牛筋草PFK蛋白多克隆抗體的制備及其在草甘膦抗性鑒定上的應(yīng)用

摘要抗草甘膦牛筋草中磷酸果糖激酶（PFK）與靶標(biāo)酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）的含量存在線性關(guān)系，是牛筋草對草甘膦產(chǎn)生抗性的指示蛋白之一。為實現(xiàn)抗草甘膦牛筋草的快速鑒定，本研究克隆了牛筋草PFK全長基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，并免疫大兔最終獲得多克隆抗體，進(jìn)一步對抗體的特異性和靈敏性進(jìn)行了檢測，并用該抗體對抗性牛筋草進(jìn)行了檢測鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PFK基因全長1 656 bp，編碼551個氨基酸，該基因的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-PFK經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)的蛋白大小為45 kD，蛋白純化后濃度為3.5 mg/mL。制備的多克隆抗體能特異地識別牛筋草PFK蛋白，稀釋512 000倍后仍可檢測到抗原，并能夠準(zhǔn)確鑒定PFK不同表達(dá)量的抗性牛筋草。結(jié)果表明：本研究制備的PFK多克隆抗體具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點，可鑒定EPSPS過表達(dá)的抗草甘膦牛筋草，這為牛筋草對草甘膦抗藥性的快速鑒定提供了實用工具。

關(guān)鍵詞磷酸果糖激酶;牛筋草;多克隆抗體;草甘膦;抗藥性

中圖分類號：S 451.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023453Preparation of polyclonal antibody against PFK protein and application

in identification of glyphosate resistance in Eleusine indicaCHEN Jingchao LI Zhiling CUI Hailan YU Haiyan MA Yufei LI Xiangju（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy

of Agricultural Sciences， Beijing100193， China; 2. Jining Normal University， Ulanqab012000， China）AbstractPhosphofructokinase （PFK） is one of8gbtRgdvOn/Morru/hyp2w== the indicator proteins for glyphosate resistance in goosegrass Eleusine indica as the content of PFK is positive correlation with the target 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase （EPSPS）. In this study， the full-length of PFK gene was cloned from E.indica， the prokaryotic expression vector pGEX-4T-1-PFK was constructed and polyclonal antibodies were obtained by immunizing rabbits. Then， the specificity and sensitivity of the antibody were detected. Results showed that the full length of PFK gene is 1 656 bp， encoding 551 amino acids. A 45 kD recombinant protein with the concentration of 3.5 mg/mL was obtained after IPTG induction and purification. The antibody could only specifically recognize the PFK protein of E.indica， and the antigen can still be detected when antibody was diluted by 512 000 times. The antibody could quickly identify the PFK protein and accurately identify the resistant goosegrass with different levels of PFK expression. These results suggested the PFK polyclonal antibody could identify glyphosate-resistant E.indica caused by EPSPS overexpression. This provides a practical tool for rapid identification of resistance to glyphosate for E.indica.

Key wordsphosphofructokinase;Eleusine indica;polyclonal antibody;glyphosate;herbicide resistance

