǎng)和超低溫培養(yǎng)［89］，存在脫毒率和成活率較低、操作繁瑣等問題。因此，探尋更高效、便捷的太子參脫病毒方法，是解決太子參產(chǎn)業(yè)發(fā)展之所急。本課題組在多年研究太子參脫病毒培養(yǎng)與應(yīng)用的基礎(chǔ)上，創(chuàng)制出低溫處理結(jié)合微莖尖培養(yǎng)和種胚培養(yǎng)2種脫病毒方法。本研究針對柘榮地區(qū)太子參感染的2種主要病毒，比較4種不同的脫病毒方法對TuMV和BBWV的脫毒效果，旨在篩選最適宜的太子參脫病毒方法。

1材料與方法

1.1供試材料

以太子參栽培品種‘柘參1號’的種子及組培苗為材料。種子從寧德市柘榮縣際頭村太子參農(nóng)場（北緯27.2°N，東經(jīng)119.9°E，海拔664 m）栽培的‘柘參1號’收集獲得，用于太子參的種胚培養(yǎng)。太子參組培苗是以該農(nóng)場栽培的‘柘參1號’植株幼嫩莖頂端為材料，經(jīng)常規(guī)組培獲得，作為太子參微莖尖培養(yǎng)、低溫處理結(jié)合微莖尖培養(yǎng)和超低溫培養(yǎng)3種脫病毒方法的試驗(yàn)材料。

儀器：數(shù)碼體視顯微鏡（LEICA EZ4，德國徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）、高速冷凍離心機(jī)（3-18K，德國SIGMA）、PCR儀（ProFlex 3，美國ABI公司）、微量核酸濃度檢測儀（NanoDrop，美國熱電）、凝膠成像儀（JS-780，上海培清科技有限公司）等。

試劑和藥品：Trizol Universal總RNA提取試劑［天根生化科技（北京）有限公司］。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1供試材料的病毒檢測與培養(yǎng)

取6份太子參組培苗材料，使用Trizol Universal總RNA提取試劑提取其總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，利用微量核酸濃度檢測儀進(jìn)行定量分析，通過A260/A280和A260/A230檢測RNA質(zhì)量，將合格的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用雙重RT-PCR分子檢測技術(shù)［10］進(jìn)行病毒檢測，確認(rèn)病毒種類，將有病毒的組培苗進(jìn)行擴(kuò)繁，作為對照樣本，同時也作為脫病毒培養(yǎng)的材料。

1.2.2脫病毒培養(yǎng)

供試材料經(jīng)病毒檢測確定所攜帶病毒種類后分別采用微莖尖培養(yǎng)、低溫處理結(jié)合微莖尖培養(yǎng)、超低溫培養(yǎng)以及種胚培養(yǎng)。太子參誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA［11］。

1.2.2.1微莖尖培養(yǎng)

以培養(yǎng)室內(nèi)的常規(guī)太子參組培苗為試驗(yàn)材料，于超凈工作臺上，剝?nèi)≈睆綖?.2 mm左右的組培苗頂端微小莖尖（圖2a），接入太子參誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，做好標(biāo)記，進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（20±2）℃，15 d后轉(zhuǎn)入弱光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為18 μmol/（m2·s），30 d后轉(zhuǎn)入常規(guī)光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度56 μmol/（m2·s），統(tǒng)計其成活率、染菌率及脫毒率。

1.2.2.2低溫處理結(jié)合微莖尖培養(yǎng)

太子參組培苗在培養(yǎng)瓶內(nèi)誘導(dǎo)形成微塊根［12］后，將培養(yǎng)瓶放入冰箱（2～4℃）低溫保存60～90 d，待微塊根的芽長至279ac1422040e6246e7be14e8f7f93fbea9e7e9785662de6b1b5df4e5a6f5a364～5 cm左右時，于超凈工作臺上剪取芽，剝?nèi)≈睆綖?.2 mm左右的芽頂端微小莖尖進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)（圖2b），使用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及觀測方法同1.2.2.1。

1.2.2.3超低溫培養(yǎng)

