寄生番茄的擬禾本科根結線蟲的鑒定及對番茄不同品種的趨性

摘要2019年福建省莆田市番茄‘農(nóng)科180’品種發(fā)生嚴重的根結線蟲病， 根尖處根結多呈“靴”狀。本研究通過形態(tài)學、線蟲rDNA-ITS、28S rDNA D2-D3序列分析與特異性引物檢測，明確病原線蟲種群為擬禾本科根結線蟲Meloidogyne graminicola。這是在福建省番茄上首次報道擬禾本科線蟲危害番茄。為探討不同番茄品種對擬禾本科根結線蟲的感、抗性，在Pluronic F-127膠體介質中測定該種群2齡幼蟲（J2）對5個番茄品種（農(nóng)科180’ ‘仙客1號’ ‘仙客6號’ ‘紅美人’和‘硬粉8號’）根尖的趨性，結果表明，趨向于‘農(nóng)科180’的J2數(shù)量顯著大于其他4個番茄品種，品種有無Mi基因與J2趨性無關;室內致病性試驗表明，接種后35 d調查，‘農(nóng)科180’發(fā)病率為100%，病情指數(shù)為60;‘仙客1號’ ‘仙客6號’ ‘紅美人’和‘硬粉8號’的發(fā)病率分別為53%、40%、33%和27%，病情指數(shù)均低于11。研究表明，番茄‘農(nóng)科180’根尖對J2具有強烈的吸引性是其感病的原因之一。生產(chǎn)中應重視番茄品種對擬禾本科根結線蟲的感抗性差異。

關鍵詞番茄;擬禾本科根結線蟲;鑒定;趨性;致病性

中圖分類號：S 435.2文獻標識碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023532Identification of Meloidogyne graminicola on tomato and it’s taxis to

the different tomato cultivarsCHEN Jingwei HUANG Hongjing LI Shuo WU Huaxiang CHENG Xi1，XIAO Shun1，LIU Guokun1*（1. Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology， Ministry of Education， Fujian Agriculture and Forestry

University， Fuzhou350002， China; 2. Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Xuhuai Region， Jiangsu

Province， Key Laboratory of Biology and Genetic Breeding of Sweetpotato， Ministry of Agriculture

and Rural Affairs，Xuzhou221131， China）AbstractSerious root-knot nematode disease of tomato （Solanum lycopersicum cv. ‘Nongke 180’） with typically hooked-shaped galls at the root tip was found in the Putian region， Fujian province. Based on the morphological and molecular analyses of rDNA-ITS and 28S rDNA D2-D3 sequences， and detection using species-specific primers， the nematode was identified as Meloidogyne graminicola. This is the first report of a natural infection of M.graminicola on tomato in Fujian province. Taxis assays of second stage juveniles （J2s） of M.graminicola to root tips of five tomato cultivars， including ‘Nongke 180’ ‘Xianke 1’ ‘Xianke 6’ ‘Hongmeiren’ and ‘Yingfen 8’ were tested using the Pluronic F-127 gel system. Greater numbers of J2s were significantly attracted to ‘Nongke 180’ than to the other four cultivars. There no association existed between attractive ability and the presence of Mi-resistance gene in the five cultivars. Pathogenicity of the nematode to the five tomato cultivars was conducted and compared， the results showed that the incidence of ‘Nongke 180’ was 100% incidence with a disease index of 60， while the incidence of ‘Xianke 1’ ‘Xianke 6’ ‘Hongmeiren’ and ‘Yingfen 8’ were 53%， 40%， 33%， and 27%， respectively， with all disease indexes being less than 11. The research showed that tomato cv. ‘Nongke 180’ was a susceptible host for M.graminicola， with strong attraction to J2s of the nematode.

