葡萄孢屬菌株 HY-021可濕性粉劑的制備及除草作用

摘要為了進一步明確葡萄孢屬Botrytis菌株HY-021除草活性，采用單因素法篩選該菌株的最適固體發(fā)酵基質(zhì)、適宜載體和助劑，制備可濕性粉劑，并進行盆栽接種評價其除草活性。結(jié)果表明：HY-021菌株最適生長的固態(tài)基質(zhì)為玉米粉，最優(yōu)配方組合為：麥稈糠14.5 g+麥麩19.4 g+菜籽餅1.5 g+玉米粉14.6 g。適宜的載體、穩(wěn)定劑、分散劑、保護劑和潤濕劑分別為高嶺土、輕質(zhì)碳酸鈣、羧甲基纖維素鈉、可溶性淀粉和十二烷基硫酸鈉。菌株HY-021可濕性粉劑對苗期盆栽的藜、密花香薷、豬殃殃3種雜草有較好除草活性，其中對藜和豬殃殃表現(xiàn)出較強的致病性，致病率分別為85.83%、89.45%，鮮重防效分別為81.82%、87.16%。本試驗制備的HY-021生防菌株可濕性粉劑，可作為生防菌劑有效控制藜和豬殃殃等雜草。

關鍵詞葡萄孢屬菌株HY-021;可濕性粉劑;除草作用

中圖分類號：S 451.1文獻標識碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023596Wettable powder preparation of Botrytis strain HY-021

and its herbicidal effectZHU Haixia，WANG Tianqi，CHENG Liang，CHENG Haiyang（Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Xining， Ministry of Agriculture and Rural Affairs，

Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management in Qinghai Province， Academy of Agriculture and

Forestry Sciences of Qinghai University， Xining810016， China）AbstractIn order to clarify the herbicidal activity of the Botrytis strain HY-021， a wettable powder was prepared， and its herbicidal activity was measured. The single-factor method was used to screen the optimal solid fermentation substrate， suitable carrier， and auxiliary agent for the strain HY-021. A wettable powder was prepared and its herbicidal activity was evaluated by pot inoculation. The results showed that the most suitable solid substrate for the strain HY-021 to grow was corn flour， and the optimal formula combination was wheat straw bran 14.5 g， wheat bran 19.4 g， rapeseed cake 1.5 g， and maize flour 14.6 g. Kaolin， light calcium carbonate， carboxymethylcellulose sodium， soluble starch and sodium dodecyl sulfate were comprehensively selected as the carrier， stabilizer， dispersant， protector， and wetting agent of the strain HY-021. The wettable powder of the strain HY-021 exhibited good herbicidal activity against three kinds of weeds， namely Chenopodium album， Elsholtzia densa， and Galium spurium， at the seedling stage in pot tests. Among them， the HY-021 showed strong pathogenicity to C.album and G.spurium， with incidence rate of 85.83% and 89.45%， and fresh weight control effect of 81.82% and 87.16%， respectively. HY-021 wettable powder can be used as a biocontrol agent to effectively control weeds such as C.album and G.spurium.

Key wordsBotrytis strain HY-021;wettable powder;herbicidal effect雜草侵擾是降低作物產(chǎn)量的主要因素［1］，據(jù)估計，每年約有1 800種雜草對主要農(nóng)作物產(chǎn)量帶來不同程度的損害，難治的惡性雜草多達130余種，雜草侵害一般會導致主要糧食作物減產(chǎn)20%，嚴重時減產(chǎn)45%甚至顆粒無收［12］。我國雜草常年發(fā)生面積達0.933億hm2次以上，形成草害的面積為0.51億hm2次，平均減產(chǎn)9.7%，而實際生產(chǎn)中，因草害防控不利引起的作物減產(chǎn)遠高于上述數(shù)字［3］。隨著社會文明的發(fā)展和公眾健康意識的提高，開發(fā)廣譜、高效、低毒的新型生物除草技術(shù)和微生物除草劑已成為大勢所趨。

