橡膠樹棒孢霉落葉病菌酵母單雜交cDNA文庫及CcCas5啟動(dòng)子誘餌載體的構(gòu)建

摘要為了篩選出與CcCas5啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，本研究構(gòu)建了橡膠樹棒孢霉落葉病菌的酵母單雜交cDNA表達(dá)文庫和CcCas5啟動(dòng)子誘餌載體， 并對(duì)3-氨基-1，2，4-三唑 （3-amino-1，2，4-triazole，3-AT）的最佳抑制濃度進(jìn)行了篩選。結(jié)果顯示，構(gòu)建的酵母單雜交cDNA表達(dá)文庫總?cè)萘繛?.49×10⁶ cfu，插入片段主要分布于750～2 000 bp之間，重組率為95.8%;克隆了CcCas5基因2 600 bp的啟動(dòng)子序列，預(yù)測獲得真菌主要的10大類轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)165個(gè);構(gòu)建了分別攜帶1 500 bp和1 000 bp啟動(dòng)子序列的酵母單雜交啟動(dòng)子誘餌載體，10 mmol/L的3-AT能抑制pHis2.1-pCcCas5-1000和pHis2.1-pCcCas5-1500的背景表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果為通過酵母單雜交篩選與CcCas5啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子和進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)錄因子對(duì)CcCas5表達(dá)的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞橡膠樹;多主棒孢;CcCas5;啟動(dòng)子;酵母單雜交;cDNA文庫

中圖分類號(hào)：S 763.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023515Construction of a yeast one-hybrid cDNA library and CcCas5 promoter bait

vector of Corynespora cassiicola causing leaf fall disease of Hevea brasiliensisHU Guohao YANG Ziping LIU Tong ZHANG Rongyi HOU Jumei（1. Engineering Center of Agricultural Microbial Preparation Research and Development of Hainan， College of

Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou570228， China; 2. Zhanjiang Key Laboratory

of Tropical Crop Genetic Improvement， South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy

of Tropical Agricultural Sciences， Zhanjiang524091， China; 3. Sanya Research Institute， Chinese

Academy of Tropical Agricultural Sciences， Sanya572025， China）AbstractIn order to screen the transcription factors that bind to the CcCas5 promoter， a yeast one-hybrid cDNA expression library of Corynespora cassiicola and a CcCas5 promoter bait vector were constructf5d978e7125f1d923e176e2d1e652babed， and the optimal inhibitory concentration of 3-amino-1，2，4-triazole （3-AT） was screened in this study. The results showed that the total capacity of the constructed yeast one-hybrid cDNA expression library was 3.49×106 cfu， the inserted fragments mainly distributed between 750 to 2 000 bp， and the recombination rate was 95.8%. The 2 600 bp promoter sequence of CcCas5 was cloned and the binding sites of 165 main fungal transcription factors in 10 families were predicted. Yeast one-hybrid promoter bait vectors carrying 1 500 bp and 1 000 bp promoter sequences were constructed， respectively， and 10 mmol/L of 3-AT could inhibit the background expression of pHis2.1-pCcCas5-1000 and pHis2.1-pCcCas5-1500. The above results lay the foundation for screening transcription factors that bind to the CcCas5 promoter through yeast one-hybrid screening and further studying the regulatory effects of transcription factors on CcCas5 expression.

Key wordsHevea brasiliensis;Corynespora cassiicola;CcCas5;promoter;yeast one-hybrid;cDNA library

由多主棒孢Corynespora cassiicola引起的橡膠樹棒孢霉落葉?。–orynespora leaf fall disease）是亞洲和非洲天然橡膠產(chǎn)區(qū)最具破壞性的病害之一［1］。1936年在塞拉利昂首次發(fā)現(xiàn)［23］，現(xiàn)已在世界天然橡膠主產(chǎn)國普遍分布，并成為東南亞和中非橡膠樹最具破壞性的葉部病害。2006年我國云南河口和海南儋州首次發(fā)現(xiàn)該病［4］。該病害常造成橡膠樹周年反復(fù)落葉，葉片稀疏，甚至徹底落葉，植株生長遲緩，枝條回枯或整株死亡，膠乳稀薄，造成膠乳一般減產(chǎn)20%～45%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)70%［56］，該病害已對(duì)我國橡膠產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響［78］。然而目前關(guān)于該病菌的致病性機(jī)理研究主要集中于對(duì)毒素蛋白的鑒定、表達(dá)和檢測等方面，其他方面研究較少。