Key wordsSolanum lycopersicum; Meloidogyne graminicola; identification; taxis; pathogenicity番茄Solanum lycopersicum是全世界最廣泛種植及消費最多的蔬菜種類，中國的番茄種植產(chǎn)量約占全球產(chǎn)量的32％［1］。根結線蟲Meloidogyne spp.是番茄上重要的病原物，侵染番茄根系導致大小不等的根結，影響植株的生長發(fā)育與營養(yǎng)吸收，田間發(fā)病一般可導致番茄產(chǎn)量損失10%～20%，嚴重的超過60%［23］。番茄是許多根結線蟲種的良好寄主，生產(chǎn)中危害嚴重的主要種類為南方根結線蟲M.incognita、爪哇根結線蟲M.javanica、花生根結線蟲M.arenaria、北方根結線蟲M.hapla和象耳豆根結線蟲M.enterolobii［3］。擬禾本科根結線蟲M.graminicola是水稻重要病原線蟲之一，主要侵染禾本科Poaceae、十字花科Brassicaceae、豆科Fabaceae等9個科19個屬90多種植物［45］，但通常認為擬禾本科根結線蟲不能危害番茄［67］。2022年在我國海南三亞市首次發(fā)現(xiàn)擬禾本科根結線蟲危害番茄［8］。作者在福建省莆田市荔城區(qū)番茄種植區(qū)發(fā)現(xiàn)了嚴重的根結線蟲病害，通過形態(tài)學和分子生物學鑒定，明確其為擬禾本科根結線蟲，并就該種群2齡幼蟲對番茄不同品種的根尖趨性進行了初步研究，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1番茄根結線蟲樣本采集、分離與種群繁育

樣本采集：番茄根結線蟲病害樣本（20份）于番茄采收期采自福建省莆田市荔城區(qū)東陽村基地（25°26′N，119°03′E），并隨機調查田間番茄根結線蟲病的發(fā)病率，記述根結癥狀特點。番茄品種為‘農(nóng)科180’，由福建省農(nóng)業(yè)科學院選育。

線蟲的分離［9］：在體視顯微鏡下直接剖離雌蟲，挑取番茄根結處卵囊，置于無菌水中孵化獲得2齡幼蟲（J2）;利用根孵育法獲得雄蟲。分離的線蟲用于形態(tài)學與分子生物學鑒定。

線蟲種群繁育：挑取單卵囊接種于滅菌沙土中培植的3葉期水稻（品種‘怪異2號’）根部進行種群繁育，正常水肥管理。純化的種群用于線蟲趨性研究。

1.2根結線蟲的鑒定

1.2.1形態(tài)鑒定

線蟲的殺死、臨時玻片制作等均參照張紹升［9］的方法。通過配備Nikon相機（DS-Ｒi1）的顯微鏡（Eclipse Ni-U 931609，尼康儀器株式會社）進行觀測與拍照。形態(tài)測量值按照De Man公式進行測量和計算。

1.2.2rDNA-ITS和28S rDNA D2-D3序列鑒定

采用凍融裂解法提取單條線蟲的DNA［10］：挑取單條J2幼蟲經(jīng)滅菌水清洗2遍后，轉移至裝有8 μL ddH2O、1 μL 10×PCR buffer的PCR管內，PCR管置于液氮中30 s后取出，加1 μL蛋白酶K（1.2 mg/mL），65℃溫育1.5 h，95℃ 10 min，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用rDNA-ITS區(qū)通用引物TW81（5′-GTTT-CCGTAGGTGAACCTGC-3′）/AB28（5′-ATATGC-TTAAGTTCAGCGGGT-3′）［11］;28S rDNA D2-D3區(qū)通用引物D2A（5′-ACAAGTACCGTGAGGGAA-AGTTG-3′）/D3B（5′-TCGGAAGGAACCAGCTA-CTA-3′）［12］進行鑒定。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系（25 μL）：模板DNA 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，PCR Mix（Premix TaqTM，TaKaRa）12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應程序：94℃預變性4 min;94℃ 30 s，55℃（ITS區(qū)）或54℃ （28S rDNA D2-D3區(qū)）30 s，72℃ 40 s，35個循環(huán);72℃ 10 min，4℃保存。

擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序，獲得的序列上傳GenBank獲得序列號。將所得序列在NCBI進行BLAST比對，選取序列相似度最高的類群構建發(fā)育樹，在CIPRES Science Gateway （www.phylo.org）［13］運算平臺上進行序列分析。運用程序MrBayes on XSEDE，采用GTR+I+G模型構建貝葉斯樹［14］;運用程序RAxML-HPC2 on XSEDE，采用GTRCAT模型構建極大似然樹［1516］。運算運行設定500萬代，最大似然法的自展重復設定為1 000次。最后采用FigTree v 1.4.3和Adobe Illustrator CC在貝葉斯50%多數(shù)原則一致樹上標注后驗概率和ML自展值， 拓撲結構不支持的自展值不標出。