惡性雜草牛筋草Eleusine indica （L.） Gaertn.是一年生禾本科穇屬植物，分布在溫帶和熱帶地區(qū)［1］。在我國的果園、棉田、玉米、西甜瓜等作物田危害嚴(yán)重，可造成減產(chǎn)20%［2］。草甘膦是一種廣譜、非選擇性的有機(jī)磷類除草劑，可有效地防除牛筋草等一年生及多年生雜草，是目前全球用量最大的除草劑之一［3］。由于長期高頻應(yīng)用，全球已報道了58種雜草對草甘膦產(chǎn)生抗性［4］，在我國廣東、廣西等省（區(qū)）牛筋草對草甘膦產(chǎn)生了較高水平的抗性，主要發(fā)生在果園、茶園、棉田等作物田［58］。隨著我國生物育種產(chǎn)業(yè)化的逐步推進(jìn)，草甘膦的應(yīng)用范圍將會明顯擴(kuò)大［9］。在生長初期快速鑒定抗性植株，對于控草策略的合理制定，阻斷抗性雜草的傳播蔓延都有重要意義。目前，抗草甘膦雜草的檢測方法仍以整株生物測定為主，該方法周期較長;靶標(biāo)基因突變或過表達(dá)分析等分子技術(shù)耗時相對較短，但是對儀器和操作技術(shù)都有較高的要求。操作簡單、能夠快速辨別抗草甘膦雜草的方法是目前的重要需求之一。酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）是檢測蛋白含量的簡便方法，耗時短，對儀器操作的技術(shù)要求相對較低，而制備穩(wěn)定性強(qiáng)、靈敏度高的多克隆及單克隆抗體是ELISA檢測試劑盒研發(fā)的核心。目前已報道了多種有害生物抗體，如：魔芋花葉病毒（konjac mosaic virus， KoMV）［10］、菊花B病毒（chrysanthemum virus B， CVB）［11］、馬鈴薯卷葉病毒（potato leafroll virus， PLRV）［12］等多克隆抗體，以及不同作物花葉病毒的單克隆抗體［1315］。

5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS，EC2.5.1.19）是草甘膦的靶標(biāo)酶，草甘膦競爭性抑制該酶的活性，阻斷了植物體內(nèi)芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的合成而引起植物死亡［3］。研究發(fā)現(xiàn)，靶標(biāo)基因EPSPS過量表達(dá)是牛筋草對草甘膦產(chǎn)生抗性的常見抗性機(jī)制，抗性牛筋草的EPSPS與磷酸果糖激酶基因（PFK）轉(zhuǎn)錄水平、拷貝數(shù)及蛋白表達(dá)量都存在線性關(guān)系［16］，因此PFK可以作為牛筋草對草甘膦產(chǎn)生該類抗性的指示蛋白。為開發(fā)一種快速鑒定抗草甘膦牛筋草的新方法，本研究克隆了牛筋草PFK基因，構(gòu)建了原核表達(dá)載體以獲取純化PFK蛋白，免疫大兔后獲得多克隆抗體，對抗體的效價和特異性進(jìn)行了檢測，并成功應(yīng)用于快速鑒定抗性牛筋草植株。

1材料與方法

1.1試驗材料

抗草甘膦牛筋草種子采集于浙江省麗水市松陽縣西屏街道（119°30′E，28°28′N），敏感牛筋草種子采集于附近無草甘膦施用歷史的荒地。Escherichia coli Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，限制性內(nèi)切酶（EcoRⅠ、Not Ⅰ），DNA產(chǎn)物回收試劑盒，Ni柱，完全弗氏佐劑，非完全弗氏佐劑，SuperReal熒光定量預(yù)混試劑購于天根生化科技（北京）有限公司;高純度RNA提取試劑盒，All-in-One反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)股份有限公司;植物蛋白質(zhì)提取試劑盒和BCA蛋白定量分析試劑盒購自北京賽諾博生物技術(shù)中心;內(nèi)參蛋白Actin購于湖北武漢愛博泰克生物科技有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2PFK基因的克隆及構(gòu)建原核表達(dá)載體

1.2.1PFK基因的克隆

根據(jù)NCBI中登錄的PFK序列（KU549087.1），設(shè)計2對引物克隆PFK基因全長，A-F：5′-CGCGCAAAGCCCATCCAAA-3′，A-R：5′-TTCCTGAA-GCATCTTTCCCAAT-3′;B-F：5′-CTTGACCCCA-AAATGCGTAAA-3′，B-R：5′-GTGTGAAAAAA-AATCGCCTGC-3′ijMzFU7QNVX5JRU7XCi/DQAlRWGYabK/T2nZRffi70o=，引物合成及PCR產(chǎn)物測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，序列驗證后委托北京擎科新業(yè)生物科技有限公司人工合成牛筋草PFK基因至載體pUC57，得到PFK基因凍干質(zhì)粒。

