茶樹根腐病拮抗放線菌分離、鑒定及生防潛能研究

摘要為了開發(fā)對茶樹根腐病菌具有拮抗作用的放線菌資源，從茶樹根際土壤中篩選得到一株對根腐病具有良好防治效果的拮抗菌株JK-13，基于形態(tài)特征觀察、生理生化試驗及16S rRNA序列分析，確定菌株JK-13為膠樣鏈霉菌Streptomyces gelaticus。平板對峙試驗結(jié)果表明，菌株JK-13對茶樹根腐病菌Fusarium cugenangense抑菌率達(dá)67.06%，對多種作物的病原真菌表現(xiàn)出了良好的抑菌活性。此外，該菌通過產(chǎn)生具有抑菌活性的揮發(fā)性與非揮發(fā)性有機(jī)物、代謝產(chǎn)物與淀粉水解酶、纖維素水解酶和β-1，3-葡聚糖酶等胞外酶抑制病原菌生長，對峙培養(yǎng)5 d后病原菌菌絲出現(xiàn)分枝、縊縮、扭曲、畸形、相互纏繞等現(xiàn)象。通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件來提升活性代謝產(chǎn)物的含量與病原菌抑制率，結(jié)果表明，最適生長碳源、氮源、無機(jī)鹽分別為麥芽糖、（NH4）2SO4、KCl，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為小米10 g/L、麥芽糖10 g/L、（NH4）2SO4 5 g/L、KCl 2.5 g/L、CaCO3 3 g/L，無菌發(fā)酵濾液對病原菌抑制率為51.03%，較初始培養(yǎng)條件提高了12.26%。因此，膠樣鏈霉菌JK-13在防控茶樹根腐病方面具有較好的開發(fā)價值及應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞茶樹根腐病;Fusarium cugenangense;膠樣鏈霉菌;生物防治

中圖分類號：S 435.711; S 476文獻(xiàn)標(biāo)識碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023603Isolation， identification， and biocontrol potential of antagonistic

actinomycetes against tea root rot caused by Fusarium cugenangenseLI Guihua TAN Lin SHEN Chengwen DENG Yulian HUANG Hong SHI Zihan JI Jinjun4，HU Qiulong （1. The Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education， Hunan Agricultural University， Changsha

410128， China; 2. College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha410128， China;

3. College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Changsha410128， China;

4. Hunan Tea Group Company Limited， Changsha410126， China）AbstractTo discover actinomycete resources with an antagonistic effect on the root rot of Camellia sinensis， a strain JK-13 with strong antagonistic activity against the tea root rot pathogen Fusarium cugenangense was screened from rhizosphere soil of C.sinensis. Strain JK-13 was identified as Streptomyces gelaticus based on morphological， physiological， and biochemical characteristics， and 16S rRNA sequence analysis. The results of the plate confrontation test showed that JK-13 had a high inhibition rate of 67.06% against F.cugenangense， demonstrating good broad-spectrum antagonistic ability toward various pathogenic fungi. In addition， strain JK-13 inhibited the growth of pathogenic fungi by producing volatile and non-volatile organic compounds， metabolites， and extracellular enzymes such as starch hydrolase， cellulose hydrolase， and β-1，3-glucanase. Light microscopy observation revealed that the pathogenic mycelium appeared branched， constricted， distorted， deformed， and intertwined after confrontation culture for five days. Fermentation conditions were optimized to increase the content of active metabolites and the inhibition rate of strain JK-13 against pathogen F.cugenangense. The results of fermentation condition optimization showed that the most suitable carbon source， nitrogen source， and inorganic salt for growth were maltose， （NH4）2SO4， and KCl， respectively. The optimal fermentation medium formula was millet 10 g/L， maltose 10 g/L， （NH₄）₂SO₄ 5 g/L， KCl 2.5 g/L， and CaCO₃ 3 g/L. The inhibition rate of the sterile fermentation filtrate of strain JK-13 against F.cugenangense was 51.03%， an increase of 12.26% compared to the initial culture condition. Therefore， S.gelaticus JK-13 has good development value and application potential in the disease management of tea root rot.

