土壤中氯嘧磺隆及其降解產(chǎn)物對(duì)后茬玉米生長及其ALS酶活性的影響

摘要試驗(yàn)采用超高效液相色譜高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用法檢測土壤中氯嘧磺隆的主要降解產(chǎn)物，推測出氯嘧磺隆在土壤中的降解途徑，同時(shí)分析了土壤中氯嘧磺隆及其降解產(chǎn)物對(duì)后茬作物玉米生長及ALS活性的影響。結(jié)果表明：土壤中氯嘧磺隆的降解產(chǎn)物對(duì)玉米的抑制作用明顯低于氯嘧磺隆本身;低濃度下，氯嘧磺隆及其降解產(chǎn)物對(duì)玉米作物的抑制作用均不明顯，甚至降解產(chǎn)物對(duì)玉米生長有促進(jìn)作用;高濃度下，氯嘧磺隆及其降解產(chǎn)物對(duì)玉米的抑制作用顯著。

關(guān)鍵詞氯嘧磺隆;除草劑;降解產(chǎn)物;超高效液相色譜高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用

中圖分類號(hào)：S 482.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023608The effects of chlorimuron-ethyl and its degradation products on the growth

and ALS enzyme activity in subsequent maizeCAO Jiaqi，F(xiàn)U Ying，ZOU Yueli*（College of Arts and Sciences， Northeast Agricultural University， Harbin150030， China）AbstractIn this study， the main degradation products of chlorimuron-ethyl in soil were detected using high-performance liquid chromatography-high resolution time-of-flight mass spectrometry. The effects of chlorimuron-methyl and its degradation products in soil on the growth and ALS activity of maize were also analyzed. The results showed that the inhibitory effect of chlorimuron-ethyl degradation products on maize in soil was significantly lower than that of chlorimuron-ethyl itself. At low concentrations， chlorimuron-ethyl and its degradation products had no obvious inhibitory effect on maize crops， and some degradation products even promoted maize growth. At high concentrations， the inhibitory effect of chlorimuron-ethyl and its degradation products on maize was significant.

Key wordschlorimuron-ethyl;herbicide;degradation products;high-performance liquid chromatography-high resolution time-of-flight mass spectrometry

大豆田除草劑氯嘧磺隆，英文通用名稱為chlorimuron-ethyl，化學(xué)名稱為2-（4-氯-6-甲氧基嘧啶-2-氨基甲酰氨基磺?；┍郊姿嵋阴ィ且环N超高效、廣譜的大豆田苗后除草劑，可通過抑制植物中的乙酰乳酸合酶（ALS）活性來殺死雜草。氯嘧磺隆在土壤中殘留時(shí)間長，在土壤中少量殘留即可對(duì)后茬敏感作物（如玉米、甜菜等）產(chǎn)生藥害［13］。國內(nèi)外研究表明，氯嘧磺隆可以發(fā)生水解、光解和微生物降解等多種代謝途徑［46］。然而還未見關(guān)于氯嘧磺隆在土壤中的降解途徑及其降解產(chǎn)物對(duì)后茬作物玉米生長和酶活性影響的報(bào)道。

目前超高效液相色譜法為除草劑殘留物檢測的主要方式［710］，試驗(yàn)采用超高效液相色譜高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLCI-Class-Q-TOF-MS145e72c14a401848e4f49607cfcabb8b）技術(shù)對(duì)土壤中氯嘧磺隆除草劑降解產(chǎn)物進(jìn)行測定，檢測到氯嘧磺隆4種主要降解產(chǎn)物，并對(duì)其降解機(jī)理進(jìn)行了推測。同時(shí)，試驗(yàn)測定了氯嘧磺隆及其4種降解產(chǎn)物對(duì)玉米生長的影響;分析了受氯嘧磺隆污染的大豆田土壤中殘留的氯嘧磺隆及其降解產(chǎn)物對(duì)后茬作物玉米可能產(chǎn)生的危害，對(duì)除草劑氯嘧磺隆的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了重要信息。

1材料與方法

1.1儀器

Waters uplc I-Class超高效液相色譜儀（美國沃特斯公司），Waters Xevo G2-XS QTOF質(zhì)譜儀（美國沃特斯公司），AL-4型電子分析天平（萬分之一，瑞士梅特勒公司），KQ-500DB 型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司），Allegra64型臺(tái)式高速離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.2樣品與試劑

