復(fù)合侵染云南西番蓮的兩種菜豆金色花葉病毒屬病毒的分子鑒定及序列分析

摘要西番蓮Passiflora caerulea是我國(guó)南部省區(qū)廣泛種植的一種熱帶果樹。本研究于2020年6月從云南省德宏州西番蓮種植區(qū)采集到4份疑似感染菜豆金色花葉病毒屬病毒的西番蓮樣品，利用PCR擴(kuò)增、克隆、測(cè)序以及生物信息學(xué)分析等方法，明確了西番蓮樣品受菜豆金色花葉病毒屬病毒侵染。對(duì)4份西番蓮樣品進(jìn)行菜豆金色花葉病毒屬病毒全基因組擴(kuò)增，從中共獲得5條菜豆金色花葉病毒屬病毒全基因組序列，分別命名為YN7292-6、YN7293-12、YN7293-4、YN7294-16和YN7295-25，均具有菜豆金色花葉病毒屬單組分病毒的典型結(jié)構(gòu)，編碼7個(gè)開放閱讀框（open reading frame， ORF）;其中YN7292-6、YN7293-12、YN7294-16及YN7295-25與一品紅曲葉病毒（Euphorbia leaf curl virus， EuLCuV）的不同分離物的核苷酸相似性均高于99.05%，為EuLCuV的不同分離物;而YN7293-4則與分離自江西西番蓮樣品的廣東番木瓜曲葉病毒（papaya leaf curl Guangdong virus， PaLCuGdV）分離物GNPF1（GenBank登錄號(hào)：MK673114.1）的核苷酸相似性最高，為99.70%，為PaLCuGdV的一個(gè)分離物;重組分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)分離物EuLCuV-YN7293-12和PaLCuGdV-YN7293-4 均為重組病毒。本研究首次在云南省發(fā)現(xiàn)EuLCuV和PaLCuGdV這2種菜豆金色花葉病毒屬病毒復(fù)合侵染西番蓮，為有效預(yù)防和控制西番蓮病毒病害的發(fā)生和傳播提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞廣東番木瓜曲葉病毒;一品紅曲葉病毒;西番蓮;復(fù)合侵染;重組

中圖分類號(hào)：S 432.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023514Molecular identification and sequence analysis of two begomoviruses from

Passiflora caerulea in Yunnan province， ChinaZHONG Jing1，LI Tingting1，ZHAO Liling1，HOU Yue2，YE Suzheng1，XIE Mian2，DING Ming1*（1. Key Laboratory of Agricultural Biotechnology of Yunnan Province， Key Laboratory of the Southwestern Crop

Gene Resources and Germplasm Innovation， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Biotechnology

and Germplasm Resources， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming650223， China; 2. Agricultural

Technology Extension Center of Mangshi County， Dehong Prefecture， Mangshi678400， China）AbstractPassiflora caerulea is a kind of tropical fruit tree widely planted in the southern provinces of China. The suspected virus-infected P.caerulea has been found in the growing area of Dehong prefecture， Yunnan province. In this study four P.caerulea samples were collected in June 2020 and identified using PCR amplification， cloning， sequencing and bioinformatics analysis. Five full genome sequences， namely YN7292-6， YN7293-12， YN7294-4， YN7294-16 and YN7295-25 were obtained from this four samples， they all have typical monopartite begomoviruses genome structure， encoding seven open reading frames （ORF）. The sequences YN7292-6， YN7293-12， YN7294-16 and YN7295-25 were most closed to different isolates of Euphorbia leaf curl virus （EuLCuV） with the similarity higher than 99.05% in total nucleotide sequences. The sequence YN7293-4 were most closely related to isolate GNPF1（GenBank accession no： MK673114.1）of papaya leaf curl Guangdong virus （PaLCuGdV） with the similarity of 99.70% in total nucleotide sequences. Recombinant analysis showed that EuLCuV-YN7293-12 and PaLCuGdV-YN7293-4 were both recombinant begomoviruses. This is first report of EuLCuV and PaLCuGdV synergistically infected passionflower in Yunnan province， which provide a theoretical basis for effective prevention and control of P.caerulea viral diseases.