生物除草劑利用豐富的雜草病原微生物資源，不僅能夠無污染、無藥害、有效地控制難除雜草種群，而且對目標雜草以外的植物影響小，環(huán)境負效應小，安全性高［46］。當前全球公布的商業(yè)化生物除草劑已有20多個產(chǎn)品［78］。微生物除草劑有益于生態(tài)結(jié)構(gòu)的動態(tài)平衡而成為生態(tài)農(nóng)業(yè)中防治草害的首選，成為一些化學農(nóng)藥的替代品［910］。在未來除草劑發(fā)展領域中，開發(fā)具有特色的生物除草劑、研發(fā)其商業(yè)化應用體系，具有廣闊的應用前景［1112］。

葡萄孢屬 Botrytis菌株HY-021分離自巴天酸模 Rumex patientia葉片，前期研究發(fā)現(xiàn)該菌株具有良好的除草活性，經(jīng)鑒定確定為擬蠶豆葡萄孢Botrytis fabiopsis。為了安全、經(jīng)濟、有效地利用該菌株，充分發(fā)揮活體微生物的作用效果，擴大應用范圍，本研究對適宜該菌株發(fā)酵的碳氮源、固體發(fā)酵基質(zhì)及適宜載體和助劑進行篩選，研制該菌株的可濕性粉劑，并測定其除草活性。旨在為微生物劑型的研制提供理論依據(jù)，并為雜草生防菌的進一步田間應用奠定基礎。

1材料與方法

1.1供試材料

葡萄孢屬 Botrytis菌株HY-021分離自巴天酸模 Rumex patientia L葉片，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.40557。

1.2試驗方法

1.2.1固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的單因素篩選及正交組合設計將菌株HY-021活化后接種于PDB培養(yǎng)液中，180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，將獲得的發(fā)酵液稀釋為孢子濃度為1×108個/mL的種子液備用。選取廉價農(nóng)副產(chǎn)品玉米粉、麥稈糠、羊糞、菜籽餅、麥麩作為發(fā)酵培養(yǎng)的基本材料，每25 g固態(tài)基質(zhì)接種5 mL種子液，將其置于25℃生化培養(yǎng)箱中黑暗靜置培養(yǎng)10 d后取出，自然烘干并粉碎，對不同基質(zhì)下HY-021的產(chǎn)孢量進行測定［13］。同時用分光光度計測其OD600，篩選出最適合HY-021生長的固體基質(zhì)，每處理重復3次。

根據(jù)5種單一基質(zhì)發(fā)酵初步篩選結(jié)果，選取麥麩、麥稈糠、菜籽餅、玉米粉為4個基本組分因子，通過正交設計得到9個配方（表1），配制成9種固體基質(zhì)培養(yǎng)基，在配制好的9種固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中，按2%（質(zhì)量分數(shù)）的比例加入肌醇作為碳源，硫酸銨作為氮源，然后加入適量的無菌水，混合均勻后，分別裝入250 mL的錐形瓶中，密封后于121℃下高壓滅菌30 min，待自然冷卻后，每瓶接入10 mL孢子濃度為1×108 個/mL的種子液，攪拌均勻，再次密封;以單一基質(zhì)為對照，對其進行發(fā)酵培養(yǎng)、洗脫并收集分生孢子，并統(tǒng)計產(chǎn)孢量和OD600。

1.2.2載體和助劑的篩選

在所篩選出的HY-021菌株最適培養(yǎng)基上，分別以2%（質(zhì)量分數(shù)）的量加入載體（高嶺土、石灰石、硅藻土、拉開粉、黏土）、分散劑（吐溫、羧甲基纖維素、木質(zhì)素磺酸鈉、羧甲基纖維素鈉、十二烷基磺酸鈉、聚乙烯醇）、穩(wěn)定劑（輕質(zhì)碳酸鈣、重質(zhì)碳酸鈣、膨潤土、白炭黑）、保護劑（腐殖酸、海藻酸鈉、糊精、可溶性淀粉）和潤濕劑（十二烷基硫酸鈉、拉開粉）制成含不同載體和助劑的培養(yǎng)基，然后分別接入直徑為8 mm的菌餅，觀察HY-021在含有不同載體助劑的培養(yǎng)基上的生長狀況，篩選出適宜的載體、穩(wěn)定劑、潤濕劑、分散劑及其他助劑。