1.2.3特異性引物檢測

隨機采集8株發(fā)病番茄（品種：‘農(nóng)科180’）的病根，隨機挑取單條雌蟲，經(jīng)凍融裂解法提取DNA。采用擬禾本科根結線蟲特異性引物Mg-F （5′-TTATCGCATCATTTTATTTG-3′）/Mg-R （5′-CG-CTTTGTTAGAAAATGACCCT-3′）進行擴增［17］。以南方根結線蟲DNA為陰性對照。反應程序：94℃ 5 min;94℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán);72℃ 10 min;4℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3擬禾本科根結線蟲對番茄根系的趨性觀察

1.3.1供試番茄品種及育苗

將 ‘農(nóng)科180’ ‘仙客1號’ ‘仙客6號’ ‘紅美人’和‘硬粉8號’番茄種子分別用紗布包好，在45℃溫水中浸泡50 min，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽。出芽2 mm后將種子播種于盛放滅菌土的育苗盤內，幼苗長出1片真葉后分別轉入營養(yǎng)缽內，在溫室25℃條件下培養(yǎng)備用。

1.3.2擬禾本科根結線蟲對番茄離體根的趨性觀察Pluronic F-127膠體配制參考Wang等［18］的方法。在4℃條件下，配制成含擬禾本科根結線蟲2齡幼蟲20條/100 μL的 Pluronic F-127膠體液，吸取含線蟲的膠體液2 mL加到直徑3.5 cm的無菌塑料培養(yǎng)皿內，輕輕搖動混勻。設置2種處理：1）每個皿擺放1條長度0.5 cm的番茄根尖，每個品種重復4次，用封口膜封住培養(yǎng)皿后轉移至25℃恒溫培養(yǎng)箱，分別于3、6、9 h和12 h時觀測根尖2 mm處聚集的J2數(shù)量。2）在無菌塑料培養(yǎng)皿內擺放5個品種的根尖（長度1 cm），每個品種1條根尖，圍繞中心置放，分別在0、9、18 h時觀測不同品種根尖對線蟲的趨引，記錄根尖周圍2 mm處聚集的J2數(shù)量;試驗重復4次。數(shù)據(jù)采用Duncan氏新復極差法（α=0.05）進行統(tǒng)計分析。

1.45個番茄品種Mi基因檢測

參考Williamson等的方法［19］分別提取5個品種番茄種子的DNA，提取的DNA立刻用于PCR或于－20℃保存。參考Garcia等［20］和戴均濤等［21］的方法，利用共顯性序列特征擴增區(qū)引物對Mi23F（5′-TGGAAAAATGTTGAATTTCTTTTG-3′）/Mi23R（5′-GCATACTATATGGCTTGTTTACCC-3′）擴增各番茄品種的Mi基因。若擴增得到430 bp的單一條帶，判定其不含Mi基因；若擴增得到380 bp的單一條帶，或同時擴增得到380、430 bp和500 bp 3個條帶判定其含Mi基因。反應程序為：94℃ 4 min;94℃ 1 min，52℃ 45 s，72℃ 1 min，35個循環(huán);72℃ 10 min;4℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5擬禾本科根結線蟲對番茄致病性測定

將新鮮收集的2齡幼蟲制作成500條/mL的線蟲懸浮液。待番茄苗長至6葉期時進行根系接種試驗，每盆種植1株番茄，每株番茄接種1 000條線蟲。每個品種接種5株，設置空白對照。接種后將番茄苗置于溫室正常生長管理。5周后檢查番茄根系，參考張紹升的分級標準［9］進行分級，計算每個品種的發(fā)病率和病情指數(shù)。0級：根系健康，沒有被侵染;1級：嚴格檢查，可見極少數(shù)小結癭;2級：根系可見明顯的小根癭，根功能受損不重;3級：根系有大量小根癭和部分大根癭，20%根系嚴重結癭和喪失功能;4級：75%根系嚴重結癭，喪失功能;5級：根系全部結癭，變色枯黃。

發(fā)病率=感病株數(shù)/調查株數(shù)×100%;