由多主棒孢分泌的毒素蛋白cassiicolin含有27個(gè)氨基酸，是富含半胱氨酸、糖基化的分泌蛋白，3個(gè)二硫鍵連接反向β折疊形成類似橢圓的三級(jí)結(jié)構(gòu)［910］。Cassiicolin蛋白N端存在1個(gè)信號(hào)肽（包含17個(gè)氨基酸）;C端序列被預(yù)測定位于細(xì)胞外［1112］。Cassiicolin蛋白由Cas基因編碼，該基因包含2個(gè)內(nèi)含子，根據(jù)菌內(nèi)是否存在Cas基因和基因序列的差異，將多主棒孢分為7個(gè)亞型：Cas0、Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5和Cas6，不同亞型的菌株致病力存在差異，其中Cas1亞型菌株的致病力最強(qiáng)［1112］。我國主要存在Cas2和Cas5亞型，其中Cas5為橡膠樹特有亞型［1314］，同時(shí)在紅鳳菜Gynura bicolor中發(fā)現(xiàn)新的亞型（Cas2.2）［13］。Cas2.2的序列與Cas2同源性為97%，存在2個(gè)氨基酸替換;Cas2.2與Cas1同源性為88%，存在4個(gè)氨基酸替換。通過對(duì)35個(gè)C.cassiicola的基因組測序，在巴西黃瓜Cucumis sativus上分離的3個(gè)菌株中發(fā)現(xiàn)了Cas7亞型［15］。Cas7基因與已報(bào)道的Cas基因的序列一致性為72.3%～76.7%，氨基酸序列一致性為71.9%～77.8%。敲除黃瓜和草莓上分離的多主棒孢的Cas2基因，并不影響菌株的形態(tài)、生長和致病力［1617］。而巴西橡膠樹上分離的多主棒孢的cc004-cas被敲除后，菌株的生長發(fā)育雖然不受影響，但致病力下降［18］。而將Cas1敲除后，菌株完全喪失對(duì)巴西橡膠樹的侵染能力［19］。王曉宇［20］的研究發(fā)現(xiàn)，多主棒孢的種內(nèi)分化與寄主相關(guān)，而與地理來源無關(guān)。Cas在侵染早期發(fā)揮作用，Cas5在孢子侵染感病品種和抗性品種的第1天和第2天達(dá)到表達(dá)高峰［11］。轉(zhuǎn)錄組測序檢測表達(dá)量，結(jié)果顯示Cas上調(diào)表達(dá)，侵染后24 h的表達(dá)量高于侵染后48 h［11，15］。

前期課題組在海南省橡膠樹種植區(qū)采集了300多份樣品，分離純化得到了35份橡膠樹棒孢霉落葉病菌，經(jīng)過PCR檢測均為Cas5亞型菌株，CcCas5在病原菌不同生長階段以及和與寄主不同互作時(shí)期的表達(dá)量有明顯差異［21］，推測CcCas5的表達(dá)受到特異性因子的調(diào)控，然而目前CcCas5表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究鮮有報(bào)道。

