一株草地貪夜蛾核型多角體病毒新分離物的室內(nèi)毒力測(cè)定與基因組分析

摘要草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda是我國(guó)重要的入侵農(nóng)業(yè)害蟲。草地貪夜蛾核型多角體病毒是專一性感染草地貪夜蛾的病原。本研究于江西省南昌市玉米田分離得到一株多粒包埋型草地貪夜蛾核型多角體病毒分離物，命名為草地貪夜蛾核型多角體病毒江西分離物（SfMNPV_JX），其對(duì)本地草地貪夜蛾幼蟲毒力高，LC50達(dá)到1.634×105 PIB/mL。全基因組測(cè)序表明，SfMNPV_JX基因組全長(zhǎng)134 241 bp，共包含140個(gè)ORF，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，SfMNPV_JX屬于α-桿狀病毒Group Ⅱ，是SfMNPV的一個(gè)分離物，與草地貪夜蛾核型多角體病毒哥倫比亞分離物（SfMNPV_Colombian）最為近似，序列相似性為97.85%。上述研究結(jié)果為研發(fā)綠色高效的草地貪夜蛾生物殺蟲劑提供重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞草地貪夜蛾;核型多角體病毒;基因組測(cè)序;室內(nèi)毒力測(cè)定

中圖分類號(hào)：S 476.13文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023581Laboratory toxicity bioassay and genome sequence analysis of a new field

isolate of Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirusYANG Jian CHEN Junhui GUAN Limei KUANG Wendong LI Jianghuai

WANG Jinchang1，2，ZHAN Zhigao1，2，CHEN Jun2，JIN Liang1*（1. Institute of Biological Resources， Jiangxi Academy of Sciences， Nanchang330096，China;

2. Institute of Microbiology， Jiangxi Academy of Sciences， Nanchang330096， China）AbstractThe fall armyworm， Spodoptera frugiperda， is a major agricultural pest invading China. Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus （SfMNPV） is a specific pathogen targeting this pest. In this study， we isolated a new strain of multiple embedded SfMNPV from Nanchang， Jiangxi province， named SfMNPV_JX. Toxicity assay demonstrated that it exhibited high bioactivity against local fall armyworm larvae， with LC50 of 1.634×105 PIB/mL. The genome of SfMNPV_JX was sequenced and assembled， revealing 140 open reading frames （ORFs） and a length of 134 241 bp. Phylogenic analysis classified SfMPV_JX as a Group Ⅱ alpha-baculovirus closely related to Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus isolate Colombian （SfMNPV_Colombian）， sharing 97.85% sequence identity. This study provides foundational data for developing environmentally friendly biopesticides against the invading pest S.frugiperda.

Key wordsSpodoptera frugiperda;nucleopolyhedrovirus;genome sequencing;laboratory toxicity bioassay草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda又稱秋黏蟲，是鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae灰翅夜蛾屬Spodoptera的一種入侵害蟲，為害玉米、水稻、高粱、棉花等多種重要農(nóng)作物［1］。該蟲繁殖力強(qiáng)、遷徙力強(qiáng)、205e81227dee976d46bed0efef17415b7dda6d24f9e5a6c24cc331e93f8736a5食性雜、生活周期短且無滯育特性，成蟲在夜間活動(dòng)，幼蟲以新葉為食［2］。草地貪夜蛾原產(chǎn)于美洲熱帶及亞熱帶地區(qū)，該蟲2016年傳入非洲、亞洲各國(guó)，于2019年傳入中國(guó)，隨后迅速蔓延并在各地逐漸形成地理種群［3］，截至2019年7月底，全國(guó)20省、市、區(qū)，1 000多個(gè)縣市發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾，約有13 340 hm2玉米以及超過6百萬hm2的草原受到威脅，嚴(yán)重危害我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與糧食安全［4］。2020年9月，草地貪夜蛾被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為《一類農(nóng)作物病蟲害名錄》之首［5］。