Key wordstea root rot;Fusarium cugenangense;Streptomyces gelaticus;biological control茶樹是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，茶葉含有茶多酚、咖啡堿、茶氨酸、茶多糖等多種特有活性物質(zhì)，具有抗氧化、降血糖、防癌抗癌、增強(qiáng)免疫力等功效［1］。茶樹病害種類較多，例如刺盤孢Colletotrichum camelliae、膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides等引起的茶炭疽病，茶擬盤多毛孢Pseudopestalotiopsis theae引起的茶輪斑病，腐皮鐮刀菌Fusarium solani引起的茶樹莖腐和枯萎相關(guān)病害，對茶樹的健康生長發(fā)育造成巨大危害，從而影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)［25］。

茶樹根腐病是茶樹根部主要病害之一，病菌侵染茶株后導(dǎo)致茶樹生長衰弱，或全株死亡，并逐株蔓延，造成成片茶樹死亡，對茶葉生產(chǎn)危害很大。前期研究中，我們團(tuán)隊報道了一種引起茶樹根腐病的病原菌Fusarium cugenangense，歸屬于尖孢鐮刀菌物種復(fù)合物（Fusarium oxysporum species complex， FOSC）中的一個特異性菌株［6］。目前，針對尖孢鐮刀菌引起的根腐病已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不少生防菌，如芽胞桿菌屬Bacillus spp.、短桿菌屬Brevibacterium spp.、農(nóng)桿菌屬Agrobacterium spp.和假單胞菌屬Pseudomonas spp.，對尖孢鐮刀菌抑菌率為10.68%～59.02%［7］;滕崢等［8］采用平板對峙法篩選對尖孢鐮刀菌具有拮抗作用的菌株，結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens的抑菌圈直徑為40.17 mm;王前程等［9］研究發(fā)現(xiàn)擬康寧木霉Trichoderma koningiopsis菌株T-51對尖孢鐮刀菌相對防效為87.5%;姚晨虓等［10］研究發(fā)現(xiàn)棘孢木霉T.asperellum、哈茨木霉T.harzianum和毛簇木霉T.velutinum對尖孢鐮刀菌的相對盆栽防效分別為78.95%、69.73%和69.73%，均高于70%甲基硫菌靈可濕性粉劑1 000倍液處理的防效;但目前沒有針對茶樹根腐病病原菌F.cugenangense拮抗微生物資源挖掘和開發(fā)的報道。

目前，因為化學(xué)藥劑防治對植物、周圍環(huán)境都有一定的傷害，所以拮抗微生物在茶樹、油茶、蔬菜、果樹等病害防治中的作用越來越突出［5， 1113］。拮抗微生物及其代謝產(chǎn)物對茶樹根部病害有良好的防治效果，如Elango 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在13個試驗處理中，將灰色鏈霉菌Streptomyces griseus與哈茨木霉聯(lián)合施用于茶樹根際，能顯著降低茶紅根腐病的發(fā)病率;Morang等［15］研究結(jié)果表明，3株根瘤菌Rhizobium sp.菌株P(guān)M 105、PM 112和PM 43除抑制褐腐病外，還具有促進(jìn)植株生長的作用。Purkayastha等［16］研究發(fā)現(xiàn)，黏質(zhì)沙_{k2uOgnL6LzJZ/BpwaO8uVA==}雷氏菌Serratia marcescens能產(chǎn)生多種細(xì)胞壁水解酶，從而通過降解病原菌的細(xì)胞壁來達(dá)到抑制作用。但沒有有關(guān)放線菌拮抗茶樹根腐病的研究報道，本研究通過從茶樹根際土壤中篩選拮抗放線菌，通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)方法對生防菌進(jìn)行鑒定，對生防菌JK-13的抑菌活性和對茶樹根腐病生防潛能進(jìn)行研究，并探究生防菌最佳培養(yǎng)條件，以期為茶樹根腐病生物防治提供理論及技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試土壤

供試土壤采自于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)長安教學(xué)基地的根腐病菌侵染的茶樹根際土壤。