Key wordspapaya leaf curl Guangdong virus;Euphorbia leaf curl virus;Passiflora caerulea;mixed infection;

recombination雙生病毒科Geminiviridae病毒是廣泛分布于全球熱帶及亞熱帶地區(qū)的一類單鏈環(huán)狀DNA病毒，對(duì)全球植物具有嚴(yán)重的危害。但近年來，雙生病毒在溫帶設(shè)施大棚中也時(shí)有發(fā)生，說明該類病毒的分布范圍在不斷擴(kuò)大，推測(cè)其危害可能將會(huì)日趨嚴(yán)重［12］。根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)（International Committee on Taxonomy of Viruses， ICTV）的分類將雙生病毒科分為14個(gè)屬［3］，分別為玉米線條病毒屬M(fèi)astrevirus、曲頂病毒屬Curtovirus、番茄偽曲頂病毒屬Topocuvirus、菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus、甜菜曲頂病毒屬Becurtovirus、畫眉草病毒屬Eragrovirus、蕪菁曲頂病毒屬Turncurtovirus、葡萄斑點(diǎn)病毒屬Grablovirus、美杜莎大戟潛隱病毒屬Capulavirus［45］、柑橘褪綠矮縮相關(guān)病毒屬Citlodavirus、蘋果病毒屬M(fèi)aldovirus、桑葉皺葉病毒屬M(fèi)ulcrilevirus、仙人掌病毒屬Opunvirus和番茄頂葉卷曲病毒屬Topilevirus［6］，其中菜豆金色花葉病毒屬病毒是種類最多、分布最廣和造成危害最嚴(yán)重的一個(gè)屬，該屬病毒主要通過煙粉虱Bemisia tabaci以持久性方式傳播，因此又稱為粉虱傳雙生病毒。該屬病毒為環(huán)狀單鏈DNA病毒，病毒粒子大小約為18 nm×30 nm，主要侵染雙子葉植物［78］。根據(jù)基因組類型該屬病毒分為單組分和雙組分病毒，雙組分病毒包含了2條大小為2.5～2.8 kb的DNA分子（DNA-A和DNA-B），如菜豆金色花葉病毒（bean golden mosaic virus， BGMV）［9］，單組分病毒僅含一條大小約為2.8 kb的DNA分子（DNA-A），但單組分菜豆金色花葉病毒屬病毒通常還伴隨衛(wèi)星分子，如中國(guó)番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl China virus， TYLCCNV），通常伴隨中國(guó)番茄黃化曲葉beta衛(wèi)星分子（tomato yellow leaf curl China betasatellite， TYLCCNB）［10］。

西番蓮Passiflora caerulea是西番蓮科Passifloracea西番蓮屬Passiflora植物，原產(chǎn)于南美洲，現(xiàn)廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，至今已在我國(guó)臺(tái)灣、廣東、海南、福建、貴州、廣西、云南、四川等省區(qū)大量推廣栽種［1112］。西番蓮植株用途較廣，可作為食用、藥用和綠化觀賞苗木等［13］，由于其果肉和果汁都具有獨(dú)特的香味也被稱為百香果。近年來，西番蓮在我國(guó)南方種植面積不斷擴(kuò)大，已成為部分區(qū)域特色產(chǎn)業(yè)中的重要果樹。前期病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)，隨著云南省西番蓮種植規(guī)模不斷擴(kuò)大，不同區(qū)域西番蓮種植田塊均有病毒病發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率高達(dá)100%，嚴(yán)重影響西番蓮的產(chǎn)量、質(zhì)量和該產(chǎn)業(yè)的持續(xù)、健康發(fā)展，明確西番蓮病毒病的病原從而精準(zhǔn)防治西番蓮病毒病對(duì)于西番蓮產(chǎn)業(yè)發(fā)展顯得尤為重要。