目前草地貪夜蛾的防治主要以物理防治以及化學(xué)防治為主［6］。物理防治主要有雷達(dá)監(jiān)測(cè)、燈光誘殺以及人工捕殺等，其成本較高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力;化學(xué)防治是目前主要的應(yīng)急防控手段，用量較大的化學(xué)藥劑有茚蟲威、氯蟲苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯、蟲螨腈等化學(xué)農(nóng)藥以及蘇云金芽胞桿菌及其復(fù)配制劑等。化學(xué)防治雖然見效快，但長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生抗藥性且可能污染環(huán)境、殺傷天敵、降低農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)［7］。要實(shí)現(xiàn)對(duì)草地貪夜蛾長(zhǎng)期有效的控制，需要開發(fā)高效無污染綠色環(huán)保的生物農(nóng)藥。以桿狀病毒為代表的昆蟲病毒具有殺蟲活性高、害蟲不易產(chǎn)生抗性、能夠引起害蟲種群流行病等優(yōu)點(diǎn)，是綠色防控入侵害蟲的有效手段。草地貪夜蛾幼蟲易感染草地貪夜蛾核型多角體病毒（Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus， SfMNPV）［8］，田間試驗(yàn)證明SfMNPV能夠用于田間草地貪夜蛾的防治［9］。雖然目前在美國(guó)、哥倫比亞、阿根廷、尼加拉瓜等地已分離得到了多個(gè)SfMNPV分離物，但這些分離物對(duì)草地貪夜蛾的毒力以及感染宿主后的表型差異較大［1013］，如SfMNPV-6nd不能導(dǎo)致宿主液化，但其LC50與SfMNPV-19差異并不顯著，其半數(shù)致死時(shí)間（LT50）要高于SfMNPV-19［13］;Lei等通過室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾核型多角體病毒湖北分離物SfMNPV-Hub對(duì)本地草地貪夜蛾具有良好的防治效果［4］。我國(guó)境內(nèi)不同地理種群的草地貪夜蛾幼蟲對(duì)SfMNPV的敏感性不同，廣西種群對(duì)SfMNPV敏感性最低，西藏種群的敏感性最高，云南和廣東種群為一般敏感［3］。由于草地貪夜蛾已在我國(guó)形成不同的地理種群，且不同地理種群對(duì)草地貪夜蛾核型多角體病毒的敏感性存在差異，因而發(fā)掘適宜防控本地草地貪夜蛾種群的病毒資源對(duì)于草地貪夜蛾的綠色防控尤為重要。

本研究從江西省南昌市進(jìn)賢縣玉米地草地貪夜蛾蟲尸中分離得到一種昆蟲病毒，通過形態(tài)學(xué)及系統(tǒng)發(fā)育分析確定其分類地位，通過室內(nèi)毒力測(cè)定確定其對(duì)草地貪夜蛾的活性，旨在為本地草地貪夜蛾的防治以及綠色高效草地貪夜蛾生物殺蟲劑的研發(fā)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試?yán)ハx

草地貪夜蛾幼蟲采集于江西省南昌市進(jìn)賢縣玉米田（116°10′E， 28°43′N）。采集的幼蟲置于塑料保鮮盒（340 mm×220 mm×160 mm）中，以人工飼料飼養(yǎng)。保鮮盒置于光照培養(yǎng)箱中，（28±1）℃，相對(duì)濕度（75±5）%，光周期L∥D=16 h∥8 h條件下飼養(yǎng)至化蛹。蛹置于鋪有蛭石的塑料保鮮盒中，即將羽化時(shí)將成蟲轉(zhuǎn)移至養(yǎng)蟲籠（30 cm×30 cm×30 cm）中產(chǎn)卵，養(yǎng)蟲籠四壁鋪以蠟紙。所收集的卵以4%甲醛溶液浸泡15 min，隨后用雙蒸水沖洗3次，自然晾干后置于人工飼料上，孵化后飼養(yǎng)至2齡末作為室內(nèi)生測(cè)供試?yán)ハx。

1.2供試病毒

草地貪夜蛾核型多角體病毒青島分離物（Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus isolate Qingdao， SfMNPV_QD）蟲尸樣品由福建農(nóng)林大學(xué)徐瑞斌博士提供，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)該病毒進(jìn)行了分離純化;草地貪夜蛾核型多角體病毒江西分離物（Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus isolate Jiangxi， SfMNPV_JX）由本實(shí)驗(yàn)室于2020年6月在江西省南昌市進(jìn)賢縣玉米田中疑似病毒感染死亡的草地貪夜蛾幼蟲中分離并純化。