1.1.2供試培養(yǎng)基［1720］

所用固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基分別見表1和表2。

1.1.3供試植物病原菌

茶樹根腐病病原菌Fusarium cugenangense、草莓疫病菌Phytophthora fragariae、黃精炭疽病菌Colletotrichum circinans、馬鈴薯早疫病菌Alternaria solani、辣椒枯萎病菌Fusarium oxysporum、茭白鐮刀病菌Fusarium graminearum、茄子褐紋病菌Phomopsis vexans、柑橘沙皮病菌Diaporthe citri、玉米大斑病菌Exserohilum turcicum，均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室保存。

1.2試驗方法

1.2.1拮抗菌株的分離與篩選

采用稀釋涂布法分離放線菌株。稱取10 g根腐病菌侵染的茶樹根際土壤與90 mL無菌水混合，獲得濃度為10-1的土壤液，用無菌水稀釋至10-4、10-5、10-6，每個稀釋梯度3次重復(fù)。分別吸取土壤稀釋液200 μL，涂布于PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7～14 d，待平板上長出菌落后，挑取單菌落進(jìn)行純化并保存。采用平板對峙法篩選拮抗菌，用直徑5 mm的打孔器打取病原菌菌餅并接種到PDA培養(yǎng)基的中央，在距平板中央2 cm等距離接種土壤分離菌，以不接種分離菌為對照，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，每處理3次重復(fù)，待對照菌落長至接近皿邊緣時，根據(jù)以下公式計算其抑菌率。

抑菌率＝（對照組菌落直徑－處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100%。

1.2.2拮抗菌的鑒定

將菌株JK-13分別劃線接種到PDA、高氏1號、ISP-2、察氏、葡萄糖酵母膏瓊脂、營養(yǎng)瓊脂和燕麥瓊脂培養(yǎng)基上，28℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)7～14 d，觀察菌株的生長情況、基內(nèi)菌絲、氣生菌絲、菌落特征以及有無可溶性色素產(chǎn)生。

將菌株JK-13劃線接種于高氏1號培養(yǎng)基上并插上滅菌蓋玻片，培養(yǎng)14 d后，在顯微鏡下觀察菌株基內(nèi)菌絲、氣生菌絲以及孢子絲等的特征。

參照《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》［21］以及《鏈霉菌鑒定手冊》［22］中的方法對菌株JK-13進(jìn)行碳源利用、明膠液化、甲基紅試驗、V-P試驗、牛奶凝固與胨化、H2S產(chǎn)生、硝酸鹽還原、黑色素產(chǎn)生等試驗。GY液體培養(yǎng)基用于拮抗放線菌的NaCl耐受性和pH試驗，拮抗菌株耐鹽性試驗的NaCl濃度調(diào)節(jié)范圍為0～13%，pH試驗的pH調(diào)節(jié)范圍為1～14，測定方法是將粘有菌株孢子的無菌槍頭打入到裝有5 mL或10 mL GY液體培養(yǎng)基的試管中，28℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)7 d，觀察不同NaCl濃度和不同pH環(huán)境下菌株是否生長及生長情況。

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取拮抗菌株的基因組DNA，使用16S rRNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴(kuò)增目的片段并進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行相似性比對，選取相似性較高的典型菌株利用MEGA11軟件通過neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3拮抗菌對茶樹根腐菌的菌絲生長抑制作用

為探究拮抗菌株JK-13對茶樹根腐病菌菌絲生長的抑制作用，將JK-13與茶樹根腐病菌進(jìn)行對峙培養(yǎng)5 d后，挑取抑菌圈邊緣處的茶樹根腐病菌菌絲，通過顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察，以不接拮抗放線菌自然生長5 d的茶樹根腐病菌為對照。