1993年在波多黎各首次報(bào)道了菜豆金色花葉病毒屬病毒侵染西番蓮，通過田間癥狀描述為西番蓮葉斑駁?。?4］，后經(jīng)鑒定為麻風(fēng)樹花葉病毒（Jatropha mosaic virus， JMV）［15］;2003年Novaes等在巴西分離到了西番蓮小葉花葉病毒（passionflower flower little leaf mosaic virus， PLLMV）［16］;2017年Vaca-Vaca等在哥倫比亞從西番蓮中分離并命名了西番蓮葉片皺縮病毒（passionflower fruit leaf distortion virus， PLDV）［17］;國(guó)內(nèi)臺(tái)灣省已報(bào)道侵染西番蓮的菜豆金色花葉病毒屬病毒有2個(gè)種，分別為一品紅曲葉病毒（Euphorbia leaf curl virus， EuLCuV）和廣東番木瓜曲葉病毒（papaya leaf curl Guangdong virus， PaLCuGdV）［18］;隨后在廣西、福建等地也發(fā)現(xiàn)這2種菜豆金色花葉病毒屬病毒可侵染西番蓮植株［1920］。本研究對(duì)云南省德宏州疑似感染雙生病毒的西番蓮植株進(jìn)行病毒種類鑒定，并通過分子生物信息學(xué)相關(guān)分析方法進(jìn)行病毒序列進(jìn)化及重組分析，以期為該區(qū)域西番蓮病毒病害防控提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1樣品來源

樣品采集：2020年10月從云南省德宏州芒市西番蓮種植區(qū)采集西番蓮疑似感染病毒的樣品4株，將樣品編號(hào)并裝入帶標(biāo)記的自封袋中（圖1），置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2試劑和儀器

試劑：Taq Plus DNA聚合酶購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司;dNTPs（2.5 μmol/L）、DNA Ladder Marker購(gòu)自TaKaRa公司;KOD FX DNA聚合酶購(gòu)自日本東洋紡;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen;瓊脂糖購(gòu)自德國(guó)BioFroxx;pEASY-Blunt Zero Cloning Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;pGEM-T Easy購(gòu)自美國(guó)Promega公司;T4 DNA連接酶購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司;TempliPhiTM Kit購(gòu)自GE Healthcare Life Sciences公司。

儀器：5418R型高速臺(tái)式離心機(jī)，Eppendof;C1000 Touch Thermal Cycler，BIO-RAD;DK-8D型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金怡儀器科技有限公司;Tissuelyser-192型全自動(dòng)樣品快速研磨儀、MK2000-2E型干式恒溫器，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司;SKP-02.420型電熱恒溫培養(yǎng)箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司;THZ-C-1全溫振蕩器、瓊脂糖水平電泳儀、SIM-F140AY6制冰機(jī)，SANYO。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1總DNA的提取

西番蓮樣品總DNA的提取采用CTAB法［21］，提取的DNA用超純水溶解后于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2西番蓮樣品中菜豆金色花葉病毒屬病毒檢測(cè)用菜豆金色花葉病毒屬病毒的通用引物PA/PB（表1）［22］對(duì)4份西番蓮樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，同時(shí)用beta衛(wèi)星分子和alpha衛(wèi)星分子通用引物β01/β02［23］和UNA101/UNA102［24］（表1）對(duì)4份西番蓮樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，以含有菜豆金色花葉病毒屬病毒全基因組的重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照，以健康西番蓮樣品為陰性對(duì)照。

PCR反應(yīng)體系：10×PCR 反應(yīng)緩沖液（含 Mg2+）5 μL，dNTPs（2.5 μmol/L）4 μL，F(xiàn)/R 引物（20 μmol/L）各 1 μL，Taq Plus DNA 聚合酶（5 U/μL）1 μL，模板DNA 0.8 μL，加超純水定容至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性 2 min;94℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸60 s（PA/PB）或90 s（β01/β02和UNA101/UNA102），32個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收目標(biāo)條帶，將回收產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接，熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中后進(jìn)行涂板，倒置過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆，送華大基因測(cè)序。