酵母單雜交技術(shù)是研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的經(jīng)典技術(shù)，可以利用基因啟動(dòng)子序列從cDNA表達(dá)文庫中篩選結(jié)合該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子，該技術(shù)已經(jīng)在玉米大斑病菌Setosphaeria turcica［22］、赤芝Ganoderma lucidum［23］、里氏木霉Trichoderma reesei［24］、棘豆鏈格孢Alternaria oxytropis［25］和摩西球囊霉Funneliformis mosseae［26］等病原物中得到應(yīng)用。因此，本研究擬通過克隆CcCas5上游2 600 bp的啟動(dòng)子序列，分析啟動(dòng)子的順式作用元件;構(gòu)建CcCas5基因啟動(dòng)子的酵母單雜交誘餌載體，篩選抑制誘餌載體背景的3-氨基-1，2，4-三唑（3-amino-1，2，4-triazole，3-AT）濃度，旨在為篩選與CcCas5啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子和研究CcCas5的轉(zhuǎn)錄調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化試劑購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。2×Mighty PCR Mix購自莫納生物有限公司。T4連接酶、EcoR I、Sac I、pHis2.1、pMD19-T、CHROMA SPIN+TE-400純化柱、pGADT7-Rec、SD/-Leu培養(yǎng)基、SD/-Trp/-His培養(yǎng)基、cDNA合成試劑盒和酵母轉(zhuǎn)化試劑盒（YeastmakerTM Yeast Trans-formation System 2）購自TaKaRa公司。3-氨基-1，2，4-三唑（3-amino-1，2，4-triazole，3-AT）、卡那霉素（Kana）、膠回收試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒和RNA提取試劑盒（RNAprep Pure）購自北京天根生化科技有限公司。引物的合成與測序由北京擎科生物科技有限公司完成。橡膠樹棒孢霉落葉病菌Corynespora cassiicola保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.2基因組DNA和RNA的提取

將保存于4℃的橡膠樹棒孢霉落葉病菌接種到PDA平板，28℃培養(yǎng)4 d。刮取PDA平板上的菌絲置于研缽，液氮速凍并研磨。采用CTAB法提取多主棒孢DNA。使用天根RNAprep Pure試劑盒提取多主棒孢總RNA。

1.3RNA反轉(zhuǎn)錄和雙鏈cDNA合成

反轉(zhuǎn)錄體系為：2 μL RNA、1 μL CDS Ⅲ和2 μL H2O，28℃處理2 min，之后加入2 μL 5×First-strand buffer， 1 μL DTT， 1 μL dNTPs和1 μL SMART MMLV Reverse Transcriptase，42℃處理10 min，之后加入SMART Ⅲ oligo，42℃處理60 min。第二鏈合成反應(yīng)體系為：2 μL First-strand cDNA、70 μL H2O、10 μL 10× Advantage 2 PCR Buffer、2 μL 50×dNTP Mix、2 μL 5′ PCR Primer、2 μL 3′ PCR Primer、10 μL 10×Melting Solution和2 μL 50×Advantage 2 Polymerase Mix。反應(yīng)程序?yàn)椋?95℃ 30 s;95℃ 10 s，68℃ 6 min，68℃ 5 min，28個(gè)循環(huán)。

1.4雙鏈cDNA純化

將93 μL雙鏈cDNA加入CHROMA SPIN+TE-400純化柱，700 g離心5 min，收集過柱液。過柱液中加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉和2.5倍體積的無水乙醇，-20℃沉淀過夜。14 000 r/min收集沉淀物，得到純化的cDNA，定容到20 μL，備用。

1.5文庫構(gòu)建

按照YeastmakerTM Yeast Trans-formation System 2說明書制備酵母感受態(tài)細(xì)胞和酵母轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化體系包括：2～5 μg 純化的cDNA、3 μg線性化pGADT7-Rec載體、0.2 μg Yeastmaker Carrier DNA和600 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化液涂布于SD/-Leu平板，于30℃培養(yǎng)5 d。文庫總?cè)萘?［SD/-Leu平板上菌落數(shù)×懸浮體積］/涂板體積。