1.3病毒的分離、純化及鑒定

將野外采集疑似病毒感染死亡的草地貪夜蛾幼蟲蟲尸用0.02 mol/L pH 7.2的PBS浸泡10 min，渦旋1 min后用3層紗布過濾，濾液800 g離心5 min，取上清;再以4 000 g離心15 min棄去上清，用0.02 mol/L pH 7.2的PBS重懸，重復(fù)10次。隨后參照Lei等［4］的方法，利用蟲體克隆技術(shù)獲得單一型的病毒。具體方法如下：將收集到的病毒稀釋為1×106、1×105、1×104、1×103 PIB/mL和1×102 PIB/mL，以0.02 mol/L pH 7.2的PBS為對(duì)照，將病毒稀釋液與終濃度為4%的蔗糖溶液混合，每個(gè)濃度飼喂48頭草地貪夜蛾4齡幼蟲，讓幼蟲自由取食10 min，隨后將試蟲轉(zhuǎn)移至28℃，光周期L∥D=16 h∥8 h條件下正常飼養(yǎng)，記錄試蟲死亡情況，直至所有試蟲死亡或化蛹。以SPSS 20.0軟件的Probit進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算草地貪夜蛾死亡率為5%時(shí)的病毒濃度。以該濃度飼喂草地貪夜蛾4齡幼蟲，收集單頭死亡蟲體重復(fù)前述步驟獲得純化多角體病毒。采取血球計(jì)數(shù)法對(duì)病毒濃度進(jìn)行測(cè)定。提取病毒基因組后，采用lef-8、lef-9、polh等3個(gè)基因的引物［4］檢測(cè)所得病毒種類。

1.4SfMNPV病毒的增殖

將分離純化后的SfMNPV_JX和SfMNPV_QD用0.02 mol/L pH 7.2的PBS稀釋至1×106 PIB/mL，用塑料噴壺噴灑在自制草地貪夜蛾人工飼料上，陰干后切為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小方塊置于24孔板中，放入健康草_{E7WLlSv4dMeUxLM7RS75NSqnCXJKfPgcp2wMrIpkg3I=}地貪夜蛾2齡幼蟲，每孔1頭，共1 000頭;28℃，光周期L∥D=16 h∥8 h條件下飼養(yǎng)至幼蟲全部死亡。每日觀察，及時(shí)更換飼料，收集草地貪夜蛾幼蟲蟲尸。按1.3的方法分離病毒，并用血球計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。獲得的病毒溶液用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5SfMNPV病毒的室內(nèi)生測(cè)

參照Droplet法［14］于室內(nèi)測(cè)定SfMPV_JX以及SfMNPV_QD對(duì)草地貪夜蛾幼蟲的毒力。取足量草地貪夜蛾2齡幼蟲，饑餓8 h;將SfMNPV_JX以及SfMNPV_QD稀釋為1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103 PIB/mL 6個(gè)濃度，分別與終濃度4%的蔗糖混合作為病毒感染液，將感染液逐滴加入培養(yǎng)皿中，使草地貪夜蛾2齡幼蟲自由取食10 min;隨后將幼蟲轉(zhuǎn)移至含有人工飼料的24孔板中，每孔1頭幼蟲，置于28℃，光周期L∥D=16 h∥8 h條件下飼養(yǎng)，每個(gè)濃度挑選48頭幼蟲記錄試蟲死亡情況，直至所有試蟲死亡或化蛹。以0.02 mol/L pH 7.2的PBS混合4%蔗糖的溶液喂飼作為對(duì)照，室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn)重復(fù)3次，使用Polo Plus v 0.03軟件計(jì)算SfMNPV_JX和SfMNPV_QD的致死中濃度（LC50）、活性比以及LC50和活性比的95%置信限。

1.6SfMNPV_JX的電鏡觀察

掃描電鏡樣品制備：以0.02 mol/L pH 7.2的PBS重懸純化的多角體病毒，取少量多角體病毒懸液以2% 磷鎢酸（pH 10.6）負(fù)染3 min，滴加于400目銅網(wǎng)Fomnvar膜上，用濾紙從銅網(wǎng)邊輕輕吸去多余的負(fù)染液，隨后以掃描電子顯微鏡（SU8010，Hitachi，Tokyo，Japan）以10 kV加速電壓觀察并拍照。

透射電鏡樣品制備：取純化的病毒加入2.5%戊二醛-0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2），4℃固定后以0.02 mol/L pH 7.2的PBS洗滌3次，每次15 min。1%鋨酸室溫固定3 h。用0.02 mol/L pH 7.2的PBS洗滌3次。用30%～100%系列濃度的乙醇脫水后以丙酮浸泡15 min，再泡入丙酮∶包埋劑812=1∶1的混合液中，置于37℃烘箱中5～6 h。以樹脂包埋樣品并切片，醋酸鈾染色后用Hitachi H-800透射電子顯微鏡（Hitachi Co.，Ltd.，Tokyo，Japan）在200 kV的加速電壓下觀察并拍照。