1.2.2構(gòu)建原核表達(dá)載體

利用CFSSP蛋白二級結(jié)構(gòu)在線分析工具、TopPred 1.10蛋白疏水性在線分析工具和Parker Antigenicity Plot蛋白免疫原性在線分析工具對氨基酸序列進(jìn)行分析。根據(jù)軟件分析結(jié)果，設(shè)計引物克隆目的片段。上游引物5′-ATGGCGCAGCCGCCGGCATGGCGCAGCCGCCGGC-3′，下游引物：5′-

ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATCTCATC-TGACTCAAAATAGACCCTT-3′，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。以PFK基因凍干質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，使用凝膠回收試劑盒純化回收備用。

將載體pGEX-4T-1用限制性內(nèi)切酶37℃雙酶切過夜，回收載體片段。將目的基因片段與載體進(jìn)行連接，16℃水浴過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，重取1 μL進(jìn)行菌液PCR，反應(yīng)結(jié)束后使用1%瓊脂糖凝膠檢測，選取陽性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3PFK重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將含有原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-PFK的菌液接種至LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至OD值達(dá)到0.5，加入0.8 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)4 h。收集菌體，破碎后離心并取上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測是否有單一條帶。將上清溶液經(jīng)Ni柱純化后，檢測純化結(jié)果。

1.4PFK蛋白多克隆抗體的制備

飼養(yǎng)實驗級日本大耳白兔2只，待兔子長至2 kg左右時，將純化的重組蛋白0.6 mg與完全弗氏佐劑1∶1混合進(jìn)行第1次皮下注射免疫;間隔14 d后，將0.3 mg抗原與非完全弗氏佐劑1∶1混合進(jìn)行第2次免疫;第3、4次免疫與前一次間隔14 d，免疫方法一致;第4次免疫12 d后，收集抗血清。使用His-MBP重組蛋白抗原偶聯(lián)NHS活化的瓊脂糖柱，親和純化抗血清，得到高純度的牛筋草PFK蛋白多克隆抗體，保存于-80℃。

1.5PFK蛋白多克隆抗體的檢測

1.5.1PFK蛋白多克隆抗體的特異性檢測

將純化后的PFK抗體作為一抗，PFK重組蛋白作為靶標(biāo)蛋白，并稀釋至不同的含量（0.5， 1， 5， 10 mg/L）。以植物通用的內(nèi)參蛋白Actin（武漢愛博泰克生物科技有限公司）為非靶標(biāo)蛋白，依次稀釋（0.5， 1， 5， 10 mg/L）作為對照蛋白。PFK蛋白和Actin蛋白（10 μL）分別經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，用1∶1 000稀釋的抗體進(jìn)行Western blot檢測。

1.5.2PFK蛋白多克隆抗體的靈敏性檢測

將PFK蛋白多克隆抗體稀釋后，每孔中加入125 ng PFK重組蛋白作為靶標(biāo)蛋白。將樣品加入酶標(biāo)板內(nèi)，輕晃;37℃溫育30 min;棄液體，甩干，加洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次;每孔加入50 μL酶標(biāo)試劑;再次溫育洗滌后加入50 μL顯色劑A，再加入50 μL顯色劑B，輕輕振蕩混勻，37℃避光15 min;每孔加50 μL終止液終止反應(yīng);450 nm波長下測量各孔的吸光度。根據(jù)吸光值以及微孔的液體顏色可分析抗體的靈敏性。