1.6CcCas5啟動(dòng)子克隆與啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測使用Softberry在線網(wǎng)站的Gene finding in Eukaryota-FGENESH-HMM-based gene structure prediction （multiple genes， both chains），利用Ascomycetes里面的Corynespora cassiicola作為參考，對(duì)CcCas5所在的Sacffold 23進(jìn)行基因預(yù)測和基因結(jié)構(gòu)分析。以分析獲得的CcCas5啟動(dòng)子序列為候選序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)克隆CcCas5啟動(dòng)子全長的引物（pCas5-2600F/pCas5-R2，表1）。以橡膠樹棒孢霉落葉病菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增CcCas5基因啟動(dòng)子。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板1 μL，2×TaqPCR mix 20 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，超純水18 μL。PCR程序?yàn)椋?2℃ 3 min;92℃ 30 s， 58℃ 30 s， 72℃ 3 min， 45個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，切膠回收目標(biāo)片段并連接到pMD19-T載體，對(duì)重組質(zhì)粒pMD19-T-pCcCas5-2600進(jìn)行測序。利用PlantPAN4.0在線網(wǎng)站對(duì)CcCas5啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析，參數(shù)選擇所有物種。

1.7誘餌載體構(gòu)建與鑒定

利用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)攜帶EcoR I和Sac I內(nèi)切酶的引物（pHis-Cas5-1500F/pHis-Cas5-R和pHis-Cas5-1000F/pHis-Cas5-R，表1），以pMD19-T-pCcCas5-2600重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行分段PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段大小分別為1 500 bp和1 000 bp。利用1%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，回收目標(biāo)片段并連接至pMD19-T載體。使用內(nèi)切酶EcoR I和Sac I對(duì)重組質(zhì)粒及pHis2.1分別進(jìn)行雙酶切。利用1%瓊脂糖凝膠對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測，回收目標(biāo)片段。使用T4連接酶將回收片段與線性化的pHis2.1進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布在含有終濃度為50 μg/mL Kana的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落于含有Kana（50 μg/mL）的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)5～8 h。待培養(yǎng)液渾濁，使用pHis2.1載體引物（pHis2.1-F/pHis2.1-R）（表1）對(duì)菌液進(jìn)行PCR檢測。擴(kuò)大培養(yǎng)陽性克隆菌液并提取質(zhì)粒，利用EcoR I和Sac I對(duì)陽性質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切檢測。

1.8抑制誘餌載體自激活的3-AT濃度篩選

將構(gòu)建好的誘餌載體轉(zhuǎn)化至Y187酵母菌株，轉(zhuǎn)化液涂布到SD/-Trp平板上，30℃培養(yǎng)3～5 d，待菌落直徑大于2 mm，利用pHis2.1的載體引物（pHis2.1-F/pHis2.1-R）（表1）對(duì)酵母菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。將啟動(dòng)子誘餌載體轉(zhuǎn)化Y187酵母菌株，轉(zhuǎn)化液分別涂布于含0、10、25、50、100 mmol/L 3-AT的SD/-Trp/-His平板上，30℃培養(yǎng)3～5 d，觀察酵母菌的生長情況，酵母菌不能生長的最低3-AT濃度為適宜抑制濃度。

2結(jié)果與分析

2.1酵母單雜交cDNA文庫構(gòu)建

橡膠樹棒孢霉落葉病菌總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，28S和18S條帶清晰，OD260/OD280為1.92，RNA質(zhì)量可以用于后續(xù)試驗(yàn)。在反轉(zhuǎn)錄PCR的第21至第28個(gè)循環(huán)各取5 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測，結(jié)果顯示，隨著循環(huán)數(shù)的增加，PCR產(chǎn)物濃度逐漸增大，cDNA片段主要分布于0.25～3.0 kb之間。對(duì)cDNA進(jìn)行純化，純化的cDNA大小為0.25～3.0 kb，總量為4.06 μg（203 ng/μL）。在SD/-Leu平板上生長菌落數(shù)量平均為583個(gè)，文庫總?cè)萘繛?.49×106 cfu。文庫插入片段主要分布于750～2 000 bp之間（圖1），重組率為95.8%。文庫質(zhì)量滿足下一步試驗(yàn)的需求。