1.2.4拮抗菌的抗菌譜測定

選用辣椒枯萎病菌、茭白鐮刀病菌、柑橘沙皮病菌、黃精炭疽病菌、馬鈴薯早疫病菌、草莓疫病菌、玉米大斑病菌、茄子褐紋病菌8種病原菌，采用平板對峙法，檢測JK-13的抗菌譜。將直徑0.5 cm的各供試病原菌菌餅置于培養(yǎng)皿中央，用無菌接種環(huán)挑取拮抗菌在距病原菌2 cm兩側(cè)劃線，以只接種各病原菌為對照，每處理3次重復(fù)，于28℃恒溫箱培養(yǎng)7 d后，測量病原菌菌落直徑，計算抑菌率。

1.2.5拮抗菌的胞外酶檢測

打取直徑5 mm的拮抗菌株菌餅分別置于淀粉水解酶、纖維素水解酶、蛋白酶、β-1，3-葡聚糖酶的檢測培養(yǎng)基中央，每種類型胞外酶檢測培養(yǎng)基均設(shè)3次重復(fù)，所有平板在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d，若有透明水解圈出現(xiàn)，則確定菌株分泌該胞外酶，淀粉酶觀察時需要加盧哥氏碘液［2324］。

1.2.6揮發(fā)性與非揮發(fā)性有機(jī)物對病原菌的抑制作用使用雙平板對扣法探究拮抗菌株揮發(fā)性有機(jī)物對茶樹根腐病病原菌的抑菌效果［23］。將拮抗菌株采用劃線法于高氏1號固體平板上作為下層平板，先培養(yǎng)48 h，再將直徑為5 mm的病原菌菌塊置于PDA平板中央，作為上層平板，將2個平板密封后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。對照組為無拮抗菌株的雙層平板，各設(shè)置3個重復(fù)。在對照組病原菌長滿平板時十字交叉法測量PDA平板上各個處理下病原菌菌落直徑（mm），計算其抑菌率。

采用玻璃紙培養(yǎng)法探究拮抗菌株非揮發(fā)性有機(jī)物對茶樹根腐病菌的抑菌效果。參照王子晴等［25］和李葉彤等［26］的方法并加以改進(jìn)，在PDA培養(yǎng)基上平鋪無菌雙層玻璃紙，于玻璃紙中央接種JK-13菌餅，培養(yǎng)5 d，然后用無菌鑷子移去雙層玻璃紙及附著的菌餅，在平板中央接種直徑5 mm病原菌菌餅，以不含菌株JK-13非揮發(fā)性代謝物的平板接種病原菌菌餅作為對照，每處理設(shè)3次重復(fù)，28℃培養(yǎng)5 d后測量病原菌的生長直徑。

1.2.7菌株JK-13無菌發(fā)酵液營養(yǎng)條件優(yōu)化

種子液的制備：取20個直徑為5 mm的菌餅置于200 mL的高氏1號培養(yǎng)液中，28℃、180 r/min培養(yǎng)7 d，即為種子液。

無菌發(fā)酵液的制備：將種子液以2%接種量接入6種常用的放線菌培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)7 d，獲得發(fā)酵液。發(fā)酵液于12 000 r/min離心15 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，獲得無菌發(fā)酵液。

采用菌絲生長速率法［27］測定菌落生長情況：將PDA培養(yǎng)基融化并冷卻至55℃左右，再按體積比1∶9的比例將無菌發(fā)酵濾液與PDA培養(yǎng)基混合，搖勻后制成含有放線菌活性成分的平板。待其冷卻后在平板中央放置1個供試病原菌菌餅（直徑為5 mm），置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以加無菌水的處理為對照，每處理重復(fù)3次。采用十字交叉法測量各真菌菌落生長直徑，計算菌絲生長抑制率，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。

以篩選出的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過單因素試驗選擇最佳碳、氮源以及無機(jī)鹽的種類。為精確分析培養(yǎng)基中碳、氮源、無機(jī)鹽和碳酸鈣（在培養(yǎng)基中起調(diào)節(jié)pH的作用）之間的相關(guān)性，利用正交設(shè)計助手［28］設(shè)計4因素3水平的正交試驗（表3），確定其最佳用量，每處理重復(fù)3次。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS27中Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析（α=0.05），使用Origin2021制圖。