1.2.3西番蓮樣品中菜豆金色花葉病毒屬病毒滾環(huán)擴(kuò)增利用TempliPhiTM Kit對(duì)樣品DNA進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification， RCA），RCA可對(duì)環(huán)狀DNA進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)靶核酸信號(hào)的放大。具體步驟：在0.2 mL離心管中加入1 μL植物總DNA樣品和5 μL樣品緩沖液，95℃變性3 min后于冰上放置10 min，再向離心管中加入0.2 μL酶和5 μL反應(yīng)緩沖液，在30℃條件下反應(yīng)18 h，65℃滅活10 min，4℃ 10 min，反應(yīng)結(jié)束后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4西番蓮樣品中菜豆金色花葉病毒屬病毒全基因組擴(kuò)增根據(jù)PA/PB引物擴(kuò)增、克隆及測(cè)序后所得序列設(shè)計(jì)病毒全長(zhǎng)引物PaLCuGdV-F/-R和EuLCuV-F/-R（表1）分別對(duì)PaLCuGdV和EuLCuV的全基因組序列進(jìn)行擴(kuò)增，分別以含有PaLCuGdV和EuLCuV全基因組的重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照，以健康西番蓮樣品為陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增體系：2×PCR 反應(yīng)緩沖液（含 Mg2+）25 μL，dNTPs（2 mmol/L）10 μL，F(xiàn)/R引物（20 μmol/L）各1 μL，KOD FX DNA 聚合酶（1 U/μL）1 μL，RCA 產(chǎn)物 0.5 μL，加超純水定容至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性2 min;98℃變性10 s，49℃退火30 s，68℃延伸 3 min，32個(gè)循環(huán);68℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒純化回收目標(biāo)條帶，利用pEASY-Blunt Zero Cloning Kit與載體進(jìn)行連接，42℃熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中后進(jìn)行涂板，倒置培養(yǎng)12 h，挑取陽性克隆，送華大基因測(cè)序。

1.2.5數(shù)據(jù)分析

首先，通過NCBI中的BLAST（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.）進(jìn)行基因序列相似性初步比較，其次，采用DNAStar Lasergene V 7.1（Madison，Wis.，USA）軟件進(jìn)一步比較基因序列相似性，并尋找基因組序列中的開放閱讀框;使用MEGA6中的鄰近法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹［25］，進(jìn)化樹的可信度使用1 000次自導(dǎo)復(fù)制驗(yàn)證;采用Recombination Detection Program（RDP）V.4.56［26］的默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行序列的重組分析。

2結(jié)果與分析

2.1西番蓮病樣中菜豆金色花葉病毒屬病毒檢測(cè)用菜豆金色花葉病毒屬病毒通用引物PA/PB（表1）分別對(duì)4個(gè)西番蓮樣品YN7292、YN7293、YN7294和YN7295進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果4個(gè)樣品均擴(kuò)增到片段長(zhǎng)度約為500 bp的目的條帶（圖2）。通過測(cè)序獲得4條序列，分別命名為YN7292-1、YN7293-3、YN7294-2和YN7295-5，將所獲得的核苷酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，YN7293-3與廣東番木瓜曲葉病毒各分離物的核苷酸序列相似性在82.91%～95.22%之間，YN7292-1、YN7294-2和YN7295-5與一品紅曲葉病毒各分離物的核苷酸序列相似性在83.1%～97.6%之間。因此，推測(cè)西番蓮樣品YN7292、YN7293、YN7294和YN7295均受菜豆金色花葉病毒屬病毒侵染。

2.2西番蓮病樣中beta和alpha衛(wèi)星分子檢測(cè)應(yīng)用菜豆金色花葉病毒屬病毒伴隨性衛(wèi)星分子beta和alpha特異性引物β01/β02和UNA101/UNA102（表1）對(duì)西番蓮樣品YN7292、YN7293、YN7294和YN7295進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4個(gè)西番蓮樣品中均未檢測(cè)到beta和alpha衛(wèi)星分子（圖3）。2.3西番蓮病樣中菜豆金色花葉病毒屬病毒全基因組結(jié)構(gòu)分析用一品紅曲葉病毒全長(zhǎng)特異引物EuLCuV-F/-R對(duì)YN7292、YN7293、YN7294和YN7295進(jìn)行擴(kuò)增，4個(gè)樣品均擴(kuò)增到片段長(zhǎng)度約為2 800 bp的目標(biāo)條帶（圖4a）。通過回收、克隆及測(cè)序，共獲得4條序列，分別命名為YN7292-6、YN7293-12、YN7294-16以及YN7295-25。應(yīng)用廣東番木瓜曲葉病毒全長(zhǎng)特異引物PaLCuGdV-F/-R對(duì)4個(gè)西番蓮樣品進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果僅在YN7293中擴(kuò)增到片段長(zhǎng)度約為2 800 bp的目標(biāo)條帶（圖4b）。通過回收、克隆及測(cè)序獲得1條序列，命名為YN7293-4。