2.2CcCas5啟動(dòng)子克隆

橡膠樹棒孢霉基因組注釋結(jié)果顯示，CcCas5位于Sacffold 23上。經(jīng)分析，共預(yù)測得到6個(gè)基因，基因1、基因2和基因6的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)樨?fù)鏈的5′-3′;基因3、基因4和基因5的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)檎?′-3′（圖2）。基因4為CcCas5基因，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成。CcCas5的5′UTR序列為2 634 bp?？紤]到序列太長和序列的準(zhǔn)確性可能會(huì)影響序列的擴(kuò)增，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，分別擴(kuò)增CcCas5前2 600 bp和2 000 bp的啟動(dòng)子序列。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，2個(gè)PCR反應(yīng)分別獲得2個(gè)條帶。一條PCR產(chǎn)物的大于2 000 bp，另一條PCR產(chǎn)物大小與2 000 bp接近。經(jīng)DNA測序，其擴(kuò)增序列為2 600 bp和2 000 bp，序列與CcCas5啟動(dòng)子序列一致。結(jié)果表明克隆獲得CcCas5基因的啟動(dòng)子序列。

2.3啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用PlantPAN在線網(wǎng)站對(duì)CcCas5啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件預(yù)測，共獲得1 294個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。保留真菌主要轉(zhuǎn)錄因子類型且相似度為100%的預(yù)測結(jié)果，獲得10大類轉(zhuǎn)錄因子的165個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。GATA、HD-TALE、bZIP、ZF-HD和bHLH的結(jié)合位點(diǎn)超過10個(gè)。GATA結(jié)合位點(diǎn)最多，66個(gè)結(jié)合位點(diǎn)分布于整個(gè)啟動(dòng)子。25個(gè)HD-TALE結(jié)合位點(diǎn)集中分布在1-500 nt和1 000-2 500 nt。bZIP的結(jié)合位點(diǎn)多集中在800、1 700 nt 和2 200 nt位置。ZF-HD的結(jié)合位點(diǎn)集中在1 500-1 800 nt。bHLH結(jié)合位點(diǎn)分布在100 nt和1 000 nt至2 000 nt之間。C2H2結(jié)合位點(diǎn)主要分布在400-1 200 nt。4個(gè)C3H結(jié)合位點(diǎn)分布在78、508、628 nt和1 203 nt的位置。4個(gè)HD-ZIP結(jié)合位點(diǎn)分布在124、586、1 065、1 858 nt和1 859 nt的位置。3個(gè)HSF位點(diǎn)位于DNA正鏈的152、1 351 nt 和1 489 nt的位置。1個(gè)MADS位于正鏈1 204 nt。

2.4啟動(dòng)子誘餌載體構(gòu)建

通過PCR反應(yīng)，擴(kuò)增獲得1 000 bp和1 500 bp的啟動(dòng)子序列（圖3a）。將2條擴(kuò)增序列連接pMD19-T載體。經(jīng)EcoR I和Sac I雙酶切后，將pMD19-T-pCcCas5-1500和pMD19-T-pCcCas5-1000攜帶的片段連接到pHis2.1載體。雙酶切結(jié)果顯示，pHis2.1-pCcCas5-1000出現(xiàn)兩條帶，分別為載體帶和1 000 bp的目標(biāo)條帶;pHis2.1-pCcCas5-1500出現(xiàn)兩條帶，分別為載體帶和1 500 bp的目標(biāo)帶（圖3b）。測序結(jié)果表明插入pMD19-T和pHis2.1載體的1 000 bp和1 500 bp序列，與CcCas5啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)序列一致。經(jīng)EcoR I和Sac I雙酶切和測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了長度為1 000 bp和1 500 bp的CcCas5啟動(dòng)子誘餌載體。

2.5抑制誘餌載體自激活3-AT濃度

誘餌載體轉(zhuǎn)化Y187酵母菌株后，接種于含0、10、25、50 mmol/L和100 mmol/L 3-AT的SD/-Trp/-His平板上。結(jié)果顯示（圖4），攜帶誘餌載體pHis2.1-pCcCas5-1000和pHis2.1-pCcCas5-1500的酵母菌可以在含0 mmol/L 3-AT的SD/-Trp/-His平板上生長，而在含有10、25、50 mmol/L和100 mmol/L 3-AT的SD/-Trp/-His平板上不能生長。由結(jié)果可知，10 mmol/L 的3-AT能抑制含pHis2.1-pCcCas5-1000和pHis2.1-pCcCas5-1500酵母菌的自激活。