乙腈、甲醇、甲酸（質(zhì)譜純，賽默飛世爾公司），亮氨酸腦酚酞、甲酸鈉（美國沃特斯公司），超純水（屈臣氏公司），多菌靈（CAS號(hào)： 10605-21-7）、2-（氨基磺?；┍郊姿嵋阴ィ–AS號(hào)：59777-72-9）、2-（氨基磺酰基）苯甲酸（CAS號(hào)： 632-24-6）（標(biāo)準(zhǔn)品，源葉公司），氯嘧磺隆（CAS號(hào)：90982-32-4）、2-氨基-4-氯-6-甲氧基嘧啶（CAS號(hào)：5734-64-5）、1，2-苯并異噻唑啉-3-酮（CAS號(hào)：81-07-2）（標(biāo)準(zhǔn)品，壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）。

1.3色譜－質(zhì)譜檢測

色譜條件：色譜柱為Acquity uplcbeh C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，ACQUITY UPLC BEH公司），流動(dòng)相A為甲酸水（0.1%甲酸），流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫（0.0～1.0 min，90%→70%;1.0～2.5 min，70%→55%;2.5～5.0 min，55%→30%;5.0～8.9 min，30%→10%;8.9～12.9 min，10%→10%;12.9～14.0 min，10%→90%;14.0～15.0 min，90%→90%），柱溫30℃，流速0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式，毛細(xì)管電壓2.5 kV，樣品錐孔電壓40 V，離子源缺省電壓80 V，離子源溫度120℃，脫溶劑溫度350℃，錐孔氣流速50 L/h，脫溶劑氣流速800 L/h，質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1 200。

1.4氯嘧磺隆及其降解產(chǎn)物的提取

取黑龍江省綏化市青岡縣受氯嘧磺隆除草劑污染的大豆田表層土壤，陰干，過100目篩。取10 g土壤樣品，用甲醇水溶液超聲提取，過濾后高速離心，合并提取液［911］。將Waters Oasis MCX固相萃取小柱以甲醇和水活化、潤濕，注入土壤提取液100～500 mL，用超純水和甲醇淋洗，將洗脫液濃縮到1.5 mL左右，超速離心后取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行高分辨質(zhì)譜分析。

1.5玉米生長指標(biāo)和ALS酶活性測定

1.5.1玉米幼苗的培育方法

選擇若干優(yōu)質(zhì)玉米種子，經(jīng)45℃溫水和0.6%多菌靈溶液各浸泡30 min后用蒸餾水洗滌并在蒸餾水中浸泡12 h，將種子取出后放置在培養(yǎng)皿中，置于溫度28℃、相對(duì)濕度75%的生長室中發(fā)芽24 h。然后，將發(fā)芽的種子播種在裝滿干燥土壤的紙杯中，每杯5粒，置于自然溫度、濕度和光照條件下的生長室中。

1.5.2氯嘧磺隆及降解產(chǎn)物對(duì)玉米的作用

播種后，在種有玉米的杯子中分別加入60 mL 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L濃度的氯嘧磺隆溶液［1214］及其4種降解產(chǎn)物［2-氨基-4-氯-6-甲氧基嘧啶、2-（氨基磺?；┍郊姿嵋阴?、2-（氨基磺?；┍郊姿帷?，2-苯并異噻唑啉-3-酮］樣品溶液，對(duì)照用蒸餾水處理，每個(gè)樣品重復(fù)3次（測定15株）。3 d后，分別在各杯中加入40 mL蒸餾水，進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5.3玉米的生長水平分析

處理7 d后將玉米幼苗從杯中取出，沖洗干凈，控水后用濾紙吸干。測定玉米幼苗的地上部和根部的長度、地上部和根的鮮重4個(gè)生長指標(biāo)。玉米的抑制率（IR，%）用以下公式計(jì)算：IR=（1-T/C）×100;其中T為處理玉米的凈重（或長度），C為對(duì)照的凈重（或長度）。

1.5.4玉米體內(nèi)ALS活性的測定

處理7 d后收集玉米苗，并用于測定玉米葉片中的ALS活性［1216］。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制作：配制500 nmol/L乙酰甲基甲醇溶液，并稀釋得到10、25、50、75、100、150、200 nmol/L系列溶液，取0.4 mL上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入硫酸0.1 mL，pH為7的磷酸緩沖液0.6 mL，5%甲萘酚溶液0.5 mL和0.5%肌酸0.5 mL，放置于60℃水浴中充分反應(yīng)15 min，測定該溶液在525 nm處的吸光度值，重復(fù)3次，制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