通過SDT比對(duì)發(fā)現(xiàn)，YN7292-6、YN7293-12以及YN7295-25與江西西番蓮EuLCuV分離物GNPF1（GenBank登錄號(hào)：MK673114.1）核苷酸序列相似性最高，在99.05%～99.78%之間;YN7294-16與中國(guó)臺(tái)灣西番蓮EuLCuV分離物PF1（GenBank登錄號(hào)：KC161185.1）的核苷酸序列相似性最高，為99.42%;而YN7293-4則與韓國(guó)西番蓮PaLCuGdV分離物JN17-PF10（GenBank登錄號(hào)：MK070462.1）的核苷酸序列相似性最高，為99.70%（圖5）。根據(jù)ICTV對(duì)菜豆金色花葉病毒屬病毒的分類標(biāo)準(zhǔn)，病毒全基因組DNA-A核苷酸序列相似性大于91%則為同一種病毒，小于91%則為不同種病毒［3］，因此，西番蓮中獲得的YN7292-6、YN7293-12、YN7294-16以及YN7295-25 4條序列均為EuLCuV的不同分離物，分別命名為EuLCuV-YN7292-6、EuLCuV-YN7293-12、EuLCuV-YN7294-16、EuLCuV-YN7295-25;而YN7293-4則為PaLCuGdV的一個(gè)分離物，命名為PaLCuGdV-YN7293-4（圖5）。

本研究所獲得的菜豆金色花葉病毒屬病毒不同分離物全基因組序列均具有典型的單組分菜豆金色花葉病毒屬病毒基因組結(jié)構(gòu)，全基因組共編碼7個(gè)開放閱讀框，正義鏈編碼V1和V2蛋白，負(fù)義鏈編碼C1、C2、C3、C4和C5蛋白，以及一個(gè)包含菜豆金色花葉病毒屬病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄必需的各種元件的基因間隔區(qū)（intergenic region， IR）。將所獲序列在NCBI上進(jìn)行登錄注釋，獲得的登錄號(hào)見表2。

2.4西番蓮病樣中菜豆金色花葉病毒屬病毒全基因組相似性比較在西番蓮樣品YN7292、YN7294和YN7295中僅檢測(cè)出一品紅曲葉病毒，而在YN7293樣品中同時(shí)檢測(cè)出一品紅曲葉病毒和廣東番木瓜曲葉病毒，為2種病毒復(fù)合侵染，故選取YN7293樣品的PaLCuGdV-YN7293-4和EuLCuV-YN7293-12序列進(jìn)行相似性分析。

PaLCuGdV-YN7293-4分離物編碼區(qū)和非編碼區(qū)與PaLCuGdV不同分離物相似性較高，其中全長(zhǎng)基因組核苷酸序列與韓國(guó)西番蓮PaLCuGdV分離物JN17-PF10（GenBank登錄號(hào)：MK070462.1）的相似性最高（99.7%），IR區(qū)和V1與中國(guó)臺(tái)灣西番蓮PaLCuGdV分離物BXG4（GenBank登錄號(hào)：KP876482.1）的相似性最高（99.4%和99.5%），V2、C1、C2、C3和C4與韓國(guó)西番蓮PaLCuGdV分離物JN17-PF10（GenBank登錄號(hào)：MK070462.1）的相似性最高（表3）。

EuLCuV-YN7293-12分離物編碼區(qū)和非編碼區(qū)與EuLCuV不同分離物相似性較高，其中全長(zhǎng)基因組核苷酸序列與江西EuLCuV分離物GNPF1（GenBank登錄號(hào)：MK673114.1）的相似性最高（99.8%）;IR區(qū)與江西EuLCuV分離物GNPF1和中國(guó)臺(tái)灣EuLCuV分離物PF1（GenBank登錄號(hào)：KC161185.1）的相似性均最高（均為99.7%）;V1和V2與韓國(guó)西番蓮EuLCuV分離物DY15-3（GenBank登錄號(hào)：MG257894.1）的相似性最高（均為100%）;C1、C2、C3和C4均分別與PF1和DY15-3的核苷酸相似性最高（99.5%以上）（表4）。