參照“一種利用微莖尖與超低溫脫除太子參蠶豆萎蔫病毒的方法”［9］，并進(jìn)行改良： 無菌剝?nèi)∨囵B(yǎng)室常規(guī)組培苗幼芽1～2 mm，將其放在培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+140 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂粉，培養(yǎng)溫度為4℃;隨后進(jìn)行加載、玻璃化及超低溫（-196℃）處理，將處理后的幼芽接入太子參誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，0℃下暗培養(yǎng)5～7 d，使用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及觀測方法同1.2.2.1。

1.2.2.4種胚培養(yǎng)

選取飽滿的太子參種子，洗凈后用水浸泡12 h，隨后移至超凈工作臺上，使用75%乙醇消毒30 s，然后用0.1%升汞溶液消毒15 min，再用無菌水蕩洗4～5次，每次蕩洗2 min左右，剝?nèi)√訁⒎N子內(nèi)完整的胚（圖2c）進(jìn)行培養(yǎng)，使用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及觀測方法同1.2.2.1。

1.2.3脫毒組培苗的病毒檢測

經(jīng)過4種脫病毒方法培養(yǎng)，對成活的太子參脫毒組培苗（圖2d）進(jìn)行病毒檢測，檢測方法同1.a73ce848d2d2f9344935de593ce081fc8c4ef8d36b8ea469df5304a2f132009f2.1供體材料的病毒檢測方法。

1.3數(shù)據(jù)處理

觀察記錄各項(xiàng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用Excel 2019進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1供試材料的病毒檢測

6份太子參組培苗樣品總RNA濃度檢測結(jié)果：各樣品的A260/A280比值在1.933～2.095之間，A260/A230比值在1.786～2.284之間，提取的太子參總RNA電泳圖譜均呈現(xiàn)兩條清晰明亮的條帶（28S、18S），滿足后續(xù)反轉(zhuǎn)錄的要求。6份樣品的病毒檢測結(jié)果見圖1，每份樣品均含有TuMV（774 bp）和BBWV（ 1 345 bp）。

2.24種脫病毒方法的培養(yǎng)效果

太子參脫病毒材料培養(yǎng)30 d后，成活及染菌情況統(tǒng)計結(jié)果見表1。低溫處理結(jié)合微莖尖培養(yǎng)及種胚培養(yǎng)成活率較高，分別為64.7%和56.7%，微莖尖培養(yǎng)成活率為33.3%，超低溫培養(yǎng)成活率最低，為16.2%;種胚培養(yǎng)染菌率為6.7%，微莖尖培養(yǎng)、低溫處理結(jié)合微莖尖培養(yǎng)和超低溫培養(yǎng)均未染菌。

2.34種脫毒方法的脫毒效果

2.3.1雙重RT-PCR病毒檢測

采用雙重RT-PCR分子檢測技術(shù)對太子參脫毒培養(yǎng)的組培苗進(jìn)行病毒檢測（圖3～圖6）。結(jié)果顯示，種胚培養(yǎng)獲得的組培苗均未檢測出病毒，脫毒率為100%，其他3種脫病毒方法培養(yǎng)的組培苗脫毒率為14.3%～63.6%，具體結(jié)果見表2。