3結(jié)論與討論

多主棒孢Corynespora cassiicola的Cas5亞型是巴西橡膠樹特有亞型，Cas5基因編碼cassiicolin毒素蛋白，但缺乏Cas5基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究。本研究構(gòu)建了用于酵母單雜交的cDNA表達(dá)文庫;克隆了多主棒孢Corynespora cassiicola的CcCas5基因的啟動(dòng)子，并分析了該基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件;構(gòu)建了用于酵母單雜交的誘餌載體。

酵母單雜交是目前研究DNA-蛋白互作，尤其是轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件互作的經(jīng)典方法之一。本研究用于酵母單雜交試驗(yàn)的Y187酵母菌株為合成組氨酸（His）基因突變菌株，無法在缺少組氨酸的培養(yǎng)基上生長［27］。pHis2.1攜帶組氨酸合成酶，能回補(bǔ)Y187的組氨酸突變，使Y187能在缺少組氨酸的培養(yǎng)基上生長［28］。攜帶啟動(dòng)子序列的pHis2.1載體轉(zhuǎn)入酵母后，存在背景表達(dá)，3-AT是酵母組氨酸合成酶的競爭性抑制劑［2930］，在培養(yǎng)基中加入不超過50 mmol/L的3-AT可以抑制His的背景表達(dá)［31］，減少篩庫假陽性。通過試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)10 mmol/L的3-AT能抑制誘餌載體的自激活，該抑制濃度低于50 mmol/L，說明CcCas5啟動(dòng)子在酵母中的背景生長水平較低，有利于減少假陽性。

文庫質(zhì)量決定了酵母單雜交篩庫試驗(yàn)的成敗，而文庫質(zhì)量與文庫庫容和文庫插入片段長度相關(guān)。文庫容量大于1×106 cfu才能保證獲得陽性克隆;插入cDNA片段盡可能長才能表達(dá)完整的閱讀框［32］。C.cassiicola CDS平均長度為1 417.86 bp［21］。本研究構(gòu)建的C.cassiicola酵母單雜交cDNA表達(dá)文庫總?cè)萘窟_(dá)到3.49×106 cfu，插入片段主要分布于750 bp至2 000 bp之間。文庫cDNA插入片段的長度與C.cassiicola基因組CDS平均長度接近，說明文庫質(zhì)量達(dá)到指標(biāo)且插入片段有較好的完整性。

研究發(fā)現(xiàn)真菌存在795個(gè)假定的、歸為43個(gè)家族的轉(zhuǎn)錄因子，目前僅報(bào)道了10大類轉(zhuǎn)錄因子的功能，這些轉(zhuǎn)錄因子涉及生長、分化、繁殖、代謝和響應(yīng)脅迫。Cassiicolin毒素是含有信號(hào)肽的分泌型蛋白［6，911］。目前發(fā)現(xiàn)Zn2Cys6、Cys2His2、HD/Hox和Velvet涉及調(diào)控病原菌中分泌效應(yīng)子基因的轉(zhuǎn)錄［3334］。我們?cè)贑cCas5的啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了29個(gè)HD/Hox（25個(gè)HD-TALE和4個(gè)ZF-HD）和9個(gè)Cys2His2（C2H2）轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，沒有發(fā)現(xiàn)真菌中數(shù)量最多一類轉(zhuǎn)錄因子（Zn2Cys6）的結(jié)合位點(diǎn)，因此我們推測Cys2His2和HD/Hox類轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控CcCas5的轉(zhuǎn)錄。

參考文獻(xiàn)

［1］時(shí)濤， 李博勛， 馮艷麗， 等. 橡膠樹棒孢霉落葉病對(duì)中國天然橡膠及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的安全性評(píng)估［J］. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2019， 39（8）： 6671.