2結(jié)果與分析

2.1拮抗菌株的分離與篩選

通過從感染根腐病的茶樹根際土壤中分離出放線菌，采用平板對峙法獲得幾株對茶樹根腐病菌有拮抗作用的菌株，其中菌株JK-13效果最好（圖1），抑菌率為67.06%，用于后續(xù)試驗。

2.2菌株JK-13的鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué)特征

菌株JK-13在高氏1號培養(yǎng)基上生長良好，菌落較密，氣生菌絲發(fā)達(dá)，灰黑色，基內(nèi)菌絲黑色，前期不產(chǎn)生可溶性色素，后期產(chǎn)可溶性色素，顏色為紅褐色（圖2）。在不同培養(yǎng)基上生長時，除在PDA和燕麥瓊脂培養(yǎng)基上生長較弱外，在其他培養(yǎng)基上均生長良好，拮抗菌株JK-13在不同培養(yǎng)基上的特征不同（表4）。

2.2.2生理生化特性

生理生化試驗結(jié)果表明，菌株JK-13的明膠液化和硝酸鹽還原試驗均為陽性，牛奶的凝固與胨化、H2S產(chǎn)生、甲基紅試驗、V-P試驗、黑色素產(chǎn)生試驗均為陰性（表5），均能以L-半乳糖、蔗糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、麥芽糖等為碳源，但不能利用L-阿拉伯糖、D-甘露醇、L-肌醇、D-山梨醇等碳源。NaCl耐受性和pH耐受性試驗結(jié)果表明，菌株JK-13能在8% NaCl濃度下生長，pH的耐受范圍為5～13，pH為13時能生長，但生長較弱。

2.2.3分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

通過PCR擴(kuò)增獲得菌株JK-13的16S rRNA基因序列，將獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性比對，發(fā)現(xiàn)菌株與鏈霉菌屬的相似性較高。選擇相似性較高的菌株的16S rRNA序列，使用MEGA11.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，菌株JK-13與膠樣鏈霉菌Streptomyces gelaticus （登錄號為PP188476）處于同一分支（圖3）。結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性，16S rRNA基因分子鑒定，將菌株初步鑒定為膠樣鏈霉菌。

2.3菌株 JK-13 對茶樹根腐菌的菌絲生長抑制作用在菌株JK-13的拮抗下，茶樹根腐病菌菌絲生長會受到一定的抑制作用，與對照組相比，處理組的茶樹根腐病菌菌絲出現(xiàn)分枝、縊縮、扭曲、畸形、相互纏繞等現(xiàn)象，這說明菌株JK-13對茶樹根腐病菌菌絲生長具有抑制作用（圖4）。

2.4拮抗菌株 JK-13抗菌能力

通過拮抗菌株JK-13與供試的8株不同植物病原菌的平板對峙試驗發(fā)現(xiàn)，菌株JK-13對8株病原菌的抑菌效果均在50%以上，其中菌株JK-13對黃精炭疽病菌、茄子褐紋病菌、玉米大斑病菌的抑菌效果在80%以上（表6）。菌株JK-13可以在平板上有效抑制多種病原菌，抑菌作用較為廣泛。

2.5拮抗菌的胞外酶

通過對菌株產(chǎn)胞外酶性能進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，菌株JK-13在淀粉水解酶培養(yǎng)基、羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基、β-1，3-葡聚糖酶培養(yǎng)基均產(chǎn)生透明圈，說明JK-13菌株具有分泌淀粉水解酶、纖維素水解酶、β-1，3-葡聚糖酶的活性;但其不分泌蛋白酶（圖5）。

2.6菌株JK-13揮發(fā)性與非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對茶樹根腐病菌的抑制作用雙平板對扣試驗和玻璃紙培養(yǎng)試驗結(jié)果表明，菌株JK-13產(chǎn)生的揮發(fā)性與非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物均能抑制病原菌F.cugenangense的生長（圖6）。與對照相比，菌株JK-13產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌抑菌率為33.36%，非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌率為51.41%，說明該菌株的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌F.cugenangense的菌絲生長有顯著的抑制效果。