病情指數(shù)=∑（各級病株數(shù)×相應級值）/調查總數(shù)×最高級值×100。

2結果與分析

2.1番茄根結線蟲病癥狀及線蟲主要形態(tài)學特征

通過田間隨機調查100株番茄，發(fā)現(xiàn)番茄根結線蟲病發(fā)病率超過90%。番茄植株葉片黃化，將病株拔起可見明顯的根結癥狀，發(fā)病根系交織成團，根系呈不同程度的腫脹，有的似蘿卜狀，根瘤處可繼續(xù)長出新根，根尖處的根結多呈“靴”狀或棒槌狀（圖1 a）。線蟲卵囊包裹在根系表皮內，體視鏡下解剖腫脹根可見病組織內有多頭乳白色雌蟲、大量幼蟲和卵粒，在多數(shù)根結內可解剖到雄蟲。雌蟲呈梨形，乳白色，蟲體尾部有明顯突起，會陰花紋整體近似圓形，背弓較低，整體線紋連續(xù)且較為平滑，但在側區(qū)可見細碎紋路，形成不規(guī)則的條溝。多數(shù)會陰花紋腹線連續(xù)平滑，尾端陰門區(qū)，無或有少量線紋（圖1 b，c）。2齡幼蟲尾部細長，可見狹長的透明區(qū)，有明顯缺刻（圖1 d）。雌蟲、雄蟲和J2形態(tài)測量值見表1，形態(tài)特征與擬禾本科根結線蟲原始描述種一致［22］。

2.2分子生物學鑒定

2.2.1系統(tǒng)發(fā)育樹的構建與分析

利用通用引物TW81/AB28擴增番茄根部根結線蟲種群的rDNA-ITS，獲得了580 bp左右的條帶，序列上傳至GenBank獲得序列號MT159686和MT159687，序列比對結果顯示，所得的rDNA-ITS區(qū)序列與GenBank中其他擬禾本科根結線蟲種群的相似性在99%以上。以尖細潛根線蟲Hirschmanniella mucronata為外群構建系統(tǒng)發(fā)育樹，可見，該種群與NCBI上登錄的擬禾本科根結線蟲種群均聚在同一分支，后驗概率為0.98，自展值為100，與其他根結線蟲種處于不同分支（圖2a）;利用圖2利用通用引物D2A/D3B擴增番茄根部根結線蟲種群的28S rDNA D2-D3區(qū)序列，獲得了780 bp左右的條帶，序列上傳至GenBank獲得序列號MT159669和MT159670，序列比對結果顯示，所得D2-D3區(qū)序列與其他擬禾本科根結線蟲種群的相似性在99%～100%。以肥尾短體線蟲Pratylenchus pinguicaudatus為外群構建系統(tǒng)發(fā)育樹，可以看到本研究獲得的種群與NCBI上登錄的擬禾本科根結線蟲種群均聚在同一分支，后驗概率為1，自展值為70，與其他根結線蟲種處于不同分支（圖2b）。

2.2.2特異性引物檢測

利用擬禾本科根結線蟲特異性引物Mg-F/Mg-R進行檢測，8個樣本均獲得長度約300 bp 的特異條帶，空白對照無擴增條帶（圖3）。結合形態(tài)學鑒定結果，確定危害番茄的根結線蟲種群為擬禾本科根結線蟲。

2.3不同番茄品種根尖對擬禾本科根結線蟲趨性的影響在Pluronic F-127膠體系統(tǒng)中含有單個品種的單條根系時，0 h，J2隨機均勻分布于膠體內，5個品種根尖處未觀察到線蟲聚集現(xiàn)象;3 h， ‘農(nóng)科180’‘仙客6’和‘仙客1號’根尖周圍聚集的線蟲數(shù)量較多，且數(shù)量基本維持在12～15條，‘硬粉8號’和‘紅美人’根尖周圍聚集的線蟲數(shù)量在6～7條;6 h，5個品種根尖吸引線蟲的數(shù)量都有小幅提升，其中‘農(nóng)科180’根尖聚集的J2數(shù)量（約37條）顯著多于‘仙客1號’ ‘紅美人’‘硬粉8號’;9 h，5個品種吸引線蟲的數(shù)量有較大的提升，其中‘農(nóng)科180’ （約98條）和‘仙客6號’（約91條）最為明顯，顯著多于其他3個品種;12 h，‘農(nóng)科180’吸引線蟲數(shù)量達到201條左右，顯著多于其余4個品種（表2）。

將5個番茄品種的根尖同時放在Pluronic F-127膠體系統(tǒng)中時， 0 h，線蟲隨機均勻分布在膠體中;9 h，J2s主要聚集于‘農(nóng)科180’根尖處（圖4）數(shù)量顯著多余其余4個品種（表3）;18 h，‘農(nóng)科180’根尖處聚集線蟲數(shù)量有所減少，可能與侵入根系內有關，但仍然顯著多于其余4個品種（表3）。