2.5西番蓮病樣中菜豆金色花葉病毒屬病毒系統(tǒng)進(jìn)化分析將PaLCuGdV-YN7293-4分離物與其他菜豆金色花葉病毒屬病毒不同分離物進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，PaLCuGdV-YN7293-4與PaLCuGdV的不同分離物聚為一個(gè)大的分支，其中又與韓國(guó)PaLCuGdV分離物形成一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化分支，表明云南西番蓮病樣中分離到的PaLCuGdV分離物與韓國(guó)分離物親緣關(guān)系較近，而與中國(guó)或其他國(guó)家的PaLCuGdV不同分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖6），同時(shí)也表明PaLCuGdV的進(jìn)化與地理來源具有明顯相關(guān)關(guān)系。

將EuLCuV-YN7293-12分離物與其他菜豆金色花葉病毒屬病毒進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，EuLCuV-YN7293-12與EuLCuV的不同分離物聚為一個(gè)大的分支，與江西西番蓮分離物GNPF1（GenBank登錄號(hào)：MK673114.1）和韓國(guó)不同分離物聚于一個(gè)小的分支，表明EuLCuV-YN7293-12與中國(guó)分離物和部分韓國(guó)分離物親緣關(guān)系較近，同時(shí)也表明EuLCuV的進(jìn)化與地理來源無明顯關(guān)系（圖7）。

2.6西番蓮中菜豆金色花葉病毒屬病毒重組分析

用RDP軟件中的9種重組檢測(cè)方法對(duì)PaLCuGdV-YN7293-4和EuLCuV-YN7293-12兩個(gè)分離物進(jìn)行重組分析表明，2個(gè)分離物均存在重組事件。

EuLCuV-YN7293-12發(fā)生重組的位置位在523-946 nt之間，位于病毒基因組的V1區(qū);其主要親本未知，但極有可能為ToLCKaV-Dapoli（GenBank登錄號(hào)：MH577031.1），次要親本為CaYMV-DR-151（GenBank登錄號(hào)：NC_025964.1）（RDP值：5.862×10-8，GENECONV值：1.647×10-9，BootScan值：7.422×10-8，MaxChi值：2.547×10-5，Chimaera值：1.994×10-6，SiScan值：7.607×10-20，3Seq值：4.035×10-2）（圖8）。

PaLCuGdV-YN7293-4發(fā)生重組的位置位在90-1 116 nt之間，位于病毒基因組的V1和V2區(qū);其主要親本為TYLCThV-Y72（GenBank登錄號(hào)：AJ495812），次要親本為PaLCuCNV-G22（GenBank登錄號(hào)：AJ704604）（RDP值：9.559×10-3，BootScan值：3.213×10-4，MaxChi值：2.171×10-5，Chimaera值：1.556×10-5，SiScan值：1.309×10-12，3Seq值：6.264×10-3）（圖8）。

3結(jié)論與討論

近年來，隨著國(guó)內(nèi)西番蓮種植規(guī)模和范圍的不斷擴(kuò)大，西番蓮病毒病在全國(guó)呈現(xiàn)不斷蔓延趨勢(shì)，廣西、廣東、貴州、福建、臺(tái)灣等西番蓮種植區(qū)均有西番蓮病毒病的報(bào)道［1819， 2728］。本研究對(duì)采集自云南省德宏州的4個(gè)西番蓮樣品進(jìn)行病毒種類鑒定。通過PCR擴(kuò)增、克隆及測(cè)序獲得了5條菜豆金色花葉病毒屬病毒全長(zhǎng)序列，通過序列分析后發(fā)現(xiàn)，侵染云南省德宏州西番蓮的菜豆金色花葉病毒屬病毒分別為圖6基于PaLCuGdV-YN7293-4與其他菜豆金色花葉病毒屬病毒全長(zhǎng)核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

廣東番木瓜曲葉病毒和一品紅曲葉病毒，其中西番蓮樣品YN7293為2種病毒復(fù)合侵染，并進(jìn)一步分析了2種病毒全基因組結(jié)構(gòu)特征和進(jìn)化重組關(guān)系。