［2］ROMRUENSUKHAROM P， TRAGOONRUNG S， VANAVICHIT A， et al. Genetic variability of Corynespora cassiicola populations in Thailand ［J］. Journal of Rubber Research， 2005， 8（1）： 3849.

［3］SHUIB S S， DEON M， MAHYUDDIN M M， et al. Cassiicolin genes among Corynespora cassiicola isolates from rubber plantations in Malaysia ［J］. Journal of Rubber Research， 2015， 18（2）： 109126.

［4］PU Jinji，ZHANG Xin，QI Yangxian， et al. First record of Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber tree in China ［J］. Australasian Plant Disease Notes， 2007， 2（1）： 3536.

［5］JAYASINGHE C K. Leaf fall disease： gcSwoFF7Fl40JWugbZl+zzg==reat threat to word NR industry ［J］. Rubber Asia， 1997， 11（6）： 5556.

［6］LIU Xiaomei， QI Yanxiang， ZHANG Xin， et al. Infection process of Corynespora cassiicola， tagged with GFP on Hevea brasiliensis ［J］. Australasian Plant Pathology， 2014， 43（5）： 523525.

［7］蔡吉苗， 陳瑤， 潘羨心， 等. 海南橡膠樹棒孢霉落葉病病情調(diào)查與病原鑒定［J］. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2008， 28（5）： 17.

［8］李博勛， 劉先寶， 蔡吉苗， 等. 中國橡膠樹棒孢霉落葉病疫情調(diào)查及其發(fā)生規(guī)律初探［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2015， 36（11）： 20582066.

［9］DE LAMOTTE F， DUVIAU M P， SANIER C， et al. Purification and characterization of cassiicolin， the toxin produced by Corynespora cassiicola， causal agent of the leaf fall disease of rubber tree ［J］. Journal/hZxYyzbzlc+YfyflUL6Qw== of Chromatography， 2007， 849（1/2）： 357362.

［10］BARTHE P， PUJADE-RENAUD V， BRETON F， et al. Structural analysis of cassiicolin， a host-selective protein toxin from Corynespora cassiicola ［J］. Journal of Molecular Biology， 2007， 367（1）： 89101.

［11］DON M， BOURR Y， GIMENEZ S， et al. Characterization of a cassiicolin-encoding gene from Corynespora cassiicola， pathogen of rubber tree （Hevea brasiliensis） ［J］. Plant Science， 2012（185/186）： 227237.

［12］DON M， FUMANAL B， GIMENEZ S， et al. Diversity of the cassiicolin gene in Corynespora cassiicola and relation with the pathogenicity in Hevea brasiliensis ［J］. Fungal Biology， 2014， 118（1）： 3247.

［13］WU Jun， XIE Xuewen; SHI Yanxia， et al. Variation of cassiicolin genes among Chinese isolates of Corynespora cassiicola ［J］. The Journal of Microbiology， 2018， 56（9）： 634647.

［14］李博勛， 劉先寶， 馮艷麗， 等. 橡膠樹多主棒孢病菌cassiicolin基因條形碼數(shù)據(jù)庫構(gòu)建及分子檢測技術(shù)［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2019， 40（9）： 17701782.

［15］LOPEZ D， RIBEIRO S， LABEL P， et al. Genome-wide analysis of Corynespora cassiicola leaf fall disease putative effectors ［J/OL］. Frontiers in Microbiology， 2018， 9： 276. DOI： 10.3389/fmicb.2018.00276.

［16］薛彩英， 武海燕， 侯夢(mèng)圓， 等. 草莓多主棒孢霉小柱孢酮脫水酶基因CcSCD1的功能研究［J］. 植物病理學(xué)報(bào)， 2022， 53（1）： 2536.

［17］侯夢(mèng)圓， 武海燕， 何雨芯， 等. 多主棒孢CcCas2基因純合敲除突變體構(gòu)建及致病功能［J］. 菌物學(xué)報(bào)， 2023， 42（8）： 17011717.