1.2.3HY-021可濕性粉劑的初步制備

按1.2.1的方法制備菌株HY-021種子液，以優(yōu)化后的最適基質(zhì)為發(fā)酵基質(zhì)，加入2%的最適碳、氮源，在25℃黑暗條件下培養(yǎng)10 d。獲得的固體發(fā)酵物干燥、粉碎，制得菌粉。將菌粉與篩選出的適宜載體、助劑，按照50%載體、6%分散劑、1%穩(wěn)定劑和3%潤濕劑的比例混合，粉碎，混合，再粉碎，室溫下自然干燥，制成可濕性粉劑［12，14］。

1.2.4HY-021可濕性粉劑對盆栽雜草致病性測定

將田間健康生長的藜Chenopodium album、豬殃殃Galium spurium、密花香薷Elsholtzia densa幼苗移栽至d=15 cm的花盆中，每盆8株，3次重復，于溫室內(nèi)培養(yǎng)。將制作好的可濕性粉劑溶解后，使用雙層無菌紗布過濾，將所得濾液使用噴霧法連續(xù)2 d接種至正常生長的4～6葉期的健康盆栽植株上，每盆接種量為25 mL。接種后的雜草植株套袋保濕24 h，置于25～30℃、光周期L∥D=12 h∥12 h條件下培養(yǎng)，每個處理設置3次重復，以接種清水作為空白對照。7 d后觀察接種植株發(fā)病情況并計算發(fā)病率、鮮重防效［14］。

發(fā)病率=（發(fā)病植株數(shù)/調(diào)查植株總數(shù)）×100%;

鮮重防效=（對照鮮重-處理鮮重）/對照鮮重×100%。

1.3數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2016、SPSS 26.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并使用單因素方差分析（ANOVA）和最小顯著差數(shù)法（LSD）對均值進行差異顯著性檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的單因素篩選及正交組合優(yōu)化結(jié)果由朗伯比爾定律可知［15］，孢子懸液中的孢子量與OD600之間存在著正比關系，孢子懸液濃度的大小反映了產(chǎn)孢量多少。

從表2可以看出，HY-021在不同發(fā)酵基質(zhì)上的產(chǎn)孢量存在顯著差異。在等量發(fā)酵基質(zhì)和種子液接入量相同的前提下，HY-021在玉米粉基質(zhì)上生長旺盛，產(chǎn)孢量為1.25×1011個/mL，顯著大于其他處理，其次為麥麩、菜籽餅。正交組合優(yōu)化固體基質(zhì)發(fā)酵配方結(jié)果顯示，菌株HY-021在組合3（麥稈糠14.5 g+麥麩19.4 g+菜籽餅1.5 g+玉米粉14.6 g）中生長良好，產(chǎn)孢量顯著高于其他組合（表3）。

2.2HY-021可濕性粉劑載體和助劑的篩選

從圖1和表4可以看出，添加不同的載體和助劑后，菌株HY-021的菌落直徑和孢子液OD600存在不同程度的差異。加入載體高嶺土后，平均OD600是0.42， 6 d時的菌落直徑為8.47 cm，菌落生長速率最快。加入穩(wěn)定劑輕質(zhì)碳酸鈣后，OD600平均值為0.30，6 d時菌落直徑達到8.35 cm;加入分散劑羧甲基纖維素鈉后，OD600平均值為0.31，6 d時菌落直徑達到8.33 cm;添加保護劑可溶性淀粉后，OD600平均值為0.37，6 d時菌落直徑到達8.43 cm。在含有拉開粉的培養(yǎng)基上，菌株生長完全被抑制。結(jié)合菌株生長情況和原料成本，選擇高嶺土、輕質(zhì)碳酸鈣、羧甲基纖維素鈉、可溶性淀粉和十二烷基硫酸鈉分別作為HY-021的載體、穩(wěn)定劑、分散劑、保護劑和潤濕劑。

2.3HY-021可濕性粉劑的初步制備

在上述固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)配方優(yōu)化中得出最適HY-021菌生長的最優(yōu)基質(zhì)配比，進行批量固體發(fā)酵，HY-021菌株在此配比下白色菌絲生成旺盛，生長10 d后，將生長良好的菌株自然晾干，粉碎成菌粉與篩選出的適宜載體、助劑，按照50%的載體、6%的分散劑、1%穩(wěn)定劑和3%的潤濕劑的比例混合制成可濕性粉劑，保存在4℃冰箱備用。

