侵染北京、寧夏和內(nèi)蒙古番茄的番茄黃曲葉病毒的鑒定和全基因組分析

摘要為明確從北京、寧夏和內(nèi)蒙古采集的15份疑似病毒感染的番茄樣本是否感染番茄黃曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus， TYLCV），利用TYLCV的特異性引物對采集的樣本進行檢測，結(jié)果從8個樣本中擴增到TYLCV片段，并獲得了8個樣本TYLCV的全長序列。序列分析發(fā)現(xiàn)，樣本NS-1、NS-5、NS-8、NS-9、NS-13和NS-14的全長核苷酸序列與北京分離物TYLCV-BJTZ的相似性最高，達99.03%～99.42%;NS-2與陜西分離物TYLCV-JY-2的相似性最高，為99.60%;NS-7與江蘇分離物TYLCV-YZ02的相似性最高，為99.35%。表明這8個TYLCV全基因組均為TYLCV的不同分離物。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，這8個TYLCV分離物與2017年鑒定的北京分離物聚成一個單獨的分支，說明與北京分離物的親緣關(guān)系最近。研究結(jié)果顯示，TYLCV已經(jīng)擴散到寧夏和內(nèi)蒙古，在我國分布范圍不斷擴大。

關(guān)鍵詞番茄黃曲葉病毒;PCR;基因組序列

中圖分類號：S 436.412.1文獻標(biāo)識碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2024212Identification and complete genome sequence analysis of tomato yellow leaf

curl virus infecting tomato in Beijing， Ningxia， and Inner MongoliaCHEN Wei1，2#，ZHAO Xinru2#，ZHOU Hui2#，SHI Juan3，YANG Changkai4，YANG Yukui4，

JIANG Tong ZHOU Xueping YANG Xiuling

（1. College of Plant Protection， Anhui Agricultural University， Hefei230036， China; 2. State Key Laboratory

for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural

Sciences， Beijing100193， China; 3. College of Agriculture， Ningxia University， Yinchuan750021， China;

4. Yunnan Sinong Vegetables Seed Co.， Ltd.， Chuxiong651300， China;

5. Institute of Biotechnology， Zhejiang University， Hangzhou310058， China）AbstractTo determine whether 15 tomato samples collected from Beijing， Ningxia， and Inner Mongolia， exhibiting symptoms of viral infection have been infected by tomato yellow leaf curl virus （TYLCV）， specific primers were used for TYLCV detection， and fragments of the expected size were amplified from eight samples. The complete genome sequences of TYLCV were further obtained from these eight samples. Sequence analysis revealed that the full-length sequences cloned from NS-1， NS-5， NS-8， NS-9， NS-13， and NS-14 showed the highest identity with the Beijing isolate TYLCV-BJTZ， ranging from 99.03% to 99.42%. NS-2 shared the highest similarity （99.60%） with the Shaanxi isolate TYLCV-JY-2， while NS-7 showed the highest similarity （99.35%） with the Jiangsu isolate TYLCV-YZ02， suggesting that the virus isolated from the eight tomato samples belongs to different isolates of TYLCV. Phylogenetic analysis indicated that the TYLCV sequences were most closely related to the Beijing isolate identified in 2017. This study demonstrates the occurrence of TYLCV in Ningxia and Inner Mongolia， expanding our understanding of the geographic distribution of TYLCV in China.