1.7SfMNPV_JX基因組的提取

取200 μL濃度為1.0×109 PIB/mL的病毒懸液于離心管中，加入100 μL 3×DAS裂解液（0.1 mol/L Na2CO3，0.5 mol/L NaCl，0.01 mol/L EDTA，pH 10.9），混勻后37℃水浴30 min，加入200 μL Tris-HCl（pH 6.8）緩沖液，10 000 g離心8 min，取上清液加入終濃度為100 μg/mL的蛋白酶K和2%的SDS，65℃水浴2 h，冷卻至室溫后，加入等體積 Tris飽和苯酚混合均勻，10 000 g離心5 min，取上清加入等體積苯酚∶氯仿（1∶1）混合均勻，10 000 g 離心 5 min，取上清加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1）混合均勻，10 000 g 離心 5 min，取上清用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.8SfMNPV_JX基因組測(cè)序

SfMNPV_JX基因組的測(cè)序委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成。采用全基因組鳥槍法（whole genome shotgun，WGS）策略，構(gòu)建400 bp不同插入片段的文庫(kù)，利用第二代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS），基于Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)，對(duì)這些文庫(kù)進(jìn)行雙末端（paired-end，PE）測(cè)序，拼裝后得到最終的病毒基因組序列。

1.9SfMNPV_JX的系統(tǒng)發(fā)育分析

用MEGA 7對(duì)SfMNPV_JX基因組中polh、lef-8及l(fā)ef-9基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中桿狀病毒（表1）的polh、lef-8及l(fā)ef-9 3個(gè)基因序列進(jìn)行比對(duì)，用PhyML-3.1和FigTree v 1.4.2基于General Time Reversible模型以最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹［15］。polh、lef-8及l(fā)ef-9 3個(gè)基因之間的遺傳距離用MEGA 7軟件的Kimura 2-parameter distances（K2P）模型進(jìn)行計(jì)算。2結(jié)果與分析

2.1SfMNPV_JX的發(fā)現(xiàn)與病毒形態(tài)

在江西省南昌市進(jìn)賢縣玉米田中發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾幼蟲為害，幼蟲頭部具有倒“Y”形紋，腹部末節(jié)有呈方形排列的4個(gè)黑斑（圖1a），同時(shí)發(fā)現(xiàn)有部分草地貪夜蛾蟲尸，蟲體呈黑褐色，表皮易破，體內(nèi)組織液化，有濃稠褐色液體流出（圖1b），初步判斷為病毒感染致死。從疑似病毒感染致死的蟲體中分離純化獲得多角體病毒。由于在田間采集的蟲尸通?；煊衅渌《荆瑸闇p少干擾，采用蟲體克隆技術(shù)獲得單一種類的桿狀病毒［4］。純化的病毒濃度為8.52×108 PIB/mL。通過計(jì)算，該病毒的LC5為9.089×102 PIB/mL。以該濃度病毒飼喂220頭草地貪夜蛾4齡幼蟲，共有9頭草地貪夜蛾幼蟲死亡，死亡率為4.09%，在該濃度下大多數(shù)感染是由單個(gè)病毒引起的。單頭收集死亡蟲體分別研磨純化獲得多角體病毒，提取病毒基因組后采用lef-8、lef-9、polh 3個(gè)基因的引物分別擴(kuò)增出約800、250、500 bp條帶，與已知草地貪夜蛾核型多角體病毒擴(kuò)增出的條帶相符。通過測(cè)序并與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，9頭草地貪夜蛾幼蟲中所得基因組均為草地貪夜蛾核型多角體病毒（Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus， SfMNPV）。

以草地貪夜蛾4齡幼蟲為寄主孵育病毒，將感染病毒致死的蟲體研磨分離純化獲得多角體病毒，對(duì)多角體病毒進(jìn)行掃描電鏡與透射電鏡觀察（圖1c和圖1d），掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)多角體病毒呈五邊形至近圓形的不規(guī)則多面體，多角體病毒直徑為（1.34±0.35） μm（n=30）。透射電鏡觀察可見多角體病毒內(nèi)部包埋多個(gè)多粒包埋型病毒粒子，具有典型的核型多角體病毒特征。根據(jù)發(fā)現(xiàn)地以及宿主昆蟲，將該病毒命名為草地貪夜蛾核型多角體病毒江西分離物（Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus isolate Jiangxi， SfMNPV_JX）。