2.7菌株 JK-13無菌發(fā)酵液培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.7.1不同培養(yǎng)液對菌株JK-13無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響6種不同成分的培養(yǎng)液培養(yǎng)的菌株JK-13無菌發(fā)酵液對病原菌F.cugenangense的抑制作用存在一定差異，其中小米浸汁培養(yǎng)液的抑菌率最高，為38.77%（P＜0.05，圖 7a）。故選小米浸汁培養(yǎng)液作為JK-13的最佳發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.7.2不同碳源、氮源和無機(jī)鹽對菌株JK-13無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響6種碳源、氮源、無機(jī)鹽獲得的菌株JK-13發(fā)酵液均對病原菌F.cugenangense有一定的抑制作用，其中麥芽糖作為碳源、硫酸銨作為氮源、氯化鉀作為無機(jī)鹽的菌株無菌發(fā)酵液抑菌率最高，分別為42.59%、47.11%、31.89%，顯著高于其他碳源（圖7b）、氮源（圖7c）、無機(jī)鹽（圖7d）;因此，分別選用麥芽糖、硫酸銨、氯化鉀作為培養(yǎng)基的最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽做后續(xù)正交試驗。

2.7.3營養(yǎng)條件的正交試驗

以小米浸汁培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，根據(jù)2.7.2碳源、氮源和無機(jī)鹽的篩選結(jié)果，選擇麥芽糖、硫酸銨、氯化鉀、碳酸鈣 4個因素，設(shè)計4因素3水平正交試驗（表3），根據(jù)抑菌活性確定最終發(fā)酵營養(yǎng)配方。

R代表極差，極差越大，影響程度越大;反之，極差越小，影響程度越小。K代表均值，K1、K2和K3分別代表水平1、水平2、水平3下抑菌率的均值。正交試驗結(jié)果表明（表7），4個因素影響菌株JK-13無菌發(fā)酵液對F.cugenangense的抑菌效果順序為：硫酸銨（B）＞氯化鉀（C）＞碳酸鈣（D）＞麥芽糖（A），根據(jù)同一因素y/R05xHALfdyWSU/F+0b5w==不同水平的均值大小，可以判斷出該因素的最優(yōu)值，從而得出所有因素的最優(yōu)組合為A2B3C2D3，但此配方并未在正交試驗中出現(xiàn)，因此做了驗證試驗，JK-13按A2B3C2D3配方再次搖菌發(fā)酵，其他條件不變，測得無菌發(fā)酵濾液抑菌率為51.03%，較初始小米浸汁培養(yǎng)基提高了12.26%。結(jié)果證明該配方確實是最佳配方，即最佳培養(yǎng)基配方為小米10 g/L，麥芽糖10 g/L，硫酸銨5 g/L，氯化鉀2.5 g/L，碳酸鈣3 g/L。

3結(jié)論與討論

放線菌是一類具有發(fā)展前景的微生物資源，能夠產(chǎn)生具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，其中尤以鏈霉菌屬最為顯著［29］。本研究從茶樹根際土壤中分離篩選到一株對茶樹根腐病菌有顯著拮抗作用的放線菌菌株JK-13，經(jīng)培養(yǎng)、形態(tài)特征觀察以及16S rRNA基因序列比對分析，鑒定該菌株為膠樣鏈霉菌。對菌株JK-13進(jìn)行生物學(xué)特性檢測，發(fā)現(xiàn)該菌株具有良好的耐酸和鹽的性能，而茶樹具有喜酸耐堿的特性，這有利于保障菌株在田間應(yīng)用時的生防穩(wěn)定性。此外，菌株JK-13對多種作物的病原菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，具有極大的開發(fā)潛力。