Key wordstomato yellow leaf curl virus;PCR;genome sequence雙生病毒是一類單鏈環(huán)狀DNA病毒，病毒粒子為孿生顆粒形態(tài)［1］。根據(jù)基因組結(jié)構(gòu)、介體種類和寄主范圍，雙生病毒被劃分為14個屬：畫眉草病毒屬Eragrovirus、蕪菁曲頂病毒屬Turncurtovirus、曲頂病毒屬Curtovirus、番茄偽曲頂病毒屬Topocuvirus、菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus、甜菜曲頂病毒屬Becurtovirus、玉米線條病毒屬Mastrevirus、美杜莎大戟潛隱病毒屬Capulavirus、葡萄斑點病毒屬Grablovirus以及新劃分的柑橘矮縮病毒屬Citlodavirus、蘋果樹病毒屬Maldovirus、桑樹皺葉病毒屬Mulcrilevirus、仙人掌病毒屬Opunvirus和番茄頂端卷葉病毒屬Topilevirus［2］。菜豆金色花葉病毒屬種類最多，其中番茄黃曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）是對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)威脅最為嚴(yán)重的病毒之一，分布范圍遍及6大洲，在16科的49個植物物種中被檢測到。番茄是TYLCV主要的寄主植物，已被《Molecular Plant Pathology》雜志列為全球十大植物病毒之一［35］。感染TYLCV的番茄等植物產(chǎn)生葉片卷曲、黃化、生長遲緩等癥狀，極大影響了番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重時可導(dǎo)致產(chǎn)量損失高達100%［4］。與大多數(shù)菜豆金色花葉病毒屬病毒相似，TYLCV的基因組為單鏈環(huán)狀DNA，包含6個開放閱讀框（open reading frame， ORF），V1和V2位于病毒的正義鏈上，C1、C2、C3和C4則位于病毒的互補鏈上［6］。近期研究發(fā)現(xiàn)，TYLCV等雙生病毒還包含了小的具有特殊定位和獨特功能的ORF，如位于正義鏈的V3定位于高爾基體，能夠抑制RNA沉默;位于互補鏈的C5是RNA沉默抑制子;C6包含線粒體定位信號，定位于線粒體［68］。

我國于2006年在上海孫橋農(nóng)場首次報道TYLCV［9］，此后，TYLCV在國內(nèi)多個省份的番茄種植區(qū)廣泛傳播，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。截至2021年底，在我國已分離、鑒定的99種雙生病毒中，TYLCV是分布最廣的雙生病毒［10］，在云南、山東和河南等24個省份均分離獲得TYLCV的全長基因組序列。然而，內(nèi)蒙古和寧夏僅有關(guān)于TYLCV危害癥狀的描述，并未通過全長基因組序列測定明確TYLCV的分布［11］。本研究對采集自北京、內(nèi)蒙古和寧夏疑似病毒感染的15個番茄樣品進行TYLCV鑒定，并在此基礎(chǔ)上對病毒的全長基因組序列進行分析，旨在進一步明確TYLCV在我國的分布。

1材料與方法

1.1材料來源

2022年從北京市（NS-1、NS-2、NS-3、NS-4和NS-5）、寧夏回族自治區(qū)（NS-6、NS-7和NS-8）、內(nèi)蒙古自治區(qū)（NS-9、NS-10、NS-11、NS-12、NS-13、NS-14和NS-15）等地采集到具有黃化葉片卷曲等疑似TYLCV侵染癥狀的番茄病株（圖1）;以本實驗室構(gòu)建的TYLCV-BJ （MN432609.1）侵染性克隆侵染后的番茄樣品為陽性對照。

1.2植物總DNA的提取

采用CTAB法提取番茄樣品的DNA［12］。用RNase去除DNA中的RNA并測定濃度后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，檢測合格后保存在-20℃冰箱。

1.3TYLCV的PCR檢測

依據(jù)TYLCV-BJ的保守序列，設(shè)計TYLCV的特異性檢測引物（TYLCV-F：5′-ATGTCGAAGCG-

ACCAGGCG-3′;TYLCV-R：5′-CATACACTGGATTAGAGGCATGG-3′），預(yù)期擴增片段大小約為700 bp，以樣品DNA為模板，利用全式金生物技術(shù)有限公司的高保真DNA聚合酶FastPfu（貨號：AP221）對樣品進行PCR擴增，PCR擴增體系為： 5×反應(yīng)緩沖液5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板DNA 1 μL，F(xiàn)astPfu高保真聚合酶0.5 μL，用超純水補至25 μL。PCR擴增條件為：95℃預(yù)變性2 min;95℃變性20 s，53℃退火20 s，72℃延伸45 s，循環(huán)30次;72℃延伸5 min。使用Omega公司的Gel Extraction Kit（貨號：D2500），對目的條帶進行切膠回收，回收產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司測序。