2.4HY-021可濕性粉劑對盆栽雜草的致病性

如表5和圖2所示，噴施HY-021可濕性粉劑7 d后，對豬殃殃和藜的防治效果突出。對豬殃殃致病率和鮮重防效分別為89.45%和87.16%，植株葉片產(chǎn)生黑色病斑，逐漸褪綠成黑褐色，發(fā)病嚴重的植株枯死;對藜的致病率和鮮重防效達到85.83%和81.62%，植株表現(xiàn)為發(fā)黃、干枯萎蔫，直至整株枯死;對密花香薷的致病率和鮮重防效分別為58.89%和59.94%，植株表現(xiàn)為葉片出現(xiàn)大面積病斑，植株矮化。

3結(jié)論與討論

與化學農(nóng)藥的開發(fā)相比，微生物除草劑的開發(fā)難度要大得多，因為它的藥效會受到外部環(huán)境的影響，因此，選擇適當?shù)膭┬鸵约拜d體助劑來維持菌劑的穩(wěn)定性和侵染活力對成功開發(fā)生物農(nóng)藥非常關鍵［16］。莊超［17］將秸稈粉與齊整小核菌Sclerotium rolfsii菌絲混合制成固體顆粒劑型，在10、20、30、40 kg/667m2 4個處理劑量下，對一枝黃花Solidago decurrens幼苗7 d的株防效為85%～100%。Zhang等［18］將羧甲基纖維素和葡萄糖等助劑添加到凸臍蠕孢Exserohilum的孢子粉中，對稗草Echinochloa crus-galli的防除效果達90%以上。

近年來，生防菌在工業(yè)化生產(chǎn)中主要依賴于大型發(fā)酵裝置的大規(guī)模繁殖與生產(chǎn)［19］。但在生產(chǎn)過程中，難以產(chǎn)生繁殖體、產(chǎn)孢量低、孢子致病力較差、或在經(jīng)過多代繁殖后菌株的致病力下降，這些問題都阻礙生防真菌的規(guī)?；a(chǎn)和商品化。在真菌除草劑的開發(fā)過程中，合適的載體和助劑能夠促進并調(diào)控真菌孢子萌發(fā)，提高其致病性，同時降低環(huán)境限制，從而提高防治效果［20］。本研究以產(chǎn)孢量和OD600作為考察指標，確定適合HY-021生長的最適固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，隨后設計正交試驗篩選出適合其生長的最佳基質(zhì)配方組合，繼而對HY-021的適宜載體和助劑進行了篩選，最后完成HY-021可濕性粉劑的初步研制。試驗結(jié)果表明：HY-021最適生長的固態(tài)基質(zhì)為玉米粉，且最優(yōu)基質(zhì)組合為麥稈糠14.5 g+麥麩19.4 g+菜籽餅1.5 g+玉米粉14.6 g，根據(jù)菌株生長狀況并綜合考慮孢子懸浮液濃度，選擇高嶺土、羧甲基纖維素鈉、輕質(zhì)碳酸鈣、可溶性淀粉和十二烷基硫酸鈉分別作為HY-021的載體、分散劑、穩(wěn)定劑、保護劑和潤濕劑。

本試驗中利用初步制備的HY-021可濕性粉劑進行了盆栽雜草致病性測定，結(jié)果表明，HY-021可濕性粉劑對藜、密花香薷、豬殃殃3種雜草具有較好的除草活性，其中對藜和豬殃殃表現(xiàn)出較強的致病性，致病率分別為85.83%、89.45%。因此，該菌株有望成為田間防除藜、密花香薷、豬殃殃等雜草的生物除草劑，可配合使用其他生物菌劑或低量化學除草劑，應用于農(nóng)田防除雜草。

雜草生防菌劑需對目標雜草有較強的致病性，同時又要保證其穩(wěn)定性［13］。由于微生物細胞自身的生理特性，無法有效解決細胞在常溫下長時間保存的技術(shù)瓶頸問題，導致發(fā)酵基質(zhì)的固體劑型無法像化學除草劑那樣長時間保存，相對于化學除草劑存在明顯的劣勢。因此，未來還需要探索出一種可以延長其貨架壽命，同時提高其對不良環(huán)境抵抗力的方法，如加強對不同微生物，微生物菌劑與減量除草劑復配的研究力度，從而為雜草生防菌的田間應用打下更堅實的基礎［12］。

參考文獻

［1］DUBEY P K， JHA R K， SINGH V P， et al. Effectiveness of different weedicides on weed biomass， nutrient uptake and yield of rice ［J］. Journal of Krishi Vigyan， 2013， 2（1）： 1922.