一品紅曲葉病毒和廣東番木瓜曲葉病毒均屬于菜豆金色花葉病毒屬病毒，其中一品紅曲葉病毒于2004年首次在廣西報(bào)道［29］，之后我國(guó)臺(tái)灣和山東也相繼在西番蓮和一品紅上發(fā)現(xiàn)一品紅曲葉病毒［18，30］，該病毒除在我國(guó)發(fā)生外，目前僅在韓國(guó)有報(bào)道［31］。一品紅曲葉病毒可以侵染的寄主植物主要有西番蓮（GenBank登錄號(hào)：KT259282.1）、一品紅Euphorbia pulcherrima［30］、勝紅薊Ageratum conyzoides（GenBank登錄號(hào)：AJ811911.1）等。廣東番木瓜曲葉病毒僅在中國(guó)的雞蛋果Passiflora edulis［18］、韓國(guó)的燈籠椒［32］和菲律賓的賽山藍(lán)Ruellia blechum（GenBank登錄號(hào)：KF446660.1）有報(bào)道，在GenBank上有記錄的寄主還包括番木瓜（NC_005844.1）、洋桔梗Eustoma grandiflorum（LC089766.1）、西番蓮（KP876482.1）、煙草Nicotiana tabacum（FJ869907.1）和一品紅（FJ495184.1）。與番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus， TYLCV）相比，一品紅曲葉病毒和廣東番木瓜曲葉病毒報(bào)道的寄主范圍并不廣泛，下一步可對(duì)這2種病毒的寄主范圍進(jìn)行鑒定。

本研究在云南省德宏州芒市的西番蓮樣品中檢測(cè)到EuLCuV和PaLCuGdV，獲得的PaLCuGdV分離物與韓國(guó)的不同分離物相似性較高，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系也較近;而EuLCuV的進(jìn)化關(guān)系較為復(fù)雜，沒有明顯的地理分布特征，但云南西番蓮EuLCuV分離物除了與我國(guó)EuLCuV廣州分離物聚于一個(gè)小的分支，還與很多韓國(guó)EuLCuV分離物聚于一個(gè)大的分支，親緣關(guān)系也較近，因此云南西番蓮病樣中2種病毒的分離物均有可能來源于韓國(guó)。

重組是雙生病毒科病毒進(jìn)化的主要?jiǎng)恿?，重組后的病毒不但能夠擴(kuò)大其寄主范圍還能使寄主癥狀加重，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［3336］。如印度木薯曲葉病是由斯里蘭卡木薯花葉病毒（Sri Lankan cassava mosaic virus， SLCMV）和印度木薯花葉病毒（Indian cassava mosaic virus， ICMV）為主的菜豆金色花葉病毒屬不同病毒引起的病害，而不同病毒的復(fù)合侵染使當(dāng)?shù)夭煌N病毒之間出現(xiàn)重組并產(chǎn)生了致病性更強(qiáng)的毒株，從而對(duì)當(dāng)?shù)啬臼碓斐筛鼮閲?yán)重的危害［36］;而在西班牙，重組病毒馬拉加番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl Málaga virus）不僅在茄科植物番茄中檢測(cè)出，還能在豆科植物菜豆中檢測(cè)出，甚至檢出率更高，說明該病毒重組后寄主范圍在擴(kuò)大［37］。本研究對(duì)4個(gè)西番蓮樣品進(jìn)行病毒全序列擴(kuò)增時(shí)發(fā)現(xiàn)，YN7293樣品是由PaLCuGdV和EuLCuV 2種病毒復(fù)合侵染的，并且通過重組分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)分離物均不同程度存在重組事件。我國(guó)廣西、福建以及臺(tái)灣等地也發(fā)現(xiàn)了西番蓮樣品中PaLCuGdV和EuLCuV復(fù)合侵染，因此需警惕兩種病毒在西番蓮中復(fù)合侵染后產(chǎn)生病毒基因組的交換等變異導(dǎo)致產(chǎn)生致病性更強(qiáng)的病毒種類或株系，從而造成更為嚴(yán)重的危害。針對(duì)西番蓮菜豆金色花葉病毒屬病害發(fā)生危害范圍及程度不斷增加，應(yīng)加強(qiáng)西番蓮不同種植區(qū)種苗繁殖、調(diào)運(yùn)、媒介昆蟲的防治及種植過程中菜豆金色花葉病毒屬病毒的監(jiān)測(cè)，為科學(xué)防控西番蓮病毒病害提供理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）