1.6PFK蛋白多克隆抗體的應(yīng)用

種植敏感型和抗性牛筋草，置于溫室培養(yǎng)至5～6葉期，每個種群選取20株植株，剪取新鮮的葉片迅速置于液氮中，保存于-80℃。使用高純度RNA提取試劑盒提取RNA，并定量至1 000 ng/μL后，使用All-in-One反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。使用SuperReal熒光定量試劑盒檢測PFK基因表達(dá)量。根據(jù)牛筋草PFK基因序列，設(shè)計特異性引物，上游引物為5′-GCCAAAGGGTCTATTTTGAGTC-3′;下游引物5′-AAGCCTCTATACCCACCCTGA-3′。選取ALS基因作為內(nèi)參基因，上游引物5′-GCAAT-TTCCCCAGTGACGACC-3′，下游引物5′-GCAAA-AGCCTCTATCTTCCCTGT-3′［17］，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PFK基因的相對表達(dá)量根據(jù)2-△△Ct公式得出［18］。

根據(jù)qPCR篩選PFK相對低表達(dá)、中表達(dá)及高表達(dá)的抗性牛筋草及敏感植株，使用植物蛋白質(zhì)提取試劑盒提取總蛋白。具體步驟為：取牛筋草葉片組織約100 mg，加入抽提試劑0.5 mL，勻漿處理;冰上孵育20 min后，4℃離心20 min;收集上清中的可溶性蛋白，并經(jīng)BCA蛋白定量分析試劑盒進(jìn)行蛋白定量，最后將可溶性蛋白放置在4℃?zhèn)溆谩Ｌ崛〉鞍踪|(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳后，經(jīng)半干轉(zhuǎn)膜儀，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，以5％的脫脂奶粉（TBST緩沖液溶解）在4℃條件下，封閉2 h;加入純化的多克隆抗體（1∶1 000），4℃下，反應(yīng)12 h;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1∶2 000），在37℃條件下，反應(yīng)1 h;采用化學(xué)發(fā)光顯色，根據(jù)條帶亮度判斷抗草甘膦牛筋草植株。

2結(jié)果與分析

2.1PFK原核表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物測序及序列比對，得到PFK基因全長，該基因含有1 656個堿基，共編碼551個氨基酸。設(shè)計引物進(jìn)行克隆、擴(kuò)增后獲得大小為450 bp的基因片段，回收、純化后構(gòu)建到載體pGEX-4T-1上，載體構(gòu)建完成后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到清晰、單一與預(yù)期大小一致的特定條帶（圖1），條帶在500 bp左右。陽性菌株送至北京擎科公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明序列與預(yù)期結(jié)果一致，證明原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-PFK構(gòu)建成功。

2.2PFK重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

含有pGEX-4T-1-PFK載體的菌液經(jīng)誘導(dǎo)處理后，取上清進(jìn)行SDS-PAGE，檢測到一條明顯的蛋白條帶（圖2a），在45 kD左右，與預(yù)期結(jié)果一致。將上清溶液通過Ni柱純化后，再次SDS-PAGE檢測，與純化前相比，雜帶數(shù)目明顯減少，目標(biāo)蛋白條帶清晰明顯（圖2b）。

2.3PFK蛋白多克隆抗體的制備

將純化的PFK重組蛋白作為抗原，按照免疫計劃多次免疫日本大耳白兔，血液處理后，將含有多克隆抗體的血清使用瓊脂糖柱純化，得到高純度的牛筋草PFK蛋白多克隆抗體?？贵w的濃度可達(dá)到3.5 mg/mL。

2.4PFK蛋白多克隆抗體的檢測結(jié)果

2.4.1PFK蛋白多克隆抗體的特異性

Western blot方法分別檢測牛筋草PFK蛋白和植物Actin蛋白與PFK多克隆抗體的反應(yīng)，結(jié)果如圖3所示，抗體與牛筋草PFK蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，低濃度下仍可呈現(xiàn)微弱的條帶，條帶大小與圖2一致。而不同濃度的Actin蛋白沒有任何條帶。表明本試驗制備的多克隆抗體具有較高的特異性，可以用于檢測牛筋草體內(nèi)的PFK蛋白。