［2］DENG Wei， DI Yingjie， CAI Jingxuan， et al. Target-site resistance mechanisms to tribenuron-methyl and cross-resistance patterns to ALS-inhibiting herbicides of catchweed bedstraw （Galium aparine） with different ALS mutations ［J］. Weed Science， 2019， 67（2）： 183188.

［3］李香菊. 我國耐除草劑轉(zhuǎn)基因作物研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化應用前景［J］. 植物保護， 2023， 49（5）： 316324.

［4］POPP J， PET K， NAGY J. Pesticide productivity and food security. A review ［J］. Agronomy for Sustainable Development， 2013， 33： 243255.

［5］張劍， 董曄欣， 張金林， 等， 一株具有高除草活性的真菌菌株［J］. 菌物學報， 2008， 27（5）： 645651.

［6］劉順字， 曹永軍. 微生物源農(nóng)藥應用現(xiàn)狀及發(fā)展前景［J］. 河南農(nóng)業(yè)科學， 2015， 44（5）： 2225.

［7］吳保峰， 刁治民， 熊亞. 微生物除草劑的研究現(xiàn)狀及應用前景［J］. 青海草業(yè)， 2004， 13（2）： 3439.

［8］楊恒友， 張劍， 劉杰. 微生物除草劑研究現(xiàn)狀與展望［J］. 北方園藝， 2010 （14）： 208210.

［9］楊志榮， 伍鐵橋， 劉世貴. V·B草原毛蟲生物防治劑的應用技術(shù)研究［J］. 草地學報， 1995， 3（4）： 317323.

［10］程亮， 郭青云. 內(nèi)生真菌HL-1的除草活性及對作物的安全性［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學報， 2015， 31（5）： 10121016.

［11］POSE-JUAN E， RIAL-OTERO R， MARTNEZ-CARBALLO E， et al. Determination of metal-axyl and identification of adjuvants in wettable powder pesticide technical formulas ［J］. Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2009， 394（6）： 15351544.

［12］朱海霞， 馬永強， 郭青云. 極細鏈格孢菌劑的初步研制及其除草作用研究［J］. 植物保護， 2018， 44（5）： 212216.

［13］朱海霞， 馬永強， 郭青云. 層出鐮孢菌GD-5固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件及對藜和密花香薷的除草活性［J］. 植物保護學報， 2018， 45（5）： 11541160.

［14］朱海霞， 馬永強， 郭青云. HZ-31多孢木霉菌劑的初步研制及其對闊葉雜草的毒力作用［J］. 西南農(nóng)業(yè)學報， 2017， 30（3）： 606609.

［15］彭崇慧， 馮建章， 張錫瑜. 分析化學［M］. 北京：北京大學出版社. 2020.

［16］高菊芳. 生物農(nóng)藥的作用、應用與功效（三）——活體微生物農(nóng)藥［J］. 世界農(nóng)藥， 2001（3）： 1119.

［17］莊超. 生物除草劑菌克闊劑型及其除草效果的研究［D］. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學， 2014.

［18］ZHANG W M， WATSON A K. Characterization of growth and conidia production of Exserohilum monoceras on different substrates ［J］. Biocontrol Science and Technology， 1997， 7（1）： 7586.

［19］張正波. 除草微生物禾長蠕孢的菌種改良與制劑的研究［D］. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學院， 2007.

［20］莊新亞， 程亮， 郭青云. 燕麥鐮刀菌GD-2可濕性粉劑研制及對野燕麥的防除效果［J］. 青海大學學報， 2020， 38（3）： 917.

（責任編輯：楊明麗）