2.45個番茄品種的Mi基因檢測結果

采用引物Mi23F/Mi23R檢測5個番茄品種的Mi基因，結果表明：‘仙客1號’和‘仙客6號’擴增出500、430 bp和380 bp 3條帶，即為Mi/mi雜合基因型，‘農(nóng)科180’‘硬粉8號’和‘紅美人’擴增出1條430 bp的條帶，表明均不含Mi基因（圖5）。

2.5擬禾本科根結線蟲對5個番茄品種的致病性

將擬禾本科根結線蟲2齡幼蟲分別接種到番茄根系，5周后檢查根系根結，結果見表4。5個番茄品種根系均發(fā)現(xiàn)有根結癥狀，‘農(nóng)科180’株發(fā)病率為100%，病情指數(shù)為60，受害最嚴重，顯著高于其余4個含或不含Mi基因的番茄品種。所有對照植株根系均未發(fā)現(xiàn)根結癥狀。

3結論與討論

本文通過形態(tài)學與分子生物學鑒定方法，明確侵染番茄‘農(nóng)科180’的根結線蟲為擬禾本科根結線蟲。番茄是許多常見根結線蟲種的良好寄主，但對于擬禾本科根結線蟲，大多數(shù)研究表明其無法侵染番茄或能侵染卻不能在番茄中繁殖［6］，說明大多數(shù)番茄品種不是擬禾本科根結線蟲的良好寄主。本研究調查發(fā)現(xiàn)，擬禾本科根結線蟲侵染‘農(nóng)科180’后，受害植株根部有嚴重的根結癥狀，地上部生長不良，導致產(chǎn)量與品質大幅下降。這是繼中國海南地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)擬禾本科根結線蟲侵染大田番茄（品種：‘Jinsheng’）［8］后的再次發(fā)現(xiàn)，表明一些番茄品種是擬禾本科根結線蟲的良好寄主。受擬禾本科根結線蟲侵染的番茄根尖呈現(xiàn)典型的腫脹倒勾狀，這與水稻等禾本科寄主的受害癥狀類似［23］，但與其他根結線蟲種侵染番茄引起的根結癥狀有明顯的區(qū)分度，可作為田間識別的重要特征。擬禾本科根結線蟲是水稻上最重要的病原線蟲之一，在國內多個省份水稻產(chǎn)區(qū)發(fā)生且日趨擴散，特別是在直播稻上發(fā)生嚴重［23］。擬禾本科根結線蟲在福建省最早發(fā)現(xiàn)于南平市政和縣水稻以及周邊溝渠的油芒Spodiopogon cotulifer等雜草寄主上［24］，隨后發(fā)現(xiàn)香蕉Musa acuminata［25］、韭菜Allium tuberosum［26］等新寄主。本次發(fā)現(xiàn)擬禾科根結線蟲的番茄田為稻菜輪作田，其初侵染源可能來自前季水稻。加強擬禾本科根結線蟲的生理小種、寄主范圍，以及對番茄品種的感抗性測定對生產(chǎn)具有重要意義。

利用寄主抗性是防治番茄根結線蟲病的最經(jīng)濟有效的措施。目前Mi-1基因是番茄中唯一被商業(yè)化利用的抗根結線蟲基因，國際上抗根結線蟲的番茄品種基本都攜帶該基因，攜帶該基因的品種能有效地抵抗南方根結線蟲Meloidogyne incognita、爪哇根結線蟲M.javanica和花生根結線蟲M.arenaria［27］。研究表明，番茄‘仙客6號’和‘仙客1號’含有Mi基因［28］，本研究證實， ‘農(nóng)科180’ ‘紅美人’和‘硬粉8號’不含有Mi基因。在Pluronic F-127膠體系統(tǒng)中，擬禾本科根結線蟲J2對‘農(nóng)科 180’的趨性顯著大于其他4個品種，表明，品種是否含有Mi-1基因與擬禾本科根結線蟲的趨性并沒有關系。致病性試驗表明，擬禾本科根結線蟲只導致‘農(nóng)科180’根系出現(xiàn)嚴重的根結癥狀且造成明顯損害，其余4個番茄品種雖可產(chǎn)生根結，但是根結的癥狀極其輕微。‘農(nóng)科180’根尖對J2的吸引力顯著高于其他4個品種，這可能是‘農(nóng)科180’高感擬禾本科根結線蟲的一個重要因素，感病的具體原因還需進一步地深入研究。

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（責任編輯：楊明麗）