3結(jié)論與討論

植物莖尖脫病毒培養(yǎng)時，通常剝?nèi)〉那o尖大小與成活率成正比，與脫毒率成反比。為了獲得較高的脫毒率，本研究中剝?nèi)〉奶訁⑽⑶o尖直徑均為0.2 mm左右，常規(guī)微莖尖培養(yǎng)和低溫處理結(jié)合微莖尖培養(yǎng)的成活率分別為33.3%和64.7%， BBWV的脫毒率分別為28.6%和63.6%，TuMV的脫毒率分別為14.3%和31.8%，低溫處理結(jié)合微莖尖培養(yǎng)的成活率和脫毒率均大幅度提高。太子參微塊根具有低溫萌芽的特性［11］，經(jīng)低溫誘導(dǎo)后，解除休眠，微塊根的芽頂端分生組織生理特性增強(qiáng)，細(xì)胞的分裂、生長速度快且較一致，形成體積較大的頂端生長點(diǎn)（圖2b），微莖尖較容易剝?nèi)?，培養(yǎng)成活率較高，脫毒效果明顯，操作方法簡便，能保持品種的優(yōu)良特性。因此，低溫處理結(jié)合微莖尖培養(yǎng)是太子參脫病毒的首選方法。種胚培養(yǎng)成活率主要取決于剝?nèi)〉姆N胚是否完整，種子由外種皮、內(nèi)種皮、外胚乳和胚構(gòu)成，其中種皮兩層：外種皮呈革質(zhì)，較厚;內(nèi)種皮呈膜質(zhì)，很??；外胚乳與內(nèi)種皮粘連較緊，位于彎曲種胚的中間及兩側(cè)，易與種胚分離。種胚側(cè)向彎曲呈圓弧形，由胚根、胚芽、下胚軸和子葉構(gòu)成。通過有性過程形成的種子一般無病毒或僅種子表面有病毒，研究表明太子參種子繁殖不傳播病毒，通過常規(guī)消毒能去除種子表面的病毒，而內(nèi)部無病毒，但太子參成熟種子具有休眠特性，難以用于無病毒種苗的規(guī)?；a(chǎn)，因此本試驗(yàn)采用種胚培養(yǎng)脫除病毒，成活率高且易于操作。外胚乳對種子的萌發(fā)有抑制作用，外胚乳剝除不徹底或剝?nèi)〉呐卟煌暾紩绊懛N胚培養(yǎng)的成活率。對BBWV、TuMV這2種病毒，太子參種胚培養(yǎng)的脫毒率均為100%。如果不考慮太子參種子變異問題，種胚培養(yǎng)是太子參脫病毒的最優(yōu)方法。

超低溫培養(yǎng)對兩種病毒都有一定的脫毒效果，但其成活率低，且要用到液氮及其他各種藥品，操作比較繁瑣且成本高。 此外有報道采用熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)的方法進(jìn)行太子參的脫病毒，最終脫毒率僅為5.2%［5］。由于太子參不耐高溫，課題組在開展預(yù)試驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)溫度超過30℃，植株生長停滯，出現(xiàn)休眠;超過35℃，植株開始枯萎發(fā)黃，出現(xiàn)死亡。因此，我們認(rèn)為高溫培養(yǎng)結(jié)合微莖尖的脫毒方法不適用于太子參。有研究表明，TuMV是病毒家族中已知寄主范圍最廣的病毒，具有極強(qiáng)的侵染能力［1315］。本研究發(fā)現(xiàn)，太子參微莖尖培養(yǎng)相關(guān)的2種脫病毒方法中，剝?nèi)〉奈⑶o尖大小相同的情況下，TuMV的脫毒率只有BBWV的脫毒率的50%左右，說明太子參TuMV相較BBWV更難脫除，可能是由于TuMV侵染力較強(qiáng)，在植株生長點(diǎn)近處也有分布。

植物生產(chǎn)中使用脫毒苗，產(chǎn)量可以提高20%～270%［1617］。目前脫毒苗已廣泛應(yīng)用于各種經(jīng)濟(jì)作物的生產(chǎn)，部分藥用植物如懷地黃、半夏等在生產(chǎn)上也初步進(jìn)行了脫毒苗的應(yīng)用研究［1819］?；ㄈ~病毒引起的太子參種質(zhì)退化、病害嚴(yán)重、產(chǎn)量和品質(zhì)下降是太子參產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。課題組利用太子參脫病毒培養(yǎng)技術(shù)，對柘榮太子參主栽品種‘柘參1號’和‘柘參2號’都進(jìn)行了脫病毒培養(yǎng)，工廠化繁育其脫毒苗，通過溫室大棚水肥一體化無土栽培擴(kuò)繁，提供品種優(yōu)良、純正、整齊的無病毒優(yōu)質(zhì)種根給種植戶，通過規(guī)范化栽培，太子參產(chǎn)量可提高30%以上，已進(jìn)行了大面積推廣應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯：田喆）