提取ALS：配制酶提取液、酶溶解液、酶反應(yīng)液［1617］。取1.0 g玉米葉片，加入配制好的酶提取液3.0 mL，加入液氮并研磨，轉(zhuǎn)入離心管以石英砂調(diào)平衡后25 000 g離心20 min，取上清液2.0 mL，加入提取液3.0 mL。加入1.5 g （NH4）2SO4，并小心振蕩使其混合均勻。放置于冰箱中2 h使其沉降， 離心20 min（25 000 g，4℃），去上清后加入酶溶解液3.0 mL溶解沉淀，即得到玉米葉片ALS提取液。

ALS活性測定：取上述ALS提取液0.4 mL，加入0.05 mol/L pH為7的磷酸緩沖液0.1 mL，加入酶反應(yīng)液0.5 mL，混合均勻后置于35℃水浴中并遮擋使其在暗處反應(yīng)，1 h后加入 3 mol/L的H2SO4 0.1 mL 終止反應(yīng)，再放入60℃水浴中進(jìn)行脫羧反應(yīng)，15 min后加入0.5% 肌酸0.5 mL 和用2.5 mol/L NaOH配制的5%甲萘酚溶液0.5 mL，繼續(xù)在60℃水浴中進(jìn)行顯色反應(yīng)，15 min后取出放至冷卻，測定其在525 nm處的吸光度值并與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)比，計(jì)算得到乙酰甲基甲醇含量，ALS的活力單位表示為nmol/（h·mg）。體內(nèi)ALS活性以對(duì)照的百分比表示，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)照組和處理組之間的比較通過多重比較的 Tukey法進(jìn)行方差分析。

ALS相對(duì)活性=化合物處理值/對(duì)照處理值×100%。

2結(jié)果與分析

2.1高分辨質(zhì)譜解析

根據(jù)氯嘧磺隆及其降解產(chǎn)物的質(zhì)荷比（m/z），再結(jié)合MS圖的帶電離子相對(duì)峰度以及氯嘧磺隆母體化合物的結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)和質(zhì)譜圖解析方法，進(jìn)一步確定土壤中氯嘧磺隆降解產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)（表1）。

2.2氯嘧磺隆及其降解產(chǎn)物對(duì)玉米的影響

2.2.1氯嘧磺隆對(duì)玉米生長指標(biāo)的影響

如表2所示，氯嘧磺隆導(dǎo)致玉米生長水平顯著降低，對(duì)玉米4個(gè)生長指標(biāo)的抑制率均隨著氯嘧磺隆濃度的增加而升高，對(duì)地下部分根長和根鮮重的抑制率均高于地上部長度和地上部鮮重。

2.2.2降解產(chǎn)物A對(duì)玉米生長指標(biāo)的影響

如表3所示，降解產(chǎn)物A（2-氨基-4-氯-6-甲氧基嘧啶）導(dǎo)致玉米生長水平顯著降低，對(duì)玉米4個(gè)生長指標(biāo)的抑制率均隨著其濃度的增加而升高，對(duì)地下部分的根長和根鮮重的抑制率均高于地上部長度和地上部鮮重。

2.2.3降解產(chǎn)物B對(duì)玉米生長指標(biāo)的影響

如表4所示，降解產(chǎn)物B［2-（氨基磺?；┍郊姿嵋阴ィ輰?duì)玉米生長水平的影響對(duì)于玉米各個(gè)部分有明顯差別，其對(duì)玉米地上部分（包括地上部長度和地上部鮮重）有促進(jìn)作用，且隨著濃度的增加促進(jìn)作用先增強(qiáng)后減弱;對(duì)玉米地下部的生長有著較強(qiáng)的抑制作用，抑制率隨著濃度增加有升高的趨勢。

2.2.4降解產(chǎn)物C對(duì)玉米生長指標(biāo)的影響

如表5所示，降解產(chǎn)物C［2-（氨基磺酰基）苯甲酸］對(duì)玉米生長水平的影響與降解產(chǎn)物B類似，可能是由于降解產(chǎn)物B和降解產(chǎn)物C結(jié)構(gòu)較為相似。對(duì)玉米根系的抑制率隨著降解產(chǎn)物C濃度的增加而升高。產(chǎn)物C對(duì)玉米地上部（包括地上部長度和地上部鮮重）沒有抑制作用，而是促進(jìn)了玉米地上部的生長，在0.3 mg/L時(shí)促進(jìn)作用最為顯著。

2.2.5降解產(chǎn)物D對(duì)玉米生長指標(biāo)的影響

如表6所示，在所有降解產(chǎn)物中，降解產(chǎn)物D（1，2-苯并異噻唑啉-3-酮）是唯一一種不抑制玉米生長，反而具有促進(jìn)生長作用的降解產(chǎn)物，促進(jìn)作用隨著降解產(chǎn)物D濃度的增加而增加。