一般而言，拮抗菌對病原菌的抑制作用機(jī)制包括營養(yǎng)和空間競爭、產(chǎn)生抗真菌物質(zhì)和產(chǎn)生胞外酶等。其中，抗生作用主要是指生防菌分泌某些次生代謝產(chǎn)物（如木霉素、抗菌肽、抗生素等）抑制病原菌生長，被認(rèn)為是對抗病原菌的主要方式。鏈霉菌產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物主要通過抑制病原菌菌絲的生長以及孢子的萌發(fā)。目前已報道了多種鏈霉菌產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物能顯著抑制病原菌的生長從而有效地防治植物病害，而關(guān)于非揮發(fā)性有機(jī)化合物抑制病原菌生長的報道以木霉研究較多。魯妍璇等［30］的研究證實了利迪鏈霉菌Streptomyces lydicus K2在麥粒培養(yǎng)基上產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)對灰霉病菌Botrytis cinerea有較好的抑制效果;王寧等［31］發(fā)現(xiàn)菌株A144產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對蘋果樹腐爛病菌Valsa mali具有一定的抑菌活性;李小杰等［32］研究發(fā)現(xiàn)綠木霉Trichoderma virens、擬康寧木霉T.koningiopsis和近漸綠木霉 T.paraviridescens產(chǎn)生的揮發(fā)性和非揮發(fā)性代謝物均對疫霉具有明顯的抑制作用。本研究通過雙平板對扣法和玻璃紙培養(yǎng)法檢測，初步證明了膠樣鏈霉菌揮發(fā)性和非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物均具有抑菌活性。

病原真菌的細(xì)胞壁以幾丁質(zhì)、纖維素為骨架，以β-1，3-葡聚糖為主要填充物所組成，容易被胞外水解酶分解，導(dǎo)致病原真菌死亡。郝金輝等［33］研究發(fā)現(xiàn)，多黏類芽胞桿菌JE53和JE56可產(chǎn)生纖維素酶、蛋白酶、β-1，3-葡聚糖酶及幾丁質(zhì)酶，李錚等［34］ 研究發(fā)現(xiàn)，貝菜斯芽胞桿菌NZ-4能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、果膠酶、纖維素酶、蛋白酶、酪蛋白酶，推測菌株可能以分泌多種水解酶作用于真菌細(xì)胞壁，改變或降解其細(xì)胞壁，破壞菌體的完整性從而達(dá)到抑制效果。本研究中，菌株JK-13能夠產(chǎn)生淀粉水解酶、纖維素水解酶和β-1，3-葡聚糖酶，由此推測該菌株通過產(chǎn)生相關(guān)酶類水解病原菌F.cugenangense細(xì)胞壁，從而實現(xiàn)抑菌效果。

鏈霉菌不僅能夠產(chǎn)生高活性水解酶，還可以產(chǎn)生多種天然活性產(chǎn)物，如大環(huán)內(nèi)酯類、哌嗪和尾環(huán)化肽等多種次級代謝產(chǎn)物，從而抑制病原菌的生長［3536］，通過發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化可提高其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。本研究以菌株JK-13的無菌發(fā)酵濾液對病原菌F.cugenangense的抑菌效果作為指標(biāo)，利用培養(yǎng)基組分的單因素試驗和正交試驗明確了膠樣鏈霉菌JK-13的最適碳源為麥芽糖（10 g/L），氮源為硫酸銨（5 g/L），無機(jī)鹽為氯化鉀（2.5 g/L）。通過對培養(yǎng)基成分優(yōu)化，提高了菌株JK-13的抑菌效果，可能是因為適宜的營養(yǎng)成分可以促進(jìn)拮抗菌株抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生。

通過顯微觀察進(jìn)一步確定在菌株JK-13拮抗作用下病原菌F.cugenangense菌絲出現(xiàn)彎曲纏繞、分枝增多等現(xiàn)象，菌株生長受到顯著影響。綜上，菌株JK-13通過產(chǎn)胞外酶、揮發(fā)性物質(zhì)、具有抑菌活性的次級代謝產(chǎn)物來抑制病原菌的生長，從而實現(xiàn)拮抗作用。但是，菌株對病原菌的田間防效、發(fā)酵條件的優(yōu)化、發(fā)酵濾液的穩(wěn)定性以及次生代謝產(chǎn)物的抑菌活性物質(zhì)等問題還待進(jìn)一步研究。

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