2.2SfMNPV_JX的室內(nèi)生測(cè)結(jié)果

增殖后獲得的SfMNPV_JX和SfMNPV_QD的濃度分別為9.34×108 PIB/mL和6.53×108 PIB/mL，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行稀釋，以1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103 PIB/mL 6個(gè)濃度的SfMNPV_QD與SfMNPV_JX飼喂草地貪夜蛾幼蟲，室內(nèi)生測(cè)結(jié)果表明，隨著2種病毒濃度升高，與對(duì)照組相比，草地貪夜蛾幼蟲存活率均明顯下降（圖2a和圖2b）。計(jì)算得到SfMNPV_JX的LC50為1.634×105 PIB/mL（表2），而SfMNPV_QD的LC50為2.935×106 PIB/mL（表2），顯著高于SfMNPV_JX，因此本地病毒株SfMNPV_JX比非本地病毒株SfMNPV_QD更適于本地草地貪夜蛾的防控。

2.3SfMNPV_JX全基因組序列分析與系統(tǒng)發(fā)育分析SfMNPV_JX全基因組序列已上傳國(guó)家基因庫(kù)大數(shù)據(jù)平臺(tái)（https：∥db.cngb.org/），基因組序列登錄號(hào)為CNP0004435。全基因組測(cè)序表明，SfMNPV_JX全基因組序列全長(zhǎng)134 241 bp，GC含量40.33%，包含140個(gè)ORF（表3與圖3）。按照桿狀病毒基因組注釋慣例，將polyhedrin基因的ORF定義為第一個(gè)ORF，其第一個(gè)堿基定義為位置1，其他ORF，與polyhedrin的轉(zhuǎn)錄方向一致者為正鏈，相反者為負(fù)鏈，按順序?qū)fMNPV_JX基因組基因的ORF進(jìn)行編號(hào)，其中75個(gè)ORF為正鏈，65個(gè)ORF為負(fù)鏈（表3）;選擇SfMNPV_JX以及其他桿狀病毒polh、lef-8及l(fā)ef-9基因串聯(lián)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（表3，圖4），表明SfMNPV_JX屬于α-桿狀病毒Group Ⅱ。將SfMNPV_JX基因組預(yù)測(cè)的ORF與SfMNPV_Colombian、SfMNPV_19、AcMNPV_C6、HearMNPV以及MabrMNPV_CHb1基因組中相應(yīng)同源基因進(jìn)行比較（表3），發(fā)現(xiàn)SfMNPV_JX與AcMNPV_C6、HearMNPV以及MabrMNPV_CHb1的同源性低于其與SfMNPV_Colombian和SfMNPV_19的同源性。同時(shí)將SfMNPV_JX與SfMNPV_Colombian、SfMNPV_19、SeMNPV_G24、SperNPV與SpexNPV進(jìn)行等位基因分析（圖5）。結(jié)果表明SfMNPV_JX與SfMNPV_Colombian線性關(guān)系最強(qiáng)，基因組結(jié)構(gòu)也最為相似，基因組相似性為97.85%。雖然SfMNPV_JX基因組雖然與SfMNPV_19基因組相似性也較高，達(dá)到95.25%，但SfMNPV_JX基因組ORF68至ORF88排列順序與SfMNPV_19基因組相應(yīng)的ORF68至ORF96區(qū)域排列順序相反（圖5）。