2.2.6氯嘧磺隆及其降解產(chǎn)物對(duì)ALS活性的影響

ALS是磺酰脲類除草劑在植物體內(nèi)的靶標(biāo)酶，在某些情況下，ALS活性的降低表達(dá)了除草劑對(duì)植物的抑制作用。在本研究中，基于對(duì)玉米生長水平的影響結(jié)果，研究并比較了0.5 mg/L氯嘧磺隆和4種降解產(chǎn)物對(duì)玉米ALS的影響（表7）。結(jié)果表明，氯嘧磺隆導(dǎo)致ALS活性顯著降低，降解產(chǎn)物A對(duì)ALS活性有明顯降低趨勢，而其他3種降解產(chǎn)物對(duì)玉米中ALS活性幾乎沒有影響。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)研究了土壤中氯嘧磺隆的降解產(chǎn)物，同時(shí)分析了氯嘧磺隆及其4種降解產(chǎn)物對(duì)玉米生長的影響。結(jié)果表明，土壤中氯嘧磺隆主要存在4種降解產(chǎn)物，產(chǎn)物A：2-氨基-4-氯-6-甲氧基嘧啶，產(chǎn)物B： 2-（氨基磺?；┍郊姿嵋阴ィa(chǎn)物C：2-（氨基磺?；┍郊姿?，產(chǎn)物D：1，2-苯并異噻唑啉-3-酮。生物活性測定結(jié)果表明，氯嘧磺隆及其降解產(chǎn)物對(duì)玉米根的作用比對(duì)地上部的作用更明顯。在相同濃度下，氯嘧磺隆對(duì)玉米生長的抑制率最高。對(duì)于測試的4種降解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)在相同濃度下，產(chǎn)物A對(duì)玉米的抑制率高于其他降解產(chǎn)物，而產(chǎn)物D對(duì)玉米的生長具有促進(jìn)作用。ALS活性測定的結(jié)果表明，氯嘧磺隆對(duì)玉米ALS活性的影響效果顯著，降解產(chǎn)物A影響次之，其余3種降解產(chǎn)物對(duì)玉米中的ALS活性幾乎沒有影響?；诖搜芯靠芍?，氯嘧磺隆在土壤中完全降解后可以顯著降低其環(huán)境危害風(fēng)險(xiǎn)。

國內(nèi)外研究表明，磺酰脲類除草劑在弱酸性條件下的主要降解途徑是脲橋鍵裂解，發(fā)生水解反應(yīng)，水分子攻擊羰基碳的中性橋，釋放出CO2，生成無任何除草活性的磺酰胺和雜環(huán)胺，而磺酰胺和雜環(huán)胺還可進(jìn)一步水解［1819］。在中性和弱堿性條件下，只有苯環(huán)上的酯水解及脲橋裂解，嘧啶環(huán)上甲氧基穩(wěn)定，沒有脫甲氧基反應(yīng)發(fā)生。從而推測出氯嘧磺隆在土壤中的降解途徑：氯嘧磺隆的磺酰脲橋發(fā)生斷裂，生成產(chǎn)物A和產(chǎn)物B;產(chǎn)物B發(fā)生水解反應(yīng)生成產(chǎn)物C;產(chǎn)物C發(fā)生環(huán)化反應(yīng)生成產(chǎn)物D（圖1）。

除草劑氯嘧磺隆在土壤中具有長期持久性，其殘留物對(duì)后茬敏感作物具有較大的侵害，嚴(yán)重影響種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整［2023］。試驗(yàn)研究了施用過氯嘧磺隆除草劑的大豆田中可能存在的氯嘧磺隆降解產(chǎn)物，以及可能在施用過程中過量的氯嘧磺隆除草劑本身對(duì)后茬作物玉米的危害，證明了氯嘧磺隆降解后的產(chǎn)物在低濃度下對(duì)后茬作物玉米的抑制作用并不明顯，部分降解產(chǎn)物對(duì)于玉米的生長甚至有促進(jìn)作用，但在實(shí)際施用過程中可能會(huì)施用過量氯嘧磺隆除草劑，導(dǎo)致其在自然條件下無法完全降解或使土壤中降解產(chǎn)物濃度過高，從而抑制后茬作物的生長。施用過氯嘧磺隆除草劑的大豆田在對(duì)于后茬作物的選擇上要更為謹(jǐn)慎，應(yīng)特別關(guān)注氯嘧磺隆除草劑在土壤中的殘留動(dòng)態(tài)及不同后茬作物的安全性問題。

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（責(zé)任編輯：田喆）