1.4TYLCV全長序列的克隆

依據(jù)病毒特異性檢測片段的測序結(jié)果，設(shè)計了用于擴增TYLCV全長的背靠背引物（TYLCV-clone-F：5′-ACTCGTGGATCTGGAATTACTCACAG-3′;TYLCV-clone-R：5′-TCCACGAGTAACATCACTAACACAACG-3′），預(yù)期大小約2.8 kb，以特異性檢測為陽性的樣品DNA為模板，利用FastPfu擴增全基因組序列，反應(yīng)體系參考1.3，PCR擴增條件為：95℃預(yù)變性2 min;95℃變性20 s，53℃退火20 s，72℃延伸2 min，循環(huán)30次;72℃延伸5 min。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，使用Gel Extraction Kit回收目的片段。采用全式金生物技術(shù)有限公司的T載體pEASY-Blunt Zero Cloning Kit（貨號：CB501）進行PCR擴增產(chǎn)物的連接。重組載體通過熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有50 mg/L卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～16 h，挑取單菌落以T載體試劑盒提供的通用引物M13 F （5′-ACTGGCCGTCGTTTTAC-3′）和M13 R （5′-GTCATAGCTGTTTCCTG-3′）進行菌落PCR檢測，每個樣品分別挑選2個擴增出約3.0 kb目的片段的陽性克隆提取質(zhì)粒，送至北京擎科生物科技有限公司測序。

1.5序列分析

在NCBI 上選取國內(nèi)外有代表性的TYLCV序列，使用MEGA軟件進行多序列比較分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，使用SDT軟件進行成對序列距離分析［13］，使用DNAMAN軟件進行序列相似性比較［14］。

2結(jié)果與分析

2.1感病番茄樣品中TYLCV的鑒定

利用TYLCV的特異性引物對北京、寧夏和內(nèi)蒙古采集的15份番茄樣品（NS-1～NS-15）進行檢測。如圖2所示，8份樣品與陽性樣品均在預(yù)期的700 bp處擴增到單一條帶，分別為采集自北京的NS-1、NS-2、NS-5，采集自寧夏的NS-7、NS-8，以及采集自內(nèi)蒙古的NS-9、NS-13、NS-14。回收目的條帶進行測序，利用blastn對測序結(jié)果進行比對，發(fā)現(xiàn)從8份樣品中擴增出的片段序列與最相似的TYLCV分離物的相似性為99.03%～99.60%，表明8個樣品可能被TYLCV感染。

2.2TYLCV全長基因組序列的克隆

利用擴增TYLCV全長的背靠背引物進行PCR擴增，發(fā)現(xiàn)8份樣品中均能擴增到約2.8 kb的條帶（圖3）。進一步通過割膠回收，克隆測序，成功獲得了8條TYLCV的全長基因組序列，8條序列高度相似，彼此間相似性在98%以上。利用blastn與NCBI中登記的TYLCV序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NS-1、NS-5、NS-8、NS-9、NS-13和NS-14與2017年鑒定的北京分離物TYLCV-BJTZ的相似性最高，在99.03%～99.42%之間;NS-2與2021年在陜西發(fā)現(xiàn)的分離物TYLCV-JY-2的相似性最高，為99.60%;NS-7則與2018年在江蘇發(fā)現(xiàn)的分離物TYLCV-YZ02的相似性最高，為99.35% （表1，圖4）。根據(jù)國際病毒分類委員會關(guān)于雙生病毒的分類標(biāo)準(zhǔn)：相似性大于94%則為同一病毒的不同分離物，本研究所鑒定的8個TYLCV分離物為TYLCV的不同分離物。