［18］劉曉妹， 鄭服叢， 張欣， 等. 巴西橡膠樹棒孢霉落葉病菌毒素基因cc004-cas克隆及致病作用［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2014， 35（9）： 18091815.

［19］RIBEIRO S， TRAN D M， DON M， et al. Gene deletion of Corynespora cassiicola cassiicolin Cas1 suppresses virulence in the rubber tree ［J］. Fungal Genetics and Biology， 2019， 129： 101114.

［20］王曉宇. 橡膠樹棒孢霉落葉病病原菌種內(nèi)分化研究［D］. ?？冢?海南大學(xué)， 2022.

［21］曲建楠. 海南橡膠樹棒孢霉落葉病菌毒素基因鑒定及基因組學(xué)分析［D］. 大慶： 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)， 2020.

［22］賈慧， 郭麗婕， 孟慶江， 等. 玉米大斑病菌黑色素合成還原酶基因酵母單雜交報(bào)告載體的構(gòu)建［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 54（14）： 35423545.

［23］徐曉蘭， 朱風(fēng)麗， 賴榮才， 等. 赤芝LS基因酵母單雜交文庫構(gòu)建及其上游調(diào)控因子的篩選［J］. 中國中藥雜志， 2019， 44（18）： 39673973.

［24］XU Wenqiang， REN Yajing， XIA Yuxiao， et al. A novel transcriptional repressor specifically regulates xylanase gene 1 in Trichoderma reesei ［J/OL］. Biotechnology for Biofuels and Bioproducts， 2023， 16（1）： 161. DOI： 10.1186/s13068-023-02417-w.

［25］XUE Jiaqi， ZHANG Haodong， ZHAO Qinmei， et al. Construction of yeast one-hybrid library of Alternaria oxytropis and screening of transcription factors regulating swnK gene expression ［J/OL］. Journal of Fungi， 2023， 9（8）： 822. DOI： 10.3390/jof9080822.

［26］SUN Zhongfeng， SONG Jiabin， XIN Xi’an， et al. Arbuscular mycorrhizal fungal 14-3-3 proteins are involved in arbuscule formation and responses to abiotic stresses during AM symbiosis ［J/OL］. Frontiers in Microbiology， 2018， 9： 91. DOI： 10.3389/fmicb.2018.00091.

［27］HARPER J W， ADAMI G R， WEI Nan， et al. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases ［J］. Cell， 1993， 75： 805816.

［28］WANG Jingwen， WANG Jingxin， YE Zhu， et al. Building an improved transcription factor-centered yeast one hybrid system to identify DNA motifs bound by protein comprehensively ［J/OL］. BMC Plant Biology， 2023， 23（1）： 236. DOI： 10.1186/s12870-023-04241-8.

［29］FIELDS S. The two-hybrid system to detect protein-protein interactions ［J］. Methods， 1993， 5（2）： 116124.

［30］DURFEE T， BECHERER K， CHEN P L， et al. The retinoblastoma protein associates with the protein phosphatase type 1 catalytic subunit ［J］. Genes Development， 1993， 7（4）： 555569.

［31］楊子平， 孫藝桓， 楊倩， 等. 劍麻酵母雙雜交cDNA表達(dá)文庫的構(gòu)建及與AhKNOX2相互作用蛋白的篩選［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2020， 41（9）： 17481755.

［32］楊子平，楊倩，汪詢，等. 劍麻均一化文庫構(gòu)建及PnRXLR5863靶蛋白篩選［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2023， 44（2）： 246253.

［33］ZURIEGAT Q， ZHENG Yuru， LIU Hong， et al. Current progress on pathogenicity-related transcription factors in Fusarium oxysporum ［J］. Molecular Plant Pathology， 2021， 22（7）： 882895.

［34］JOHN E， SINGH K B， OLIVER R P， et al. Transcription factor control of virulence in phytopathogenic fungi ［J］. Molecular Plant Pathology， 2021， 22（7）： 858881.

（責(zé)任編輯：楊明麗）