2.4.2PFK蛋白多克隆抗體的靈敏性

將多克隆抗體按1∶1 000至1∶512 000進(jìn)行倍比稀釋，包被于酶標(biāo)板中，加入PFK重組蛋白后經(jīng)過孵育、洗板、顯色等處理后在450 nm波長下，抗體所在微孔的吸光度如表1結(jié)果顯示。當(dāng)抗體在稀釋512 000倍之后，仍能檢測到抗原，證明本試驗制備的多克隆抗體靈敏性高。

2.5利用PFK蛋白多克隆抗體鑒定抗草甘膦的牛筋草通過qPCR檢測牛筋草PFK基因的表達(dá)量，敏感與抗性牛筋草的表達(dá)量存在明顯差異。挑選PFK基因低、中、高表達(dá)量的牛筋草提取蛋白用于檢測多克隆抗體的靈敏性。敏感和抗性牛筋草的蛋白與純化的多克隆抗體反應(yīng)后，可見雜交條帶（圖4），抗性植株的條帶信號明顯高于敏感植株。在抗性種群中，PFK表達(dá)量高的植株條帶粗且深，表達(dá)量低的條帶清晰，且信號明顯亮于敏感植株?？梢娕＝畈莸腜FK基因表達(dá)量越高，雜交條帶越粗，PFK多克隆抗體能夠特異性快速識別牛筋草體內(nèi)的PFK蛋白，可用于鑒定抗草甘膦牛筋草。

3結(jié)論與討論

本實驗室在前期對牛筋草轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析及后續(xù)驗證中發(fā)現(xiàn)，抗性牛筋草的EPSPS和PFK基因表達(dá)量較敏感植株都發(fā)生了上調(diào)，其中PFK基因表達(dá)量是敏感型的7.1～19.9倍，EPSPS表達(dá)量是敏感型的5.7～12.9倍，兩基因的表達(dá)在不同植株中存在線性關(guān)系［16］。該現(xiàn)象在不同區(qū)域的抗草甘膦牛筋草中都有發(fā)現(xiàn)，基因組測序發(fā)現(xiàn)，EPSPS與PFK基因在染色體組的亞端粒部位上存在連鎖擴(kuò)增的現(xiàn)象［19］。該結(jié)果進(jìn)一步驗證了兩基因表達(dá)存在線性關(guān)系的現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)PFK基因編碼序列全長1 656 bp，編碼551個氨基酸，獲得的PFK多克隆抗體純化后濃度達(dá)到3.5 mg/mL。經(jīng)檢測，該抗體稀釋512 000倍后仍可檢測到抗原，且只與牛筋草PFK蛋白有特異性反應(yīng)，反應(yīng)條帶信號的強(qiáng)弱可用于判斷牛筋草PFK蛋白的含量。因此，通過比對疑似抗性與敏感植株P(guān)FK蛋白與抗體反應(yīng)的條帶差異，可鑒定抗草甘膦牛筋草植株。PFK基因與黍稷Panicum miliaceum、柳枝稷P.virgatum、高粱Sorghum bicolor、玉米Zea mays的PFK基因序列相似性高達(dá)88%，其蛋白的氨基酸則有95%以上的相似性，推測本試驗制備的抗體也可同時識別其他物種的PFK蛋白。本研究制備的牛筋草PFK多克隆抗體具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點，可快速檢測鑒定EPSPS過表達(dá)的抗草甘膦牛筋草。但是，多克隆抗體的田間應(yīng)用還需要大量工作，需建立相關(guān)的定性標(biāo)準(zhǔn)以減少誤差。

參考文獻(xiàn)

［1］HOLM L G， PLUCKNETT D L， PANCHO J V， et al. The world’s worst weeds： distribution and biology ［M］. Honolulu， USA： University Press of Hawaii， 1977.

［2］MA Xiaoyan， WU Hanwen， JIANG Weili， et al. Goosegrass （Eleusine indica） density effects on cotton （Gossypium hirsutum） ［J］. Journal of Integrative Agriculture， 2015， 14（9）： 17781785.