2.3TYLCV的基因組結(jié)構(gòu)和序列分析

對8個TYLCV分離物基因組結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)與已報道的TYLCV相似，8個TYLCV分離物的基因組包括6個主要ORF，包括病毒鏈上的V1（777 bp）和V2（351 bp），互補鏈上的C1（1 074 bp）、C2（408 bp）、C3（405 bp）、C4（294 bp），并在正義鏈和互補鏈之間存在一個高度保守的非編碼的基因間隔區(qū)（intergenic region，IR）。此外還有3個小ORF，分別是正義鏈上的V3（234 bp）和互補鏈上的C5（204 bp）、C6（189 bp）。

對各個ORF編碼氨基酸的相似性分析表明，8個分離物與其最相似的TYLCV分離物之間所有ORF編碼的氨基酸均比較保守，序列相似性在97%以上。其中正義鏈上的V1和互補鏈上的C2相對保守，各個分離物V1和C2編碼的氨基酸序列相似性分別在99%以上和98%以上;V3和C5的差異相對較大，各個分離物V3和C5編碼的氨基酸序列相似性分別為97.40%～100.00%和97.01%～100.00%（表1）。

2.4TYLCV核苷酸序列的系統(tǒng)進化分析

為明確8個新鑒定的TYLCV分離物與其他TYLCV分離物的系統(tǒng)進化關(guān)系，對獲得的病毒分離物與世界各地尤其是在中國發(fā)現(xiàn)的代表性的TYLCV分離物的核苷酸序列進行比對和系統(tǒng)進化樹分析（圖5），結(jié)果顯示，此次發(fā)現(xiàn)的TYLCV分離物與北京等地區(qū)早先發(fā)現(xiàn)的分離物親緣關(guān)系較近，在進化樹中，NS-1、NS-5、NS-8、NS-9、NS-13、NS-14 均位于北京 TYLCV-BJTZ（MF590733.1）的下游，顯示出進一步分化的趨勢。

3結(jié)論與討論

我國是世界上最大的番茄生產(chǎn)國，然而番茄生產(chǎn)過程中經(jīng)常遭受病毒病的危害。TYLCV是一種高破壞性的植物病毒，可導(dǎo)致番茄植株出現(xiàn)葉色變黃和卷曲癥狀，嚴(yán)重影響植株生長發(fā)育［15］。了解該病毒的發(fā)生分布是病害控制的前提，本研究對采集自北京、寧夏和內(nèi)蒙古的15個疑似病毒感染的番茄樣品進行鑒定，從8個樣品中鑒定到了TYLCV并獲得了病毒的全長基因組序列，首次通過序列測定證明TYLCV在寧夏和內(nèi)蒙古的發(fā)生分布。

根據(jù)國際病毒分類委員會（ICTV）的標(biāo)準(zhǔn)，雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬的病毒，全基因組核苷酸序列相似性小于91%時被視為不同病毒，91%～94%為同種病毒的不同株系，大于94%則為不同分離物［16］。本研究獲得的TYLCV的全長基因組序列與已報道的TYLCV分離物的序列，相似性均在94%以上，表明從8個樣品中分離鑒定的病毒為TYLCV的不同分離物。通過序列分析，新分離物與北京地區(qū)的分離物具有較高的相似性，推測2022年新采集的分離物可能是2017年北京分離物的進一步分化或者通過煙粉虱等介體傳播擴散至新的地區(qū)。結(jié)合之前的研究結(jié)果以及本研究結(jié)果，TYLCV已至少在我國26省、市、區(qū)分布。因此，需持續(xù)加強TYLCV的監(jiān)測，了解TYLCV在我國的發(fā)生動態(tài)，監(jiān)測中國各大番茄產(chǎn)區(qū)的TYLCV變異和分化水平，為防控提供理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）