根據(jù)Wennmann等提出的桿狀病毒物種劃分標(biāo)準(zhǔn)［16］，若兩株桿狀病毒的polh、lef-8及l(fā)ef-9基因串聯(lián)序列的K2P距離小于0.015，可認(rèn)為這兩株桿狀病毒屬于同一種。為進(jìn)一步明確SfMNPV_JX的分類地位，以SfMNPV_JX和其他SfMNPV分離物的polh、lef-8及l(fā)ef-9基因串聯(lián)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并計(jì)算K2P距離。結(jié)果表明，SfMNPV_JX與其他SfMNPV分離物的K2P距離均小于0.015（表4），證明SfMNPV_JX屬于SfMNPV的一個(gè)分離物;與其他SfMNPV分離物相比，SfMNPV_JX與SfMNPV_Colombian的K2P距離最小，具有最近的親緣關(guān)系（圖6與表4）。但SfMNPV_Colombian的5個(gè)ORF：ORF5、ORF6、ORF7、ORF12以及ORF48在SfMNPV_JX未找到對(duì)應(yīng)的同源基因，而SfMNPV_JX的ORF5、ORF81、ORF83在SfMNPV_Colombian中未找到同源基因。SfMNPV_Colombian的ORF5長(zhǎng)度為171 bp，ORF6長(zhǎng)度為345 bp，ORF7長(zhǎng)度為174 bp，ORF12長(zhǎng)度為159 bp，ORF48長(zhǎng)度為309 bp;SfMNPV_JX的ORF5長(zhǎng)度為273 bp，ORF81長(zhǎng)度為102 bp、ORF83長(zhǎng)度為111 bp;SfMNPV_JX的ORF5包含SfMNPV_Colombian的hoar（ORF4）一部分、ORF5全部以及ORF7的一部分（圖7a）;SfMNPV_JX的ORF81在SfMNPV_Colombian的vlf-1（ORF85）與ORF86之間（圖7b）;SfMNPV_JX的ORF83包括SfMNPV_Colombian的vlf-1（ORF86）與p26a（ORF87）之間的部分以及p26a（ORF87）的一部分（圖7b）。此外，在同源基因中，SfMNPV_JX的gp37與其他病毒的相應(yīng)基因相似性低于其他同源基因。

3結(jié)論與討論

SfMNPV作為專一性感染草地貪夜蛾的桿狀病毒，具有對(duì)環(huán)境無毒無害、持續(xù)感染效果好、易造成害蟲流行病、不傷害天敵、對(duì)脊椎動(dòng)物和其他高等動(dòng)物安全等優(yōu)點(diǎn)，適用于草地貪夜蛾的綠色防控。本實(shí)驗(yàn)室從江西省南昌市進(jìn)賢縣玉米田中采集到草地貪夜蛾幼蟲蟲尸，經(jīng)過分離純化以及掃描電鏡和透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)該病毒呈現(xiàn)典型的多粒包埋型核型多角體病毒的特征，并將該病毒命名為草地貪夜蛾核型多角體病毒江西分離物（SfMNPV_JX）。室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn)表明，SfMNPV_JX的LC50為1.634×105 PIB/mL，優(yōu)于非本地草地貪夜蛾核型多角體病毒分離物SfMNPV_QD。以lef-8、lef-9、polh 3個(gè)基因序列串聯(lián)的系統(tǒng)發(fā)育分析表明SfMNPV_JX屬于α-桿狀病毒Group Ⅱ;通過計(jì)算SfMNPV_JX與其他SfMNPV分離物之間的K2P距離以及等位基因分析，發(fā)現(xiàn)SfMNPV_JX與SfMNPV_Colombian最為近似，但有部分開放閱讀框，如ORF5、ORF81以及ORF83存在差異，推測(cè)SfMNPV_JX在進(jìn)化過程中產(chǎn)生變異以適應(yīng)不同地理種群的宿主;此外，SfMNPV_Colombian以及SfMNPV_JX的gp37差異大于其他基因，gp37主要定位于線粒體，含有幾丁質(zhì)結(jié)合域，可以結(jié)合幾丁質(zhì)［1718］，GP37對(duì)于病毒的增殖是非必需的，但是可以促進(jìn)包埋型病毒粒子（occlusion-derived virions， ODV）穿過宿主圍食膜，促進(jìn)口服感染過程［19］。室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn)表明，SfMNPV_JX對(duì)本地草地貪夜蛾具有良好的殺蟲活性，l9S+Vr/SjEk082WNjzzQTw==優(yōu)于SfMNPV_QD，推測(cè)SfMNPV_JX與其他SfMNPV病毒分離物的毒力差異可能與ORF5、ORF81、ORF83以及gp37的差異相關(guān)，其毒力差異的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究獲得了新型草地貪夜蛾核型多角體病毒分離物SfMNPV_JX，并對(duì)該病毒進(jìn)行了全基因組測(cè)序;室內(nèi)生物測(cè)定表明SfMNPV_JX對(duì)于本地草地貪夜蛾具有良好的殺蟲活性，具備開發(fā)為高效草地貪夜蛾病毒殺蟲劑的潛力。本研究為草地貪夜蛾的防治以及綠色高效草地貪夜蛾生物殺蟲劑的研發(fā)提供依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）