［3］DUKE S O. The history and current status of glyphosate ［J］. Pest Management Science， 2018， 74（5）： 10271034.

［4］The international herbicide-resistant weed database ［EB/OL］. ［20230826］.www.weedscience.org.

［5］ZHANG Chun， FENG Li， HE Tingting， et al. Investigating the mechanisms of glyphosate resistance in goosegrass （Eleusine indica） population from South China ［J］. Journal of Integrative Agriculture， 2015， 14（5）： 909918.

［6］CHEN Jingchao， CUI Hailan， MA Xiaoyan， et al. Distribution differences in the EPSPS gene in chromosomes between glyphosate-resistant and glyphosate-susceptible goosegrass （Eleusine indica） ［J］. Weed Science， 2020， 68（1）： 3340.

［7］CHEN Jingchao， HUANG Hongjuan， WEI Shouhui， et al. Glyphosate resistance in Eleusine indica： EPSPS overexpression and P106A mutation evolved in the same individuals ［J］. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2020， 164： 203208.

［8］CHEN Jingchao， HUANG Hongjuan， WEI Shouhui， et al. Characterization of glyphosate-resistant goosegrass （Eleusine indica） populations in China ［J］. Journal of Integrative Agriculture， 2015， 14（5）： 919925.

［9］李香菊. 我國耐除草劑轉(zhuǎn)基因作物研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景［J］. 植物保護(hù)， 2023， 49（5）： 316324.

［10］唐國亮， 張玉寶， 王若愚， 等. 魔芋花葉病毒衣殼蛋白的原核表達(dá)和多克隆_{IMiGdpH4urv7mJ9Bkb7NwQ==}抗體制備［J］. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2022， 34（11）： 24712481.

［11］王瑋， 杜雪潔， 陳衛(wèi)良， 等. 利用菊花B病毒外殼蛋白特異片段進(jìn)行多克隆抗體的制備與分析［J］. 核農(nóng)學(xué)報， 2022， 36（12）： 23582365.

［12］吉祥， 宋志成， 韋曉玲， 等. 馬鈴薯卷葉病毒與S病毒重組雙CP多克隆抗體的制備［J］. 華北農(nóng)學(xué)報， 2022， 37（4）： 212219.

［13］陳浙， 宋革， 周雪平，等. 西瓜花葉病毒（WMV）單克隆抗體的制備及其應(yīng)用［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016， 49（14）： 27112724.

［14］劉歡， 李娜， 周雪平， 等. 中國小麥花葉病毒（CWMV）單克隆抗體制備及其檢測應(yīng)用［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報， 2015， 23（6）： 711719.

［15］于翠， 吳建祥， 周雪平. 番茄花葉病毒單克隆抗體的制備及檢測應(yīng)用［J］. 微生物學(xué)報， 2002， 42（4）： 453457.

［16］CHEN Jingchao， HUANG Hongjuan， WEI Shouhui， et al. Investigating the mechanisms of glyphosate resistance in goosegrass （Eleusine indica （L.） Gaertn.） by RNA sequencing technology ［J］. Plant Journal， 2017， 89（2）： 407415.

［17］CHEN Jingchao， HUANG Zhaofeng， HUANG Hongjuan， et al. Selection of relatively exact reference genes for gene expression studies in goosegrass （Eleusine indica） under herbicide stress ［J/OL］. Scientific Reports， 2017， 7（1）： 46494.DOI： 10.1038/srep46494.

［18］GAINES T， ZHANG W， WANG D， et al. Gene amplification confers glyphosate resistance in Amaranthus palmeri ［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2010， 107（3）： 10291034.

［19］ZHANG Chun， JOHNSON N A， HALL N， et al. Subtelomeric 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase copy number variation confers glyphosate resistance in Eleusine indica ［J/OL］. Nature Communications， 2023， 14（1）， 4865. DOI： 10.1038/s41467-023-40407-6.

（責(zé)任編輯：田喆）